用于進(jìn)行結(jié)合測(cè)定的設(shè)備和方法【專利摘要】本文公開了用于進(jìn)行結(jié)合測(cè)定的組合物、方法、設(shè)備和試劑盒。具體而言，本發(fā)明提供了用于插入到多孔裝置的孔中的插入物、插入物陣列和包含它們的試劑盒。本文還提供了使用本文公開的各種設(shè)備、裝置和試劑盒進(jìn)行結(jié)合測(cè)定的方法?！緦＠f(shuō)明】用于進(jìn)行結(jié)合測(cè)定的設(shè)備和方法奪叉引用[0001]本申請(qǐng)要求提交于2012年5月25日的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)第61/652,102號(hào)的權(quán)益，該申請(qǐng)通過(guò)引用并入于此?！?br>背景技術(shù)：
】[0002]結(jié)合測(cè)定在生物和臨床應(yīng)用中得到廣泛使用，用于檢測(cè)和測(cè)量樣品中存在的分析物的量。結(jié)合測(cè)定一般要求使用與感興趣的分析物結(jié)合的結(jié)合配偶體和與該結(jié)合配偶體結(jié)合的檢測(cè)試劑。在直接結(jié)合測(cè)定中，結(jié)合配偶體偶聯(lián)至檢測(cè)試劑，而間接結(jié)合測(cè)定涉及添加與結(jié)合配偶體相互作用的單獨(dú)的檢測(cè)試劑。一種廣泛使用的結(jié)合測(cè)定形式為連接免疫吸附測(cè)定（LISA)，其中結(jié)合劑固定在固相上。通常，免疫吸附測(cè)定涉及通過(guò)將感興趣的分析物與結(jié)合劑相結(jié)合而將該分析物捕捉到固相上。對(duì)能夠與分析物結(jié)合的檢測(cè)試劑的添加繼而導(dǎo)致檢測(cè)試劑到固相上的后續(xù)捕捉。通常在指示出感興趣的分析物的存在或量的試劑的檢測(cè)之前，在一系列一個(gè)或多個(gè)洗滌步驟中移除未結(jié)合的檢測(cè)試劑。試劑的檢測(cè)可以利用酶促反應(yīng)（ELISA)或熒光檢測(cè)（FLISA)。[0003]ELISA和FLISA通常在用于高通量篩選用途的多孔板（諸如96孔反應(yīng)板）中進(jìn)行。使用多孔板和裝置使得能夠進(jìn)行對(duì)多個(gè)樣品的并行處理，以供對(duì)一種或多種分析物的分析。例如，通常利用ELISA和FLISA來(lái)進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞系的抗體篩選。這些篩選測(cè)定一般涉及雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)基樣品在用感興趣的抗原包被的96孔板中的溫育。在溫育之后，必須在感興趣的抗體的檢測(cè)和陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞系的鑒定之前進(jìn)行涉及與二級(jí)和/或三級(jí)檢測(cè)試劑的另外溫育和洗滌步驟的多步過(guò)程。然而，這些多步測(cè)定是費(fèi)時(shí)的，這限制了檢測(cè)通量。減少這些檢測(cè)所需的步驟并從而減少所需時(shí)間量的裝置和方法將會(huì)大大提高檢測(cè)通量和效率?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0004]因此，本發(fā)明提供將會(huì)允許具有更高通量和效率的更強(qiáng)健的結(jié)合測(cè)定的設(shè)備和方法。本文提供的是提供此類優(yōu)點(diǎn)和相關(guān)益處的組合物、方法、設(shè)備和試劑盒。在一方面，本發(fā)明提供了用于插入到多孔裝置的孔中的插入物。在一些實(shí)施方式中，所述插入物包含基本上不含微孔的內(nèi)表面和外表面；其中所述內(nèi)表面和/或外表面在其上固定有結(jié)合劑；其中所述插入物的尺寸設(shè)置為小于所述孔，使得所述插入物可以插入到所述孔中。