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翼首草藥材的檢測(cè)方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供了翼首草藥材的檢測(cè)方法，它是通過(guò)超快速液相色譜法UFLC進(jìn)行測(cè)定的。本發(fā)明UFLC色譜檢測(cè)法，可以有效地將翼首草中化學(xué)成分分離，所得色譜圖中，特征峰多，各批藥材指紋圖譜相似度高，分離度、精密度、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性良好，且色譜檢測(cè)時(shí)間在20min以?xún)?nèi)，檢測(cè)效率高，為檢測(cè)翼首草藥材質(zhì)量提供了新的方法。
【專(zhuān)利說(shuō)明】翼首草藥材的檢測(cè)方法【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及翼首草藥材的檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]翼首草為川續(xù)斷科植物匙葉翼首草Pterocephalus hookeri (C.B.Clarke) H0eck的干燥全草，是一種藏族習(xí)用藥材。具有解毒除瘟、清熱止痢、祛風(fēng)通痹之功效，可治療真布病、瘟毒；現(xiàn)代化學(xué)及藥理研究表明，翼首草中含有齊墩果烷型五環(huán)三萜皂苷類(lèi)、環(huán)烯醚萜苷類(lèi)、生物堿、多糖等化合物，其中環(huán)烯醚萜苷類(lèi)和齊墩果烷型五環(huán)三萜皂苷是其治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(與藏醫(yī)“真布病”相當(dāng))的主要有效成分。
[0003]中藥指紋圖譜是指某種中藥材及其制劑所共有的、具有特征性的某類(lèi)或數(shù)類(lèi)成分的色譜或光譜的圖譜。在現(xiàn)階段，中藥的有效成分絕大多數(shù)沒(méi)有得到明確，指紋圖譜的建立對(duì)于有效控制中藥材的質(zhì)量具有十分重要的意義。對(duì)于翼首草藥材，由于其成分復(fù)雜，具體某幾個(gè)成分不能真正的反應(yīng)藥材的質(zhì)量，而綜合研究指紋圖譜以控制其質(zhì)量還未有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供翼首草藥材的UFLC檢測(cè)方法。
[0005]本發(fā)明提供了翼首草藥材的檢測(cè)方法，它是通過(guò)超快速液相色譜法UFLC進(jìn)行測(cè)定的，包括如下操作步驟:
[0006](I)取待測(cè)翼首草藥材，以甲醇或甲醇水溶液提取，制備供試品溶液；
[0007](2)將供試品溶液注入超快速液相色譜儀中，檢測(cè)即可；其中，色譜條件如下:
[0008]色譜柱:十八烷基鍵合硅膠柱，填料粒徑為1.7~3.5 μ m ;
[0009]檢測(cè)波長(zhǎng):238±5nm;
[0010]流動(dòng)相:流動(dòng)相A為0.2%磷酸水溶液，流動(dòng)相B為乙腈，其梯度程序如下:O — IOmin, 10%— 19% B ；10 — 17min, 19%— 30% B ；17 — 25min,30%— 100% B。
[0011]進(jìn)一步地，步驟(1)所述甲醇水溶液中，甲醇濃度為60~80%v/v，優(yōu)選為70%±2%v/v。
[0012]進(jìn)一步地,所述色譜柱型號(hào)為:4.6 X 100mm, 2.7 μ m。
[0013]優(yōu)選地,所述色譜柱為Agilent proshelll20SB_C18色譜柱。
[0014]進(jìn)一步地，所述流動(dòng)相流速為1.0ml/min。
[0015]進(jìn)一步地,色譜柱柱溫為30°C。
[0016]其中，所述超快速液相色譜法中，以綠原酸、馬錢(qián)苷、獐牙菜苷、吳茱萸苷、大花雙參苷A中的一種或兩種以上的組合物為對(duì)照品，通過(guò)通過(guò)外標(biāo)法或供試品與對(duì)照品指紋圖譜相似度，對(duì)待測(cè)翼首草藥材進(jìn)行檢測(cè)。
[0017]進(jìn)一步地，所述對(duì)照品為綠原酸、馬錢(qián)苷、獐牙菜苷、吳茱萸苷和大花雙參苷A的組合物。[0018]其中，所述超快速液相色譜法中，采用指紋譜圖技術(shù)對(duì)待測(cè)翼首草藥材進(jìn)行檢測(cè)，其具體操作為:將供試品指紋圖譜與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜對(duì)比，計(jì)算相似度；
[0019]所述標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜中，有15個(gè)共有特征峰，它們的相對(duì)保留時(shí)間(以10號(hào)峰吳茱萸苷為參照峰計(jì)算)分別為:0.193,0.235,0.288,0.387,0.401,0.561,0.595,0.892，
