一種電化學(xué)免疫傳感器及其制備與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種檢測赭曲霉毒素A的電化學(xué)免疫傳感器,包括工作電極、參比電極和對電極,所述工作電極為先在基底電極表面修飾羧基化單壁碳納米管/殼聚糖復(fù)合材料,而后固定赭曲霉毒素A-牛血清白蛋白偶聯(lián)物所得。應(yīng)用本發(fā)明的傳感器對赭曲霉毒素A進(jìn)行檢測,赭曲霉毒素A的濃度在0.01-100ng/ml范圍內(nèi)呈線性關(guān)系,線性方程式為Y=6.3155E-6-2.89458E-6X,相關(guān)系數(shù)為0.99984,最低檢測限為0.004ng/ml。與現(xiàn)有技術(shù)比較,所述傳感器靈敏度高、特異性好、成本低、操作簡便,檢測周期短,適用于實(shí)際樣品的測定等,有望成為具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值的傳感器。
【專利說明】一種電化學(xué)免疫傳感器及其制備與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及電化學(xué)領(lǐng)域,尤其涉及一種電化學(xué)免疫傳感器及其制備與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]赭曲霉毒素是由曲霉菌屬和青霉菌屬幾種菌產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物,具有致畸、致癌、致突變、免疫學(xué)毒性等,國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)將赭曲霉毒素定為2B類致癌物,分為赭曲霉素A、B、C等結(jié)構(gòu)類似的化合物,其中以赭曲霉毒素A(OTA)毒性最大。OTA產(chǎn)生菌廣泛分布于自然界,糧谷類、葡萄及葡萄酒、中草藥、豆制品、啤酒、茶葉等多種農(nóng)作物和食品均可被OTA污染。近年來關(guān)于赭曲霉毒素的危害已引起世界各國的極大關(guān)注,許多國家對其制定了最聞允許量。
[0003]高效液相色譜在最近的OTA國際標(biāo)準(zhǔn)體系中已經(jīng)處于絕對的主導(dǎo)地位,作為定量的檢測方法,在國內(nèi)外實(shí)驗(yàn)室和檢測機(jī)構(gòu)得到普遍的使用。采用高效液相色譜法,或者質(zhì)譜聯(lián)用法對OTA進(jìn)行檢測,雖然具有結(jié)果準(zhǔn)確、回收率高、精密度良好、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn),但是成本高、操作過程復(fù)雜、時(shí)間長,無法滿足現(xiàn)場檢測的需要。
[0004]基于免疫學(xué)原理的酶聯(lián)免疫法檢測OTA具有簡便、快速、靈敏等特點(diǎn),為快速大規(guī)模篩檢提供了極大的幫助。但由于該類方法在檢測復(fù)雜基質(zhì)樣品時(shí),檢測結(jié)果假陽性多。因此陽性樣品應(yīng)該用儀器法進(jìn)行復(fù)測。
[0005]電化學(xué)免疫傳感器是將免疫技術(shù)和電化學(xué)檢測技術(shù)相結(jié)合的一種新分析方法,利用信號轉(zhuǎn)換器(電化學(xué)工作站)把分子識別器(探針)與被測對象發(fā)生的物理或化學(xué)變化轉(zhuǎn)變成電信號。該技術(shù)具有快速、靈敏、選擇性高、操作簡便等特點(diǎn),因此應(yīng)用電化學(xué)免疫傳感器檢測樣品中OTA具有非常重要的意義。
[0006]電化學(xué)免疫傳感器自建立以來,主要應(yīng)用于重大疾病標(biāo)志物的檢測。近年來,該技術(shù)逐步被應(yīng)用于食品中真菌毒素的檢測,但相對文獻(xiàn)較少,尤其針對食品中OTA的電化學(xué)生物傳感器檢測技術(shù)的研究與應(yīng)用尚不成熟。
[0007]為了彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)OTA檢測的不足,旨在建立一種新型電化學(xué)免疫傳感器用于OTA的快速、靈敏檢測。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0008]鑒于以上所述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn),本發(fā)明的第一方面提供一種檢測赭曲霉毒素A (OTA)的電化學(xué)免疫傳感器,包括工作電極、參比電極和對電極,所述工作電極為先在基底電極表面修飾羧基化單壁碳納米管/殼聚糖復(fù)合材料(SWNTs-COOH/CS),而后固定赭曲霉毒素A-牛血清白蛋白偶聯(lián)物(OTA-BSA)所得。
[0009]優(yōu)選地,所述基底電極選自玻碳電極。
[0010]優(yōu)選地,所述羧基化單壁碳納米管/殼聚糖復(fù)合材料(SWNTs-COOH/CS)為將羧基化單壁碳納米管(SWNTs-COOH)分散于殼聚糖(CS)中制得。
[0011 ] 優(yōu)選地,所述羧基化單壁碳納米管/殼聚糖復(fù)合材料(SWNTs-COOH/CS)中,羧基化單壁碳納米管與殼聚糖的質(zhì)量比為1:1?12:1 ;更優(yōu)選為1:1。