[0005]在另一實(shí)施方式中，所述插入物包含內(nèi)表面和外表面，其中所述內(nèi)表面和/或外表面在其上固定有結(jié)合劑，其中所述外表面具有的直徑小于所述孔的直徑，使得所述插入物可以插入到所述孔中；其中所述插入物向多孔裝置的孔中的插入使得所述孔與所述裝置的相鄰孔在光學(xué)上隔離。[0006]在實(shí)施本發(fā)明的過(guò)程中，任何所述插入物可由不透明的材料制成，它們可以為圓柱形、中空的，或者可以包含多個(gè)空腔。[0007]在相關(guān)方面，本發(fā)明提供了用于插入到多孔裝置的多個(gè)孔中的插入物陣列。在一些實(shí)施方式中，所述陣列被配置成使得每個(gè)單獨(dú)的插入物被安裝在連續(xù)的固體框架上，所述框架的尺寸設(shè)置為允許同時(shí)向所述多個(gè)孔的每個(gè)單獨(dú)的孔中插入和任選地移除每個(gè)單獨(dú)的插入物，其中所述單獨(dú)的插入物包含內(nèi)表面和外表面，該內(nèi)表面和外表面中的任一個(gè)或兩個(gè)在其上固定有結(jié)合劑，其中該內(nèi)表面和/或外表面基本上不含微孔。[0008]在備選的實(shí)施方式中，所述陣列被配置成使得每個(gè)單獨(dú)的插入物被安裝在連續(xù)的固體框架上，所述框架的尺寸設(shè)置為允許同時(shí)向所述多個(gè)孔的每個(gè)單獨(dú)的孔中插入和任選地移除每個(gè)單獨(dú)的插入物，其中所述單獨(dú)的插入物包含內(nèi)表面和外表面，該內(nèi)表面和外表面中的任一個(gè)或兩個(gè)在其上固定有結(jié)合劑，其中所述單獨(dú)的插入物向所述單獨(dú)的孔中的插入使得所述孔與所述裝置上的其他相鄰孔在光學(xué)上隔離。[0009]在實(shí)施本發(fā)明的過(guò)程中，任何所述陣列可被塑造成使得所述框架的尺寸設(shè)置為允許同時(shí)向所述多孔裝置的每個(gè)單獨(dú)的孔中插入和移除所述每個(gè)單獨(dú)的插入物。[0010]在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的插入物或陣列的結(jié)合劑包括蛋白質(zhì)、抗體、單克隆抗體、抗原、配體、受體、親和素、生物素、鏈霉親和素或半抗原。[0011]在相關(guān)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了具有多個(gè)孔的多孔裝置，所述多個(gè)孔中的至少一個(gè)包含本文所述的插入物，或者所述多個(gè)孔包含本文所述的插入物陣列。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述多孔裝置具有6、12、24、48、96、384、1536或3456個(gè)孔。[0012]相應(yīng)地，本發(fā)明還提供了測(cè)量孔中液體樣品中存在的分析物的方法。在一些實(shí)施方式中，所述方法包括向含有液體樣品的孔中加入包含可檢測(cè)標(biāo)記的經(jīng)標(biāo)記的示蹤物以形成混合物，其中所述孔中包含本發(fā)明的插入物；使所述分析物和所述結(jié)合劑競(jìng)爭(zhēng)所述示蹤物的結(jié)合一段充足的時(shí)間，以實(shí)現(xiàn)復(fù)合物的形成，該復(fù)合物包含在混合物中的該示蹤物以及該分析物或該結(jié)合劑中之一，其中所述競(jìng)爭(zhēng)導(dǎo)致第一量的所述可檢測(cè)標(biāo)記保留在所述混合物中而第二量的所述可檢測(cè)標(biāo)記被隔離（sequestered)到所述插入物的內(nèi)表面和/或外表面上；以及測(cè)量所述孔中保留在所述混合物中的所述可檢測(cè)標(biāo)記的所述第一量，其中所述第一量與存在于該混合物中的所述分析物的量成比例。