0.937，1，1.028，1.132，1.147，1.172，1.205。
[0020]進(jìn)一步地,所述標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜如圖2所示。
[0021]本發(fā)明UFLC色譜檢測(cè)法，可以有效地將翼首草中化學(xué)成分分離，所得色譜圖中，特征峰多，各批藥材指紋圖譜相似度高，分離度、精密度、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性良好，且色譜檢測(cè)時(shí)間在20min以?xún)?nèi)，檢測(cè)效率高，為檢測(cè)翼首草藥材質(zhì)量提供了新的方法。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0022]圖1對(duì)照品圖譜。
[0023]圖2本發(fā)明翼首草藥材的UFLC標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，其中從左到右分別為15個(gè)共有的特征峰
[0024]圖3流動(dòng)相為乙腈:四氫呋喃(99:1)-0.2%磷酸水的色譜圖
[0025]圖4本發(fā)明的21批次翼首草藥材的UFLC指紋圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0026]本發(fā)明所用儀器與試劑如下:
[0027]儀器:LC_20AD XR色譜儀(日本島津公司);CQ_250超聲波清洗器[必能信超聲(上海)有限公司];中藥粉碎機(jī)(浙江省永康市金穗機(jī)械廠(chǎng))；BP211D十萬(wàn)分之一電子天平(德國(guó) Sartorius 公司)。
[0028]試劑:乙腈(色譜純，F(xiàn)isher);磷酸(色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；/jC為超純水；其他試劑均為分析純。
[0029]實(shí)施例1:藏藥翼首草UFLC檢測(cè)方法(外標(biāo)法)
[0030](I)供試品溶液的制備:取翼首草藥材粉末0.5g，精密稱(chēng)定，置于IOOmL錐形瓶中，加入70%甲醇溶液50mL，稱(chēng)定重量，超聲處理(功率:200W，頻率:40kHz)30min，放至室溫，再稱(chēng)定重量，以70%甲醇溶液補(bǔ)足減失重量，經(jīng)0.22 μ m微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。
[0031](2)對(duì)照品溶液的制備:對(duì)照品溶液的制備:分別精密稱(chēng)取綠原酸、馬錢(qián)苷、獐牙菜苷、吳茱萸苷、大花雙參苷A對(duì)照品10mg，加甲醇溶解并定容至25mL，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別精密吸取適量上述對(duì)照品儲(chǔ)備液于同一容量瓶，定容至25mL，配制成質(zhì)量濃度分別為28.20mg/L、22.28mg/L、38.35mg/L、487.00mg/L、31.lOmg/L 的混合對(duì)照品溶液。
[0032](3)精密吸取供試品溶液和對(duì)照品溶液各4μ L，分別注入色譜儀中，在如下色譜條件下進(jìn)行檢測(cè):
[0033]色譜條件:Agilentproshelll20SB_C18 色譜柱，4.6 X 10Omm, 2.7 μ m ;檢測(cè)波長(zhǎng)200?400nm全波長(zhǎng)掃描，流動(dòng)相的流速為1.0ml/min,柱溫為30°C ;流動(dòng)相A為0.2%磷酸水溶液，流動(dòng)相B為乙腈，其梯度程序如下:0?10min，10%— 19% B ; 10?17min，19%—30% B ；17 ?25min,30%— 100% B。
[0034]通過(guò)外標(biāo)法，以對(duì)照品檢測(cè)數(shù)據(jù)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，即計(jì)算出待測(cè)翼首草藥材中各指標(biāo)成分的含量。
[0035]實(shí)施例2:藏藥翼首草UFLC檢測(cè)方法(對(duì)照品指紋圖譜對(duì)照法)
[0036](I)供試品溶液的制備:取翼首草藥材粉末0.5g，精密稱(chēng)定，置于IOOmL錐形瓶中，加入70%甲醇溶液50mL，稱(chēng)定重量，超聲處理(功率:200W，頻率:40kHz)30min，放至室溫，再稱(chēng)定重量，以70%甲醇溶液補(bǔ)足減失重量，經(jīng)0.22 μ m微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。