[0012]優(yōu)選地,每個(gè)所述工作電極上,羧基化單壁碳納米管/殼聚糖復(fù)合材料(SWNTs-COOH/CS)中羧基化單壁碳納米管的質(zhì)量為I?12ug,更優(yōu)選為2ug。
[0013]優(yōu)選地,所述工作電極上,羧基化單壁碳納米管/殼聚糖復(fù)合材料(SWNTs-COOH/CS)中羧基化單壁碳納米管與赭曲霉毒素A-牛血清清蛋白偶聯(lián)物(OTA-BSA)的質(zhì)量比為
6.67:1?2400:1,更優(yōu)選為6.67:1?80:1,最優(yōu)選為40:1。進(jìn)一步地,所述電化學(xué)免疫傳感器中的參比電極和對電極與工作電極構(gòu)成三電極系統(tǒng)。
[0014]優(yōu)選地,所述參比電極選自飽和甘汞電極或銀氯化銀電極(Ag/AgCl)之任意一種;更優(yōu)選地,所述參比電極為銀/氯化銀(Ag/AgCl)電極。
[0015]優(yōu)選地,所述對電極為鉬絲電極。
[0016]本發(fā)明第二方面提供了前述電化學(xué)免疫傳感器中的工作電極的制備方法,所述方法為先在基底電極表面修飾羧基化單壁碳納米管/殼聚糖復(fù)合材料(SWNTs-COOH/CS),而后再固定赭曲霉毒素A-牛血清清蛋白偶聯(lián)物(OTA-BSA)。
[0017]優(yōu)選地,所述工作電極按照以下步驟制備:
[0018]I)制備羧基化單壁碳納米管/殼聚糖復(fù)合材料(SWNTs-COOH/CS):
[0019]將殼聚糖溶解于醋酸溶液中,制備殼聚糖溶液;將羧基化單壁碳納米管(SWNTs-COOH)溶解于所得殼聚糖溶液中,得SWNTs-COOH/CS復(fù)合材料混懸液;
[0020]2)工作電極的修飾及功能化:
[0021](I)基底電極表面處理:將基底電極表面進(jìn)行拋光處理,使其表面光潔;
[0022](2)修飾單壁碳納米管/殼聚糖納米復(fù)合材料(SWNTs-C00H/CS):將步驟I)中制備的SWNTs-COOH/CS混懸液滴涂到步驟(I)中處理好的基底電極表面,晾干成膜,得到羧基化單壁碳納米管/殼聚糖復(fù)合材料修飾電極(SWNTs-COOH/CS/GCE);
[0023](3)采用活化液活化所得SWNTs-COOH/CS/GCE中SWNTs-COOH上的羧基基團(tuán);
[0024](4)固定赭曲霉毒素A-牛血清清蛋白偶聯(lián)物(OTA-BSA):在活化后的SWNTs-COOH/CS/GCE 上加 0TA-BSA,孵育,形成 0TA-BSA-SWNTs-C00H/CS/GCE,BSA 封閉非特異性吸附位點(diǎn),即得工作電極。
[0025]優(yōu)選地,步驟I)中,殼聚糖的分子式(C6H11NO4)n,單兀體的分子量為161.2。
[0026]優(yōu)選地,步驟I)中,醋酸溶液的濃度為I %。
[0027]優(yōu)選地,步驟I)中,殼聚糖溶液的濃度為0.5?6mg/mL,更優(yōu)選為lmg/mL。
[0028]優(yōu)選地,步驟I)中,SWNTs-COOH/CS復(fù)合材料混懸液中,羧基化單壁碳納米管與殼聚糖的質(zhì)量比為1:1?12:1 ;更優(yōu)選為1:1。
[0029]優(yōu)選地,步驟I)中,SWNTs-C00H/CS復(fù)合材料混懸液中,SffNTs-COOH的終濃度為
0.5 ?6.0mg/ml ;更優(yōu)選為 1.0mg/ml。
[0030]優(yōu)選地,步驟⑴中,所述基底電極選自玻碳電極。
[0031]優(yōu)選地,步驟(I)中,可采用氧化鋁粉對所述基底電極進(jìn)行拋光處理。
[0032]優(yōu)選地,步驟(2)中所修飾的單壁碳納米管/殼聚糖納米復(fù)合材料(SWNTs-COOH/CS)中,羧基化單壁碳納米管與殼聚糖的質(zhì)量比為1:1?12:1 ;更優(yōu)選為1:1。
[0033]優(yōu)選地,步驟(2)中,每個(gè)工作電極上所修飾的羧基化單壁碳納米管/殼聚糖復(fù)合材料(SWNTs-COOH/CS)中羧基化單壁碳納米管的質(zhì)量為I?12ug,更優(yōu)選為2ug。
[0034]優(yōu)選地,步驟(3)中,所述活化液為為EDC和NHS的混合液EDC/NHS。更優(yōu)選地,EDC/NHS中EDC的濃度為10mg/ml,NHS的濃度為4mg/ml,EDC與NHS的質(zhì)量比為5mM:2mM。
[0035]優(yōu)選地,步驟(4)中,赭曲霉毒素A-牛血清清蛋白偶聯(lián)物(OTA-BSA)的濃度為
0.5 ?15.0ug/ml ;更優(yōu)選地,OTA-BSA 的濃度為 5.0ug/ml。
[0036]優(yōu)選地,步驟(2)中所修飾的單壁碳納米管/殼聚糖納米復(fù)合材料(SWNTs-COOH/CS)中羧基化單壁碳納米管與步驟(4)中所固定的赭曲霉毒素A-牛血清清蛋白偶聯(lián)物(OTA-BSA)的質(zhì)量比為6.67:1?2400:1,更優(yōu)選為6.67:1?80:1,最優(yōu)選為40:1。
[0037]本發(fā)明第三方面提供了一種檢測赭曲霉毒素A的檢測體系,包括本發(fā)明第一方面所述的電化學(xué)免疫傳感器、OTA單克隆抗體、二抗和免疫反應(yīng)緩沖體系。
[0038]優(yōu)選地,所述二抗為堿性磷酸酶標(biāo)記二抗。
[0039]進(jìn)一步的,可選擇堿性磷酸酶標(biāo)記的馬抗鼠,兔抗鼠,羊抗鼠等任意來源的抗鼠的二抗,更優(yōu)選為堿性磷酸酶標(biāo)記馬抗小鼠IgG (H+L)。