[0013]在其他實(shí)施方式中，所述方法包括向含有液體樣品的孔中加入經(jīng)標(biāo)記的示蹤物以形成混合物，其中所述孔中包含本發(fā)明的插入物；使得在所述插入物的內(nèi)表面和/或外表面上形成復(fù)合物，其中該復(fù)合物包含（1)與所述分析物上的第一結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合的經(jīng)標(biāo)記的示蹤物，和（2)與同一分析物上的第二結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合的結(jié)合劑，其中所述形成導(dǎo)致第一量的所述可檢測(cè)標(biāo)記保留在所述混合物中而第二量的所述可檢測(cè)標(biāo)記被隔離到所述插入物的內(nèi)表面和/或外表面上；以及測(cè)量所述孔中保留在所述混合物中的所述可檢測(cè)標(biāo)記的所述第一量，其中所述第一量與存在于該混合物中的所述分析物的量成反比。[0014]在其他實(shí)施方式中，所述方法包括向含有液體樣品的孔中加入包含可檢測(cè)標(biāo)記的經(jīng)標(biāo)記的示蹤物以形成混合物，其中所述孔中包含本發(fā)明的插入物；使所述分析物和所述結(jié)合劑競(jìng)爭(zhēng)所述示蹤物的結(jié)合一段充足的時(shí)間，以實(shí)現(xiàn)復(fù)合物的形成，該復(fù)合物包含在混合物中的該示蹤物以及該分析物或該結(jié)合劑中之一，其中所述競(jìng)爭(zhēng)導(dǎo)致第一量的所述可檢測(cè)標(biāo)記保留在所述混合物中而第二量的所述可檢測(cè)標(biāo)記被隔離到所述插入物的內(nèi)表面和/或外表面上；以及測(cè)量被隔離到所述插入物的內(nèi)表面和/或外表面上的所述可檢測(cè)標(biāo)記的所述第二量，其中所述第二量與存在于該混合物中的所述分析物的量成反比。[0015]在其他實(shí)施方式中，所述方法包括向含有液體樣品的孔中加入包含可檢測(cè)標(biāo)記的經(jīng)標(biāo)記的示蹤物以形成混合物，其中所述孔中包含本發(fā)明的插入物；使得在所述插入物的內(nèi)表面和/或外表面上形成復(fù)合物，其中該復(fù)合物包含（1)與所述分析物上的第一結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合的經(jīng)標(biāo)記的示蹤物，和（2)與同一分析物上的第二結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合的結(jié)合劑，所述形成導(dǎo)致第一量的所述可檢測(cè)標(biāo)記保留在所述混合物中而第二量的所述可檢測(cè)標(biāo)記被隔離到所述插入物的內(nèi)表面和/或外表面上；以及測(cè)量被隔離到所述插入物的內(nèi)表面和/或外表面上的所述可檢測(cè)標(biāo)記的所述第二量，其中所述第二量與存在于該混合物中的所述分析物的量成比例。[0016]在相關(guān)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了在多孔裝置中在分析物和包含可檢測(cè)標(biāo)記的經(jīng)標(biāo)記的示蹤物的混合物中進(jìn)行結(jié)合測(cè)定的方法，該方法包括：向本發(fā)明的陣列的多個(gè)插入物上添加所述經(jīng)標(biāo)記的示蹤物；使所述分析物和所述結(jié)合劑競(jìng)爭(zhēng)所述示蹤物的結(jié)合一段充足的時(shí)間，以實(shí)現(xiàn)復(fù)合物的形成，該復(fù)合物包含在混合物中的該示蹤物以及該分析物或該結(jié)合劑中之一，其中所述競(jìng)爭(zhēng)導(dǎo)致第一量的所述可檢測(cè)標(biāo)記保留在所述混合物中而第二量的所述可檢測(cè)標(biāo)記被隔離到所述插入物的內(nèi)表面和/或外表面上；以及測(cè)量所述多個(gè)孔中保留在所述混合物中的所述可檢測(cè)標(biāo)記的所述第一量，其中所述第一量與存在于該混合物中的所述分析物的量成比例。