[0037](2)對(duì)照品溶液的制備:對(duì)照品溶液的制備:分別精密稱(chēng)取綠原酸、馬錢(qián)苷、獐牙菜苷、吳茱萸苷、大花雙參苷A對(duì)照品10mg，加甲醇溶解并定容至25mL，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別精密吸取適量上述對(duì)照品儲(chǔ)備液于同一容量瓶，定容至25mL，配制成質(zhì)量濃度分別為28.20mg/L、22.28mg/L、38.35mg/L、487.00mg/L、31.lOmg/L 的混合對(duì)照品溶液。
[0038](3)精密吸取對(duì)照品溶液4μ L，注入色譜儀中，在如下色譜條件下進(jìn)行檢測(cè)，即得對(duì)照品指紋圖譜，如圖1所示。
[0039]色譜條件:Agilentproshelll20SB_C18 色譜柱，4.6 X 10Omm, 2.7 μ m ;檢測(cè)波長(zhǎng)200?400nm全波長(zhǎng)掃描，流動(dòng)相的流速為1.0ml/min,柱溫為30°C ;流動(dòng)相A為0.2%磷酸水溶液，流動(dòng)相B為乙腈，其梯度程序如下:0?10min，10%— 19% B ; 10?17min，19%—30% B ；17 ?25min,30%— 100% B。
[0040](4)精密吸取供試品溶液4 μ L，注入色譜儀中，按照步驟(3)色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，再將所得供試品指紋圖譜與圖1所示的對(duì)照品指紋圖譜進(jìn)行比較，計(jì)算相似度，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)翼首草藥材的檢測(cè)。
[0041]實(shí)施例3:藏藥翼首草UFLC檢測(cè)方法(標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜對(duì)照法)
[0042](I)供試品溶液的制備:取翼首草藥材粉末0.5g，精密稱(chēng)定，置于IOOmL錐形瓶中，加入70%甲醇溶液50mL，稱(chēng)定重量，超聲處理(功率:200W，頻率:40kHz)30min，放至室溫，再稱(chēng)定重量，以70%甲醇溶液補(bǔ)足減失重量，經(jīng)0.22 μ m微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。
[0043](2)精密吸取供試品溶液4 μ L，注入色譜儀中，在如下色譜條件下進(jìn)行檢測(cè)，再將所得供試品指紋圖譜與圖2所示的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜進(jìn)行比較，計(jì)算相似度，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)翼首草藥材的檢測(cè)。若相似度在0.9以上，則待測(cè)藥材即為合格的翼首草藥材。
[0044]色譜條件:Agilentproshelll20SB_C18 色譜柱，4.6 X 10Omm, 2.7 μ m ;檢測(cè)波長(zhǎng)200?400nm全波長(zhǎng)掃描，流動(dòng)相的流速為1.0ml/min,柱溫為30°C ;流動(dòng)相A為0.2%磷酸水溶液，流動(dòng)相B為乙腈，其梯度程序如下:0?10min，10%— 19% B ; 10?17min，19%—30% B ；17 ?25min,30%— 100% B。
[0045]標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜中，確定了 15個(gè)共有特征峰，其保留時(shí)間分別為:2.590min,
3.154min,3.87Imiη,5.193min,5.393min,7.527min,7.983min,11.992min,12.595min,13.447min,13.818min,15.228min,15.430min,15.757min,16.202mino
[0046]實(shí)施例4流動(dòng)相的篩選試驗(yàn)
[0047]在前期檢測(cè)預(yù)實(shí)驗(yàn)中，分別考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水、乙腈-0.2%磷酸水、乙腈:四氫呋喃(99:1)-0.2%磷酸水流動(dòng)相系統(tǒng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，只有乙腈:四氫呋喃(99:1 )-0.2%磷酸水、乙腈-0.2%磷酸水分離效果較好，但是前者從12.5min開(kāi)始基線(xiàn)漂移(見(jiàn)圖3)，而采用乙腈-0.2%磷酸水溶液系統(tǒng)時(shí)，各峰的分離度較好，基線(xiàn)較平穩(wěn)(見(jiàn)圖2)，有利于指紋圖譜的建立，因此，確定以乙腈-0.2%磷酸水溶液為流動(dòng)相系統(tǒng)。