[0040]優(yōu)選地,所述免疫反應(yīng)緩沖體系為含α -NP的二乙醇胺(DEA)緩沖液。
[0041]本發(fā)明第四方面提供了一種檢測赭曲霉毒素A的方法,為采用前述的電化學(xué)免疫傳感器或檢測體系對樣品中的赭曲霉毒素A進(jìn)行檢測,所述方法具體包括以下步驟:
[0042](a)在前述構(gòu)建的電化學(xué)免疫傳感器的工作電極上同時(shí)加入樣品溶液和一定量OTA單克隆抗體溶液;
[0043](b)加入適量的堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗,孵育,通過與OTA單克隆抗體選擇性地結(jié)合到電極表面;
[0044](C)將工作電極置于免疫反應(yīng)緩沖體系中,并將工作電極、參比電極以及對電極正確連接到電化學(xué)工作站上,用差分脈沖伏安(DPV)進(jìn)行測定。
[0045]優(yōu)選地,步驟(a)中,OTA單克隆抗體溶液的濃度為1.25?20.0ug/ml ;更優(yōu)選為5.0ug/ml ο
[0046]優(yōu)選地,步驟(b)中,所述堿性磷酸酶標(biāo)記二抗為堿性磷酸酶標(biāo)記馬抗小鼠IgG (H+L)。
[0047]更優(yōu)選地,所述堿性磷酸酶標(biāo)記馬抗小鼠IgG(H+L)的稀釋比例為:1:50?1:400 ;最佳為 1:200。
[0048]優(yōu)選地,步驟(c)中,所述參比電極選自飽和甘汞電極或銀氯化銀電極(Ag/AgCl)之任意一種;更優(yōu)選地,所述參比電極為銀/氯化銀(Ag/AgCl)電極。
[0049]優(yōu)選地,步驟(C)中,所述對電極為鉬絲電極。
[0050]優(yōu)選地,步驟(C)中,所述免疫反應(yīng)緩沖體系為含α-ΝΡ的二乙醇胺(DEA)緩沖液。
[0051]更優(yōu)選地,所述免疫反應(yīng)緩沖體系中α -NP的濃度為0.25?1.5mg/ml ;最佳為
0.75mg/mL。
[0052]本發(fā)明第五方面提供了前述電化學(xué)免疫傳感器或檢測體系在檢測赭曲霉毒素A中的用途。
[0053]本發(fā)明的有益效果為:
[0054](I)本發(fā)明研制了一種基于單壁碳納米管/殼聚糖復(fù)合材料(SWNTs-COOH/CS)固定抗原(OTA-BSA)的間接競爭電化學(xué)免疫傳感器,可以用于靈敏地檢測0ΤΑ。首先制得穩(wěn)定性良好的單壁碳納米管/殼聚糖復(fù)合材料(SWNTs-COOH/CS)修飾于玻碳電極表面,再通過吸附作用將赭曲霉毒素-牛血清白蛋白交聯(lián)物(OTA-BSA)固定到修飾過的電極表面。檢測時(shí),加入樣品與一定量的OTA單克隆抗體(ant1-OTA),樣品中的游離OTA與工作電極表面一定量的固定化的OTA-BSA耦合物競爭結(jié)合單克隆抗體,競爭反應(yīng)過后,再加入堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗,二抗特異性地與電極表面所捕獲的一抗反應(yīng),進(jìn)而堿性磷酸酶催化底物α-萘基磷酸鹽水解,在電極表面產(chǎn)生電信號。所述電化學(xué)免疫傳感器的線性范圍為
0.01 — 100ng/ml,線性方程式為Y = 6.3155Ε_6_2.89458Ε_6Χ,檢測限位4pg/ml,線性相關(guān)系數(shù)為 0.99984。
[0055](2)眾所周知,OTA-BSA只有在生物相容性的環(huán)境中才能保持其活性。將其直接固定到電極表面通常會引起抗體的構(gòu)想改變,從而導(dǎo)致喪失生物活性。因此,如何有效地把OTA-BSA固定在電極上是本發(fā)明的電化學(xué)免疫傳感器制備的一個(gè)關(guān)鍵步驟。由于本發(fā)明中工作電極表面修飾的SWNTs-COOH/CS復(fù)合材料具有非常大的比表面積以及良好的生物相容性,所以能夠牢固地吸附0TA-BSA,檢測時(shí),能夠有效增加抗體的負(fù)載量,并保持抗體的生物活性。
[0056]此外,SWNTs-C00H/CS復(fù)合材料還具有較好的電子傳導(dǎo)作用,能夠增加GCE和樣品溶液之間的電子轉(zhuǎn)移,提高導(dǎo)電性能,顯著增加了 OTA測定的靈敏度,很好地降低OTA分析的檢測下限。
[0057](3)與此同時(shí),信號放大是影響檢測靈敏度的另一個(gè)重要因素。本發(fā)明采用了基于碳納米管和堿性磷酸酶的雙放大策略,極大地實(shí)現(xiàn)了信號放大。在本發(fā)明中,堿性磷酸酶(AP)被引進(jìn)電極表面催化α-萘基磷酸鹽(α-ΝΡ)水解而產(chǎn)生電化學(xué)信號,增強(qiáng)了電化學(xué)響應(yīng)信號,可對樣品中的OTA濃度進(jìn)行準(zhǔn)確的定量。
[0058](4)綜上所述,本發(fā)明成功構(gòu)建了可用于檢測赭曲霉毒素A(OTA)的電化學(xué)免疫傳感器及檢測體系,應(yīng)用本發(fā)明的傳感器,對OTA的測定顯示了靈敏度高、穩(wěn)定、重現(xiàn)性好的能力。與現(xiàn)有技術(shù)比較,本發(fā)明的傳感器成本低,操作簡單方便,檢測周期短,特異性好,假陽性率和假陰性率低。適用于實(shí)際樣品的測定等,有望成為具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值的傳感器。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0059]圖1為本發(fā)明實(shí)施例1的SWNTs-COOH/CS復(fù)合材料混懸液用S-300N掃描電鏡觀察結(jié)果。