[0017]在備選的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了在多孔裝置中在分析物和包含可檢測(cè)標(biāo)記的經(jīng)標(biāo)記的示蹤物的混合物中進(jìn)行結(jié)合測(cè)定的方法，該方法包括：向本發(fā)明的陣列的多個(gè)插入物上添加所述經(jīng)標(biāo)記的示蹤物；使得在所述插入物的內(nèi)表面和/或外表面上形成復(fù)合物，其中該復(fù)合物包含（1)與所述分析物上的第一結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合的經(jīng)標(biāo)記的示蹤物，和（2)與同一分析物上的第二結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合的結(jié)合劑，所述形成導(dǎo)致第一量的所述可檢測(cè)標(biāo)記保留在所述混合物中而第二量的所述可檢測(cè)標(biāo)記被隔離到所述插入物的內(nèi)表面和/或外表面上；以及測(cè)量所述多個(gè)孔中保留在所述混合物中的所述可檢測(cè)標(biāo)記的所述第一量，其中所述第一量與存在于該混合物中的所述分析物的量成反比。[0018]在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了鑒定表達(dá)分泌的異源多肽的細(xì)胞的方法，該方法包括：提供包含多個(gè)孔的多孔裝置，其中所述多個(gè)孔中的每個(gè)孔中插有本發(fā)明的插入物，并且其中所述多個(gè)孔中的每個(gè)孔包含細(xì)胞培養(yǎng)基，在該細(xì)胞培養(yǎng)基中已培養(yǎng)有被懷疑表達(dá)所述多肽的細(xì)胞；向所述包含細(xì)胞培養(yǎng)基的多個(gè)孔中加入包含可檢測(cè)標(biāo)記的經(jīng)標(biāo)記的示蹤物以形成混合物；使所述多肽和所述結(jié)合劑競(jìng)爭(zhēng)所述示蹤物的結(jié)合一段充足的時(shí)間，以實(shí)現(xiàn)復(fù)合物的形成，該復(fù)合物包含在混合物中的該示蹤物以及該多肽或該結(jié)合劑中之一，其中所述競(jìng)爭(zhēng)導(dǎo)致第一量的所述可檢測(cè)標(biāo)記保留在所述培養(yǎng)基中而第二量的所述可檢測(cè)標(biāo)記被隔離到所述插入物的內(nèi)表面和/或外表面上；以及測(cè)量所述孔中保留在所述混合物中的所述可檢測(cè)標(biāo)記的所述第一量，其中所述第一量與存在于所述細(xì)胞培養(yǎng)基中的所述多肽的量成比例，由此鑒定表達(dá)分泌的異源多肽的細(xì)胞。[0019]在備選的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了鑒定表達(dá)分泌的異源多肽的細(xì)胞的方法，該方法包括：提供包含多個(gè)孔的多孔裝置，其中所述多個(gè)孔中的每個(gè)孔中插有本發(fā)明的插入物，并且其中所述多個(gè)孔中的每個(gè)孔包含細(xì)胞培養(yǎng)基，在該細(xì)胞培養(yǎng)基中已培養(yǎng)有被懷疑表達(dá)所述多肽的細(xì)胞；向所述包含細(xì)胞培養(yǎng)基的多個(gè)孔中加入包含可檢測(cè)標(biāo)記的經(jīng)標(biāo)記的示蹤物以形成混合物；使得在所述插入物的內(nèi)表面和/或外表面上形成復(fù)合物，其中該復(fù)合物包含（1)與所述多肽上的第一結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合的經(jīng)標(biāo)記的示蹤物，和（2)與同一多肽上的第二結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合的結(jié)合劑，所述形成導(dǎo)致第一量的所述可檢測(cè)標(biāo)記保留在所述培養(yǎng)基中而第二量的所述可檢測(cè)標(biāo)記被隔離到所述插入物的內(nèi)表面和/或外表面上；以及測(cè)量所述孔中保留在所述培養(yǎng)基中的所述可檢測(cè)標(biāo)記的所述第一量，其中所述第一量與存在于該培養(yǎng)基中的所述多肽的量成反比；由此鑒定表達(dá)所述異源多肽的細(xì)胞。