[0048]實(shí)施例5:翼首草藥材UFLC標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜[0049](I)標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的建立
[0050]取不同來(lái)源的21批翼首草藥材，按實(shí)施例3的條件進(jìn)行檢測(cè)，得到21批樣品的UFLC指紋圖譜，如圖4所示。運(yùn)用國(guó)家藥典委員會(huì)發(fā)布的“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2004A) ”對(duì)上述21批藥材指紋圖譜進(jìn)行分析，提取共有峰生成標(biāo)準(zhǔn)圖譜，共確定了 15個(gè)共有特征峰，以10號(hào)峰即吳茱萸苷為S峰，計(jì)算各共有特征峰與S峰的相對(duì)保留時(shí)間見(jiàn)表1，其相對(duì)保留時(shí)間的RSD值應(yīng)小于5%。
[0051]表121批翼首草藥材的相對(duì)保留時(shí)間
[0052]
【權(quán)利要求】
1.翼首草藥材的檢測(cè)方法，其特征在于:它是通過(guò)超快速液相色譜法UFLC進(jìn)行測(cè)定的，包括如下操作步驟: (1)取待測(cè)翼首草藥材，以甲醇或甲醇水溶液提取，制備供試品溶液； (2)將供試品溶液注入超快速液相色譜儀中，檢測(cè)即可；其中，色譜條件如下: 色譜柱:十八烷基鍵合硅膠柱，填料粒徑為1.7^3.5 μ m ; 檢測(cè)波長(zhǎng):238±5nm; 流動(dòng)相:流動(dòng)相A為0.2 %磷酸水溶液，流動(dòng)相B為乙腈，其梯度程序如下:0—10 min,10%— 19% B ;10 — 17 min, 19%— 30% B ; 17 — 25 min, 30%— 100% B。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于:步驟(1)所述甲醇水溶液中，甲醇濃度為 60~80%v/v，優(yōu)選為 70%±2%v/v。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于:所述色譜柱型號(hào)為:4.6X100 mm,2.7 μ m0
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測(cè)方法,其特征在于:所述色譜柱為Agilentproshell120 SB-C18 色譜柱。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于:所述流動(dòng)相流速為1.0ml/min。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于:色譜柱柱溫為30°C。
7.根據(jù)權(quán)利要求1~6任意一項(xiàng)所述的檢測(cè)方法，其特征在于:所述超快速液相色譜法中，以綠原酸、馬錢(qián)苷、獐牙菜苷、吳茱萸苷、大花雙參苷A中的一種或兩種以上的組合物為對(duì)照品，通過(guò)外標(biāo)法或供試品與對(duì)照品指紋圖譜相似度，對(duì)待測(cè)翼首草藥材進(jìn)行檢測(cè)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測(cè)方法，其特征在于:所述對(duì)照品為綠原酸、馬錢(qián)苷、獐牙菜苷、吳茱萸苷和大花雙參苷A的組合物。
9.根據(jù)權(quán)利要求1~6任意一項(xiàng)所述的檢測(cè)方法，其特征在于:所述超快速液相色譜法中，采用指紋譜圖技術(shù)對(duì)待測(cè)翼首草藥材進(jìn)行檢測(cè)，其具體操作為:將供試品指紋圖譜與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜對(duì)比，計(jì)算相似度； 所述標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜中，有15個(gè)共有特征峰，以吳茱萸苷為參照峰計(jì)算共有特征峰的相對(duì)保留時(shí)間分別為:0.193，0.235，0.288，0.387，0.401，0.561，0.595，0.892，0.937，1， 1.028，1.132，1.147，1.172，1.205。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的檢測(cè)方法，其特征在于:所述標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜如圖2所示。
【文檔編號(hào)】G01N30/02GK103792303SQ201410060399
【公開(kāi)日】2014年5月14日 申請(qǐng)日期:2014年2月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月21日
【發(fā)明者】張藝, 賴(lài)先榮, 高燕 申請(qǐng)人:成都中醫(yī)藥大學(xué)