[0060]圖2為本發(fā)明實(shí)施例1每一步不同修飾電極在5mM的鐵氰化鉀溶液中的方波伏安響應(yīng)曲線,其中
[0061]a 為裸 GCE;
[0062]b 為 SWNTs-C00H/CS/GCE ;
[0063]c 為 OTA-BSA-SWNTs-COOH/CS/GCE ;
[0064]d 為 ant1-0TA/0TA-BSA-SWNTs-C00H/CS/GCE ;
[0065]e 為 AP-ant1-antibody/ant1-0TA/0TA-BSA-SWNTs-C00H/CS/GCE。
[0066]圖3為本發(fā)明實(shí)施例1每一步不同修飾電極所對應(yīng)的循環(huán)伏安響應(yīng)曲線,其中
[0067]a 為裸 GCE ;
[0068]b 為 SWNTs-C00H/CS/GCE ;
[0069]c 為 OTA-BSA-SWNTs-COOH/CS/GCE ;
[0070]d 為 ant1-OTA/OTA-BSA-SWNTs-COOH/CS/GCE ;
[0071]e 為 AP-ant1-antibody/ant1-OTA/OTA-BSA-SWNTs-COOH/CS/GCE。
[0072]圖4為對比試驗(yàn)中各個(gè)傳感器的電流響應(yīng)曲線圖,其中曲線a,b, c分別為在裸玻碳電極,玻碳電極修飾SWNTs-C00H/CS/GCE,玻碳電極修飾SWNTs_C00H/GCE基礎(chǔ)上構(gòu)建傳感器之后的電流信號響應(yīng)曲線。
[0073]圖5為不同濃度的OTA-BSA所構(gòu)建的電化學(xué)免疫傳感器差分脈沖伏安掃描結(jié)果。
[0074]圖6為不同濃度的ant1-OTA所構(gòu)建的電化學(xué)免疫傳感器差分脈沖伏安掃描結(jié)果。
[0075]圖7為不同稀釋比例的AP-ant1-antibody所構(gòu)建的電化學(xué)免疫傳感器差分脈沖伏安掃描結(jié)果。
[0076]圖8為不同濃度的α -NP所構(gòu)建的電化學(xué)免疫傳感器差分脈沖伏安掃描結(jié)果。
[0077]圖9為本發(fā)明的電化學(xué)免疫傳感器在五個(gè)不同濃度(100ng/ml,10ng/ml, lng/ml, 0.lng/ml, 0.0lng/ml)的OTA標(biāo)準(zhǔn)品溶液中孵育,DPV法記錄電流值ip所得曲線圖。
[0078]圖10為本發(fā)明的電化學(xué)免疫傳感器檢測OTA時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0079]圖11為本發(fā)明制備的免疫傳感器的特異性分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0080]以下通過特定的具體實(shí)例說明本發(fā)明的實(shí)施方式,本領(lǐng)域技術(shù)人員可由本說明書所揭露的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點(diǎn)與功效。本發(fā)明還可以通過另外不同的【具體實(shí)施方式】加以實(shí)施或應(yīng)用,本說明書中的各項(xiàng)細(xì)節(jié)也可以基于不同觀點(diǎn)與應(yīng)用,在沒有背離本發(fā)明的精神下進(jìn)行各種修飾或改變。
[0081]須知,下列實(shí)施例中未具體注明的工藝設(shè)備或裝置均采用本領(lǐng)域內(nèi)的常規(guī)設(shè)備或裝置;所有壓力值和范圍都是指絕對壓力。
[0082]此外應(yīng)理解,本發(fā)明中提到的一個(gè)或多個(gè)方法步驟并不排斥在所述組合步驟前后還可以存在其他方法步驟或在這些明確提到的步驟之間還可以插入其他方法步驟,除非另有說明;還應(yīng)理解,本發(fā)明中提到的一個(gè)或多個(gè)設(shè)備/裝置之間的組合連接關(guān)系并不排斥在所述組合設(shè)備/裝置前后還可以存在其他設(shè)備/裝置或在這些明確提到的兩個(gè)設(shè)備/裝置之間還可以插入其他設(shè)備/裝置,除非另有說明。而且,除非另有說明,各方法步驟的編號僅為鑒別各方法步驟的便利工具,而非為限制各方法步驟的排列次序或限定本發(fā)明可實(shí)施的范圍,其相對關(guān)系的改變或調(diào)整,在無實(shí)質(zhì)變更技術(shù)內(nèi)容的情況下,當(dāng)亦視為本發(fā)明可實(shí)施的范疇。
[0083]實(shí)施例1制備電化學(xué)免疫傳感器
[0084]1.材料與方法
[0085]1.1 材料
[0086]赭曲霉毒素A-牛血清清蛋白偶聯(lián)物(OTA-BSA)、OTA單克隆抗體(ant1-OTA)購自北京華安麥科生物技術(shù)有限公司、堿性磷酸酶標(biāo)記馬抗小鼠IgG(H+L)購自美國Vector實(shí)驗(yàn)室、OTA標(biāo)準(zhǔn)品、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、α -萘基磷酸鹽(α -NP)、殼聚糖(CS)均購自美國Sigma-Aldrich公司,羧基化單壁碳納米管購自深圳納米港有限公司,甲醇、丙酮等其他試劑均購自重慶茂業(yè)化學(xué)試劑有限公司。