[0020]在實(shí)施本發(fā)明的任何方法的過(guò)程中存在多個(gè)實(shí)施方式。在實(shí)施本文所述任何方法的過(guò)程中，保留在所述混合物中的所述可檢測(cè)標(biāo)記的所述第一量可以在不將所述混合物轉(zhuǎn)移到孔外或調(diào)節(jié)所述混合物的內(nèi)容物的情況下進(jìn)行測(cè)量，或者可以在從所述孔中移除插入物后進(jìn)行測(cè)量，或者可以通過(guò)將光引向所述孔中的觀察體積來(lái)測(cè)量，其中所述觀察體積基本上被所述第一量的所述可檢測(cè)標(biāo)記所占據(jù)，但基本上不含所述第二量的所述可檢測(cè)標(biāo)記。[0021]在實(shí)施本發(fā)明任何方法的過(guò)程中，所述可檢測(cè)標(biāo)記可以是放射性探針、光學(xué)可檢測(cè)的標(biāo)記或熒光染料。在本發(fā)明的任何方法的進(jìn)一步實(shí)施方式中，所述分析物是分泌的蛋白質(zhì)。[0022]在另一方面，本發(fā)明提供了用于測(cè)量孔中液體樣品中存在的分析物的設(shè)備，該設(shè)備包含：多孔裝置，其包含（i)其中插入一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的插入物的一個(gè)或多個(gè)孔，其中所述孔包含含有經(jīng)標(biāo)記的示蹤物的混合物，該經(jīng)標(biāo)記的示蹤物包含可檢測(cè)標(biāo)記；讀板儀，其能夠（i)從所述一個(gè)或多個(gè)孔檢測(cè)所述標(biāo)記。當(dāng)期望時(shí)，所述讀板儀包含被編程為產(chǎn)生與所述檢測(cè)的標(biāo)記相對(duì)應(yīng)的信號(hào)的處理器。在一些實(shí)施方式中，所述讀板儀可操作地連接到計(jì)算機(jī)，該計(jì)算機(jī)被配置成（i)從所述讀板儀接收所述信號(hào)；并（ii)從所述信號(hào)生成定量測(cè)量數(shù)據(jù)；以及任選地（iii)將所述定量測(cè)量數(shù)據(jù)中繼到云服務(wù)器。在一些實(shí)施方式中，所述讀板儀能夠被配置成從基本不含所述一個(gè)或多個(gè)插入物的限制的體積中檢測(cè)所述標(biāo)記。在一些實(shí)施方式中，所述讀板儀能夠檢測(cè)放射性標(biāo)記、光學(xué)可檢測(cè)的標(biāo)記、包含熒光染料的標(biāo)記，或者發(fā)光標(biāo)記。[0023]在另一方面，本發(fā)明提供了用于測(cè)量多孔裝置的一個(gè)或多個(gè)孔中的液體樣品中存在的分析物的試劑盒。在一些實(shí)施方式中，所述試劑盒包含一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的插入物；以及關(guān)于使用所述一個(gè)或多個(gè)插入物進(jìn)行結(jié)合測(cè)定以測(cè)量所述分析物的說(shuō)明書。在一些實(shí)施方式中，所述試劑盒進(jìn)一步包含含有可檢測(cè)標(biāo)記的經(jīng)標(biāo)記的示蹤物。在一些實(shí)施方式中，所述經(jīng)標(biāo)記的示蹤物能夠與所述分析物或所述結(jié)合劑形成復(fù)合物。在其他實(shí)施方式中，所述結(jié)合劑能夠與所述分析物在第一結(jié)合位點(diǎn)形成復(fù)合物。在其他實(shí)施方式中，所述經(jīng)標(biāo)記的示蹤物能夠與所述分析物在第二結(jié)合位點(diǎn)形成復(fù)合物。援引并入[0024]本說(shuō)明書中提及的所有出版物、專利和專利申請(qǐng)均通過(guò)引用并入于此，程度猶如具體地和單獨(dú)地指定要通過(guò)引用而并入每個(gè)單獨(dú)的出版物、專利或?qū)＠暾?qǐng)。【專利附圖】【附圖說(shuō)明】[0025]本發(fā)明的新穎特征在隨附權(quán)利要求書中具體闡述。