[0087]1.2檢測儀器
[0088]CHI660D型電化學(xué)工作站為上海辰華儀器公司產(chǎn)品。
[0089]1.3檢測原理
[0090]在玻碳電極表面通過直接涂覆法修飾鋪上一層羧基化單壁碳納米管/殼聚糖復(fù)合材料(SWNTs-COOH/CS),并利用EDC/NHS活化SWNTs-COOH上的羧基。將OTA-BSA通過蛋白質(zhì)氨基端與羧基化單壁碳納米管SWNTs-COOH上的活化羧基反應(yīng)連接,并通過抗原抗體反應(yīng)與同時(shí)加入的OTA單體來競爭吸附OTA單克隆抗體(ant1-OTA),再加入堿性磷酸酶標(biāo)記馬抗小鼠IgG(H+L) 二抗,通過堿性磷酸酶與底物α-萘基磷酸鹽(α-ΝΡ)反應(yīng)產(chǎn)生的電化學(xué)信號繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線和得到實(shí)測樣品OTA水平。
[0091]2.工作電極的制備
[0092]2.1羧基化單壁碳納米管/殼聚糖(SWNTs-COOH/CS)復(fù)合材料的制備
[0093]將殼聚糖粉末溶解于I %醋酸溶液中,制備濃度為lmg/ml的殼聚糖溶液;
[0094]取5.0ml lmg/ml殼聚糖溶液加入5.0mg羧基化單壁碳納米管(SWNTs-COOH)超聲分散2h得均勻穩(wěn)定分散良好的SWNTs-COOH/CS復(fù)合材料混懸液,其中SWNTs-COOH的終濃度為lmg/ml。在使用之前,于4°C低溫保存。
[0095]2.2工作電極的修飾及功能化
[0096](I)玻碳電極表面處理:玻碳電極(GCE)在使用前用氧化鋁粉拋光至鏡面,先后分別用超純水和體積比為1:1的丙酮和硝酸中超聲幾分鐘。隨后再次將電極用超純水超聲幾分鐘,再用去離子水沖洗干凈,在室溫下晾干。
[0097](2)將2 μ L預(yù)先準(zhǔn)備好的SWNTs-C00H/CS混懸液(lmg mL—1)小心地滴涂在處理干凈的玻碳電極表面。然后,在室溫下將修飾的玻碳電極過夜晾干得到羧基化單壁碳納米管/殼聚糖復(fù)合材料修飾電極(SWNTs-COOH/CS/GCE)。
[0098](3)將所制備的 SWNTs-C00H/CS/GCE 用磷酸鹽緩沖液(PBS,0.01mol/L, pH7.4)清洗后,浸入新鮮配置的EDC/NHS活化液(EDC與NHS的濃度比為,5mM:2mM)中,于37°C溫育Ih,活化SWNTs-COOH上的羧基基團(tuán)。
[0099](4)活化后的SWNTs-COOH/CS/GCE再用PBS緩沖液徹底清洗。將10 μ L的OTA-BSA(5 μ g mL O立即滴于電極表面,37°C溫育1.5h。孵育完全之后,將制備的電極用PBS清洗。于室溫在1yLl^牛血清白蛋白(BSA)中封閉電極表面未反應(yīng)的活性位點(diǎn)。最后,以PBS徹底清洗電極,得OTA-BSA-SWNTs/CS/GCE并置于4°C的冰箱中待用。
[0100]3.電化學(xué)免疫傳感器的使用
[0101](I)將 5μ L 用 PBS(pH7.4)稀釋到一定濃度的 OTA(O ?500ng ml/1)和5 μ LlO μ g mr1的OTA單克隆抗體(ant1-OTA)均勻混合,滴加在修飾了 OTA-BSA的電極OTA-BSA-SWNTs/CS/GCE 表面,37°C溫育 90min,得 ant1-OTA-OTA-BSA-SWNTs/CS/GCE。在反應(yīng)過程中,電極上固定的OTA-BSA與游離在混合液中的OTA共同競爭固定量的ant1-OTA。
[0102](2)然后再用PBS緩沖液(pH7.4)清洗電極,置于10 μ L1:200稀釋的堿性磷酸酶標(biāo)記馬抗小鼠IgG(H+L) 二抗中,37°C溫育90min,PBS緩沖液(pH7.4)清洗后,得AP-ant1-antibody/ant1-0TA/0TA-BSA-SWNTs-C00H/CS/GCE。
[0103](3)以現(xiàn)配制的含0.75mg mL—1 α -NP的二乙醇胺(DEA)緩沖液作為免疫反應(yīng)緩沖體系,將工作電極置于其中,Ag/AgCl電極為參比電極,鉬絲電極為對電極,在室溫下,用差分脈沖伏安法(DPV)進(jìn)行測定。
[0104]4.對比試驗(yàn)
[0105]在同一實(shí)驗(yàn)條件下,以裸玻碳電極和玻碳電極表面只羧基化單壁碳納米管(SWNTs-COOH)所得工作電極GCE、SffNTs-COOH/GCE所構(gòu)建的電化學(xué)免疫傳感器為對照。
[0106]實(shí)施例2電化學(xué)免疫傳感器的表征和檢驗(yàn)
[0107]1.對SWNTs-COOH/CS復(fù)合材料膜的表征
[0108]對實(shí)施例1中所得SWNTs-COOH/CS復(fù)合材料混懸液用S-300N掃描電鏡進(jìn)行掃描觀察,如圖1a和Ib顯示,該納米復(fù)合材料中碳管成明顯的管狀,在溶液中分散均勻。
[0109]在玻碳電極表面滴涂SWNTs-COOH/CS,在室溫晾干成膜后,肉眼觀察在電極:SWNTs-COOH/CS/GCE表面可見一層均勻的膜狀物質(zhì)。
[0110]2.不同修飾電極的電化學(xué)表征
[0111]如圖2所示,是每一步不同修飾電極在5mM的鐵氰化鉀溶液中的方波伏安響應(yīng)曲線.