通過(guò)參考以下對(duì)其中利用到本發(fā)明原理的示例說(shuō)明性實(shí)施方式加以詳細(xì)闡述和附圖，將會(huì)對(duì)本發(fā)明的特征和優(yōu)點(diǎn)獲得更好的理解，在附圖中：[0026]圖IA和圖IB描繪了成形為包括多個(gè)空腔的插入物的示例性實(shí)施方式的示意圖。[0027]圖2描繪了位于多孔板的孔中的插入物的示例性實(shí)施方式的示意圖，圖中示出向板和孔中的自頂向下示圖。[0028]圖3A描繪了利用本發(fā)明的插入物的示例性直接競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定的示意圖。[0029]圖3B描繪了利用本發(fā)明的插入物的直接競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定的備選的實(shí)施方式的示意圖。[0030]圖4A描繪了利用本發(fā)明的插入物的示例性?shī)A心結(jié)合測(cè)定的示意圖。[0031]圖4B描繪了利用本發(fā)明的插入物的夾心結(jié)合測(cè)定的備選的實(shí)施方式的示意圖。[0032]圖5描繪了用于進(jìn)行結(jié)合測(cè)定的示例性設(shè)備。[0033]圖6描繪了位于96孔多孔板中的本發(fā)明插入物的示例性實(shí)施方式的照片。[0034]圖7描繪了利用本發(fā)明的插入物的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定的結(jié)果。圖中描繪了熒光強(qiáng)度測(cè)量值相對(duì)于人γ球蛋白濃度的曲線圖，對(duì)利用本發(fā)明插入物的孔與無(wú)插入物的孔作出比較。[0035]圖8描繪了利用本發(fā)明的插入物的夾心結(jié)合測(cè)定的結(jié)果。圖中描繪了熒光強(qiáng)度測(cè)量值相對(duì)于人γ球蛋白濃度的曲線圖。【具體實(shí)施方式】[0036]總體上，本發(fā)明提供了用于在多孔裝置中進(jìn)行結(jié)合測(cè)定以供檢測(cè)感興趣的分析物的組合物、方法和試劑盒。插入物[0037]在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了可插入至多孔裝置的孔中的插入物。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，插入物的尺寸設(shè)置為允許插入多孔裝置的孔中并任選地從其中移除。在具體的實(shí)施方式中，插入物包含尺寸設(shè)置為小于允許插入和移除的孔而不使該孔變形或破裂的外表面。在更具體的實(shí)施方式中，插入物的外表面的尺寸為孔的尺寸的約99.9%或更小、約99.5%或更小、約99%或更小、約95%或更小、約90%或更小、約85%或更小、約80%或更小、約75%或更小、約70%或更小、約65%或更小、約60%或更小、約55%或更小、或約50%或更小。在其他更具體的實(shí)施方式中，插入物的外表面的尺寸為孔的尺寸的約50%-60%、55%-75%、60%-90%、75%-95%或80%-99.9%。[0038]在另一個(gè)實(shí)施方式中，插入物成形為具有底部以及另外的上唇部，該底部具有尺寸設(shè)置為小于孔以允許插入物的底部插入至孔中的外表面，該上唇部具有大于孔的尺寸的外尺寸以允許插入物位于孔內(nèi)而不接觸孔的底表面。在具體的實(shí)施方式中，插入物的底部具有尺寸為孔的尺寸的約99.9%或更小、約99.5%或更小、約99%或更小、約95%或更小、約90%或更小、約85%或更小、約80%或更小、約75%或更小、約70%或更小、約65%或更小、約60%或更小、約55%或更小、或約50%或更小的外表面。在其他更具體的實(shí)施方式中，插入物的底部的外表面具有為孔的尺寸的約50%-60%、55%-75%、60%-90%、75%-95%或80%-99.9%的尺寸。在一些實(shí)施方式中，插入物的上唇部具有為孔的直徑的約100.1%或更高、約100.5%或更高、約101%或更高、約102%或更高、約103%或更高、約104%或更高、約105%或更高、約110%或更高、約115%或更高、約120%或更高、約125%或更高、約130%或更高、約135%或更高、約140%或更高、約145%或更高或約150%的外尺寸。