[0112]a 為裸 GCE ;
[0113]b 為 SWNTs-COOH/CS/GCE ;
[0114]c 為 OTA-BSA-SWNTs-COOH/CS/GCE ;
[0115]d 為 ant1-0TA/0TA-BSA-SWNTs-C00H/CS/GCE ;
[0116]e 為 AP-ant1-antibody/ant1-0TA/0TA-BSA-SWNTs-C00H/CS/GCE。
[0117]當(dāng)裸GCE表面修飾SWNTs-COOH/CS之后,峰值電流明顯增大(圖2-曲線b),結(jié)果說明SWNTs-COOH/CS薄膜能夠促進(jìn)溶液中的電子在電極表面的轉(zhuǎn)移。當(dāng)OTA-BSA滴加到活化的電極表面后,由于蛋白質(zhì)的空間位阻現(xiàn)象和絕緣作用對電子轉(zhuǎn)移構(gòu)成了阻礙,峰值電流呈現(xiàn)明顯的降低(圖2-曲線c)。當(dāng)電極通過ant1-OTA的進(jìn)一步修飾孵育后,增加的電阻使得峰值電流進(jìn)一步降低(圖2-曲線d),表明制備的電化學(xué)免疫傳感器工作電極中OTA-BSA對ant1-OTA進(jìn)行了成功的識別與結(jié)合作用。當(dāng)把一定濃度的AP-ant1-antibody滴加到修飾后的電極表面孵育過后,峰值電流再一步降低(圖2-曲線e),表明AP-ant1-antibody成功的引入電化學(xué)免疫傳感器的工作電極上。
[0118]圖3為每一步不同修飾電極所對應(yīng)的循環(huán)伏安響應(yīng)曲線,
[0119]a 為裸 GCE ;
[0120]b 為 SWNTs-C00H/CS/GCE ;
[0121]c 為 OTA-BSA-SWNTs-COOH/CS/GCE ;
[0122]d 為 ant1-0TA/0TA-BSA-SWNTs-C00H/CS/GCE ;
[0123]e 為 AP-ant1-antibody/ant1-0TA/0TA-BSA-SWNTs-C00H/CS/GCE。
[0124]結(jié)果與圖2呈現(xiàn)出有良好的一致性,有效地證明我們成功地對電極進(jìn)行了每一步的修飾。
[0125]3.對比實(shí)驗(yàn):
[0126]如圖4所示,曲線a, b,c分別為在裸玻碳電極,玻碳電極修飾SWNTs-C00H/CS/GCE,玻碳電極修飾SWNTs-COOH/GCE基礎(chǔ)上構(gòu)建傳感器之后的電流信號響應(yīng)曲線。曲線a表明蛋白質(zhì)不能直接有效地固定在裸玻碳電極表面,所以響應(yīng)電流很低;曲線c表明僅碳管在電極表面成膜之后,能夠通過其羧基端與蛋白質(zhì)氨基端形成穩(wěn)定的結(jié)合,把抗原固定在電極表面,所以其電流響應(yīng)值比用裸玻碳電極構(gòu)建的傳感器高,但如圖所示,運(yùn)用單一SWNTs-COOH修飾電極構(gòu)建傳感器有一個(gè)缺點(diǎn),即其響應(yīng)電流的基線很高,而且不穩(wěn)定;曲線b運(yùn)用SWNTs-COOH/CS復(fù)合材料修飾電極之后構(gòu)建的傳感器,不僅能夠高效地固定檢測抗原,而且還能有效降低和穩(wěn)定該傳感器電流響應(yīng)的基線,并且該復(fù)合材料修飾電極之后對響應(yīng)電流的大小并不影響。因此,采用SWNTs-COOH/CS修飾電極作為工作電極構(gòu)建用于檢測OTA的電化學(xué)免疫傳感器具有不可比擬的優(yōu)勢。
[0127]實(shí)施例3電化學(xué)免疫傳感器及其使用條件的優(yōu)化
[0128]我們還對實(shí)驗(yàn)過程中幾個(gè)重要的條件即SWNTs-COOH/CS復(fù)合混懸液中SffNTs-COOH的終濃度、OTA-BSA的濃度、ant1-OTA的濃度、AP-ant1-antibody的稀釋比例、α -NP的濃度這幾個(gè)測定條件進(jìn)行了進(jìn)一步的優(yōu)化。對每一個(gè)條件都由低濃度到高濃度分別選取五個(gè)點(diǎn)進(jìn)行一系列實(shí)驗(yàn)。
[0129]1.為考察SWNTs-C00H/CS復(fù)合材料混懸液中SWNTs-COOH的終濃度大小對電化學(xué)免疫傳感器的影響,本實(shí)驗(yàn)采用了不同濃度的(0.5,1.0,2.0,4.0,6.0mg/ml) SWNTs-COOH/CS復(fù)合混懸液構(gòu)建電化學(xué)免疫傳感器。結(jié)果表明,SffNTs-COOH的終濃度太低,其成膜性差,不能很好地吸附OTA-BSA及固定抗體,而且如果膜中分散的SWNTs-COOH較少,促進(jìn)電子傳遞的作用較弱;若SWNTs-COOH的終濃度太大,則成膜厚度增加,也會阻礙電子傳遞。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),SffNTs-COOH終濃度為0.5?6.0mg/ml的SWNTs-C00H/CS復(fù)合混懸液均能夠?qū)崿F(xiàn)構(gòu)建符合要求的傳感器,其中以SWNTs-COOH終濃度為1.0mg/ml的SWNTs-COOH/CS復(fù)合混懸液為最佳。
[0130]2.為考察OTA-BSA濃度大小對電化學(xué)免疫傳感器的影響,本實(shí)驗(yàn)采用了不同濃度的(0.5,1.0,5.0,10.0,15.0ug/ml) OTA-BSA構(gòu)建免疫電化學(xué)免疫傳感器,然后進(jìn)行差分脈沖伏安掃描。如圖5可見,響應(yīng)電流隨著OTA-BSA濃度的增加而增加,當(dāng)OTA-BSA濃度達(dá)到
5.0ug/ml的以后,再增大OTA-BSA的濃度,響應(yīng)電流增大不明顯,說明5.0ug/ml已經(jīng)達(dá)到OTA-BSA的最佳濃度。
[0131]3.同理,為考察ant1-OTA濃度大小對使用電化學(xué)免疫傳感器的影響,本實(shí)驗(yàn)采用了不同濃度的(1.25,2.5,5.0,10.0, 20.0ug/ml) ant1-OTA,然后進(jìn)行差分脈沖伏安掃描。如圖6可見,ant1-OTA最佳濃度為5.0ug/ml。
[0132]4.同理,為考察AP-ant1-antibody濃度大小對使用電化學(xué)免疫傳感器的影響,本實(shí)驗(yàn)采用了不同稀釋比例的(I:50,1:100,1:200,1:300,I:400V/V) AP-ant1-antibody,然后進(jìn)行差分脈沖伏安掃描。如圖7可見,AP-ant1-antibody最佳稀釋比例為1:200(V/V) O
[0133]5.同理,為考察α-ΝΡ濃度大小對使用免疫傳感器的影響,本實(shí)驗(yàn)采用了含不同濃度a -NP(0.25,0.5,0.75,1,1.5mg mL—1)的免疫反應(yīng)緩沖體系,然后進(jìn)行差分脈沖伏安掃描。如圖8可見,α -NP的最佳濃度為0.75mg mL'
[0134]實(shí)施例4制備的電化學(xué)免疫化學(xué)傳感器的性能分析
[0135]為了評估電化學(xué)免疫傳感器的性能,對以PBS(pH7.4)配備的不同濃度的OTA標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行分析。具體的,在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下,(I)將5μ L用PBS(pH7.4)稀釋到五個(gè)不同濃度的 OTA (200ng/ml, 20ng/ml, 2ng/ml, 0.2ng/ml, 0.02ng/ml)和 5μ LlO μ g mL 1 的 OTA 單克隆抗體(ant1-OTA)均勻混合,滴加在修飾了 OTA-BSA的電極OTA-BSA-SWNTs/CS/GCE表面,37°C溫育90min。在反應(yīng)過程中,電極上固定的OTA-BSA與游離在混合液中的OTA共同競爭固定量的ant1-OTA。(2)然后再用PBS緩沖液(pH7.4)清洗電極,置于10 μ L1: 200稀釋的堿性磷酸酶標(biāo)記馬抗小鼠IgG (H+L) 二抗中,37°C溫育90min,PBS緩沖液(pH7.4)清洗。采用DPV法記錄電流值ip (如圖9所示),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,如圖10所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,當(dāng)OTA濃度在1pg mL—1到10ng mL—1之間時(shí),得到的峰電流與OTA濃度的對數(shù)呈線性相關(guān),回歸方程為:Y = 6.3155Ε_6-2.89458Ε_6Χ。相關(guān)系數(shù)為0.999。將傳感器在只含有5ug mL—1的ant1-OTA而不含OTA標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行競爭的空白溶液中連續(xù)掃描10次,根據(jù)空白信號加上3倍標(biāo)準(zhǔn)差所對應(yīng)的信號值估計(jì)檢出限,計(jì)算得4pg mL—1。
[0136]實(shí)施例5制備的電化學(xué)免疫傳感器的特異性分析
[0137]電化學(xué)免疫傳感器的特異性,在分析不分離的生物樣本中的生物標(biāo)志物時(shí)具有重要的作用,主要取決于抗體的特異性。我們所使用的是OTA單克隆抗體。為了評價(jià)本免疫傳感器的特異性,我們對在檢測OTA時(shí)可能會出現(xiàn)的其他的三種真菌毒素黃曲霉毒素B1(AFB1)、玉米赤霉烯酮(ZEA)、伏馬菌素B1(FB1)進(jìn)行了檢測。具體的,將黃曲霉毒素B1 (AFB1)、玉米赤霉烯酮(ZEA)、伏馬菌素B1 (FB1)各I μ g mL—1以及10ng mPOTA分別采用同實(shí)施例4所構(gòu)建的電化學(xué)免疫傳感器進(jìn)行測定。結(jié)果如圖10所示,其它的三種真菌毒素的DPV響應(yīng)電流接近于空白樣(不含0ΤΑ),然而OTA的DPV響應(yīng)電流有明顯的下降。這些結(jié)果說明制備的電化學(xué)免疫傳感器能夠有效地分辨不同種類的真菌毒素,具有良好的特異性。
[0138]實(shí)施例6制備的電化學(xué)免疫傳感器的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性分析