在具體的實(shí)施方式中，插入物的上唇部具有為孔的直徑的約100.1-110%、約101%-120%、約105%-130%、約110%-150%的尺寸。優(yōu)選地，插入物的上唇部的尺寸設(shè)置為允許多個(gè)插入物位于相鄰的孔內(nèi)而這些插入物的上唇部基本不重疊。[0039]在一些實(shí)施方式中，插入物具有包含內(nèi)表面和外表面的中空的形狀，該內(nèi)表面和外表面為將在液體溶液中進(jìn)行的結(jié)合測(cè)定提供足夠的容積，并允許光從多孔裝置的孔中垂直地不受阻礙地通過(guò)到達(dá)檢測(cè)器。在一些實(shí)施方式中，插入物的內(nèi)表面具有為插入物的外表面尺寸的約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、約99.5%、約99.9%的尺寸。插入物可采取多種形狀，包括但不限于圓柱形、正方形、橢圓形、卵形和多面體。在一些實(shí)施方式中，多面體形狀可具有3、4、5、6、7或8個(gè)或更多個(gè)側(cè)面。在一些實(shí)施方式中，多面體形狀為三角形、正方形、矩形、五邊形、六面體、七面體、八面體、十二面體。[0040]在一些實(shí)施方式中，插入物成形為提供多個(gè)空腔。對(duì)于本發(fā)明而言，術(shù)語(yǔ)"空腔"指中空結(jié)構(gòu)的內(nèi)部空間。空腔可布置成多種構(gòu)型。例如，插入物內(nèi)的空腔可被線性壁分割以形成分離但相鄰的隔室，或者被圓形壁分割以形成內(nèi)部和外部環(huán)隔室。圖IA和IB示出了具有多個(gè)空腔的示例性插入物的橫截面。[0041]在一些實(shí)施方式中，插入物可插入至多孔裝置的孔中并任選地從其中移除。多孔裝置是本領(lǐng)域公知的，并且應(yīng)當(dāng)理解，插入物可配置用于插入至任何多孔裝置中并從其中移除。然而，僅為了描述的目的，本文提供了可與本發(fā)明的插入物一起使用的多孔裝置配置的實(shí)例。在一些實(shí)施方式中，多孔裝置為多孔板，例如組織培養(yǎng)板或多孔測(cè)定板。在一些實(shí)施方式中，多孔裝置包含6個(gè)孔、12個(gè)孔、24個(gè)孔、48個(gè)孔、96個(gè)孔、384個(gè)孔、1536個(gè)孔或3456個(gè)孔。需要時(shí)，每個(gè)板的各個(gè)孔可具有均一的尺寸。在備選的實(shí)施方式中，插入物可成形為用于插入至用于進(jìn)行結(jié)合測(cè)定的其他裝置（如單個(gè)小杯）中并任選地從其中移除。插入物的材料：[0042]術(shù)語(yǔ)"微孔"通常指在亞毫米范圍內(nèi)的孔洞。通常，用于多孔裝置中的多孔或微孔插入物可在加入或移除液體時(shí)促進(jìn)孔中不需要的氣泡的形成，并因此可能對(duì)在該孔中進(jìn)行的結(jié)合測(cè)定產(chǎn)生有害的影響。例如，這些氣泡可干擾結(jié)合測(cè)定或提供某種阻礙經(jīng)標(biāo)記的結(jié)合劑的后續(xù)檢測(cè)的光學(xué)干涉。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的插入物基本上不含微孔。在一些實(shí)施方式中，插入物基本上不含直徑在亞毫米范圍內(nèi)的微孔。在一些實(shí)施方式中，插入物基本上不含直徑為約100微米或更小、90微米或更小、80微米或更小、70微米或更小、60微米或更小、50微米或更小、40微米或更小、30微米或更小、20微米或更小、10微米或更小、5微米或更小或1微米或更小的微孔。[0043]在具體的實(shí)施方式中，插入物基本上不含直徑在約0.001-30微米范圍內(nèi)的微孔。在其他具體的實(shí)施方式中，插入物基本上不含直徑在約〇.02-20微米范圍內(nèi)的微孔。在其他實(shí)施方式中，插入物基本上不含直徑在約〇.5-10微米范圍內(nèi)的微孔。[0044]通常，基本上不含微孔的插入物由非微孔材料制成。