[0139]在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下,制備免疫傳感器。用不同批次的免疫傳感器對10ng mL—1和10pg mL.1的OTA進(jìn)行了 3次平行測定,變異系數(shù)分別為3.56%和5.20%。表明,本發(fā)明制備的電化學(xué)免疫傳感器具有良好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。
[0140]上述實(shí)施例僅例示性說明本發(fā)明的原理及其功效,而非用于限制本發(fā)明。任何熟悉此技術(shù)的人士皆可在不違背本發(fā)明的精神及范疇下,對上述實(shí)施例進(jìn)行修飾或改變。因此,舉凡所屬【技術(shù)領(lǐng)域】中具有通常知識者在未脫離本發(fā)明所揭示的精神與技術(shù)思想下所完成的一切等效修飾或改變,仍應(yīng)由本發(fā)明的權(quán)利要求所涵蓋。
【權(quán)利要求】
1.一種檢測赭曲霉毒素A的電化學(xué)免疫傳感器,包括工作電極、參比電極和對電極,所述工作電極為先在基底電極表面修飾羧基化單壁碳納米管/殼聚糖復(fù)合材料,而后固定赭曲霉毒素A-牛血清白蛋白偶聯(lián)物所得。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的電化學(xué)免疫傳感器,其特征在于,所述羧基化單壁碳納米管/殼聚糖復(fù)合材料中,羧基化單壁碳納米管與殼聚糖的質(zhì)量比為1:1?12:1。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的電化學(xué)免疫傳感器,其特征在于,每個(gè)工作電極上,所述羧基化單壁碳納米管/殼聚糖復(fù)合材料中羧基化單壁碳納米管的質(zhì)量為I?12ug。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的電化學(xué)免疫傳感器,其特征在于,所述羧基化單壁碳納米管/殼聚糖復(fù)合材料中的羧基化單壁碳納米管與所述赭曲霉毒素A-牛血清白蛋白偶聯(lián)物的質(zhì)量比為 6.67:1 ?2400:1。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的電化學(xué)免疫傳感器,其特征在于,所述參比電極選自飽和甘汞電極或銀氯化銀電極;所述對電極為鉬絲電極;所述基底電極選自玻碳電極。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的電化學(xué)免疫傳感器中的工作電極的制備方法,其特征在于,所述方法為先在基底電極表面修飾羧基化單壁碳納米管/殼聚糖復(fù)合材料,而后再固定赭曲霉毒素A-牛血清白蛋白偶聯(lián)物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法,其特征在于,所述工作電極具體按照以下步驟制備: 1)制備羧基化單壁碳納米管/殼聚糖復(fù)合材料:將殼聚糖溶解于醋酸溶液中,制備殼聚糖溶液;將羧基化單壁碳納米管溶解于所得殼聚糖溶液中,得羧基化單壁碳納米管/殼聚糖復(fù)合材料混懸液; 2)工作電極的修飾及功能化: (1)基底電極表面處理:將基底電極表面進(jìn)行拋光處理,使其表面光潔; (2)修飾單壁碳納米管/殼聚糖納米復(fù)合材料:將步驟I)中制備的羧基化單壁碳納米管/殼聚糖復(fù)合材料混懸液滴涂到步驟(I)中處理好的基底電極表面,晾干成膜,得到羧基化單壁碳納米管/殼聚糖復(fù)合材料修飾電極SWNTs-COOH/CS/GCE ; (3)采用活化液活化所得SWNTs-COOH/CS/GCE中SWNTs-COOH上的羧基基團(tuán); (4)固定赭曲霉毒素A-牛血清白蛋白偶聯(lián)物:在活化后的SWNTs-COOH/CS/GCE上加OTA-BSA,孵育,形成OTA-BSA-SWNTs-COOH/CS/GCE,BSA封閉非特異性吸附位點(diǎn),即得工作電極。
8.一種檢測赭曲霉毒素A的檢測體系,包括如權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的電化學(xué)免疫傳感器、抗赭曲霉毒素A單克隆抗體、二抗和免疫反應(yīng)緩沖體系。
9.一種檢測赭曲霉毒素A的方法,為采用如權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的電化學(xué)免疫傳感器或如權(quán)利要求8所述的檢測體系對樣品中的赭曲霉毒素A進(jìn)行檢測。
10.如權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的電化學(xué)免疫傳感器或如權(quán)利要求8所述的檢測體系在檢測赭曲霉毒素A中的用途。
【文檔編號】G01N33/577GK104198714SQ201410464586
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年9月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月12日
【發(fā)明者】邱景富, 李朝睿, 張弦 申請人:重慶醫(yī)科大學(xué)