非微孔材料對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的，并且應(yīng)理解，任何非微孔材料均可用于制備本發(fā)明的插入物。非微孔材料的非限制性實(shí)例包括塑料聚合物、玻璃、纖維素或硝化纖維素、金屬和半導(dǎo)電材料，諸如，例如，硅或鍺?？捎糜谥苽浔景l(fā)明的插入物的塑料聚合物的非限制性實(shí)例包括聚丙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚氨酯、聚二甲基硅氧烷、聚氯乙烯、聚砜、聚甲基丙烯酸甲酯、聚酰亞胺、聚酰胺、聚丙烯腈、聚丁二烯、聚丁烯、聚己內(nèi)酰胺、聚三氟氯乙烯、聚乙烯聚四氟乙烯、聚對(duì)苯二甲酸二乙醋（polyethyleneterephathalate)、聚偏二氯乙稀、聚異丁稀、聚稀徑、聚合的聚異氰酸醋（polymericpolyisocyanate)、聚氟乙稀?？捎糜谥苽洳迦胛锏姆嵌嗫撞牧系钠渌窍拗菩詫?shí)例包括丙稀腈-丙稀酸劑-苯乙稀（acrylonitrile-acryloid-styrene)、丙稀腈-氯化乙稀-苯乙稀和丙稀腈-丁二稀-苯乙稀。在一些情況下，用于制備插入物的材料可被改性以包含交聯(lián)或其他用于固定結(jié)合劑的連接體部分。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，插入物由購(gòu)自Graingers(目錄號(hào)2vdn6和2vdp4)的外徑為6mm且內(nèi)徑為4mm的塑料管制成。[0045]多孔裝置中結(jié)合測(cè)定的分析通常涉及對(duì)來(lái)自多個(gè)或相鄰孔的信號(hào)（例如，光）的檢測(cè)。阻止孔之間的串?dāng)_將會(huì)改善結(jié)合測(cè)定測(cè)量的精確度。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，插入物基本上阻止光通過(guò)插入物材料的透射。在一些實(shí)施方式中，插入物基本上阻止可見(jiàn)光的透射。在其他實(shí)施方式中，插入物基本上阻止紫外線的透射。在其他實(shí)施方式中，插入物基本上阻止紅外線的透射。在更具體的實(shí)施方式中，插入物基本上阻止可見(jiàn)光、紫外線和紅外線的透射。需要時(shí)，在一些實(shí)施方式中，插入物是不透明的。[0046]在一些實(shí)施方式中，由于將一種或多種色素引入插入物材料中，因此插入物是不透明的?？赏ㄟ^(guò)將色素附著至插入物的任何已知的方法將一種或多種色素引入插入物材料中。色素的附著可為通過(guò)共價(jià)鍵、非共價(jià)相互作用，或者通過(guò)將一種或多種色素沉積到插入物的內(nèi)表面和/或外表面上。在一些實(shí)施方式中，所述色素為染料。不透明的色素和染料是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，可通過(guò)多個(gè)供應(yīng)商商購(gòu)獲得，諸如，例如，由Epolin，Inc.提供的Epolight7276FVisibleOpaqeDye。常用的色素的其他非限制性實(shí)例包括提供白色色素沉著的二氧化鈦，以及提供黑色色素沉著的碳黑、炭黑、烏木、象牙黑和縞瑪瑙（onyx)。插入物的陣列[0047]多孔裝置通常用于對(duì)單個(gè)樣品進(jìn)行的多個(gè)結(jié)合測(cè)定、或?qū)Χ鄠€(gè)樣品進(jìn)行的單個(gè)結(jié)合測(cè)定、或?qū)Χ鄠€(gè)樣品進(jìn)行的多個(gè)測(cè)定的平行處理。在另一方面，本發(fā)明提供了本文所述的插入物的陣列，其可向多孔裝置的多個(gè)孔中同時(shí)插入并任選地從其中移除。在一些實(shí)施方式中，將陣列中的每個(gè)單獨(dú)的插入物安裝至連續(xù)的固體框架上。在一些實(shí)施方式中，該框架為具有與多孔裝置的外尺寸基本相同的外尺寸的、基本上是平的框架。在一些實(shí)施方式中，該框架包含尺寸設(shè)置為基本上與多孔裝置的孔的尺寸匹配的均勻的孔洞。在一些情況下，當(dāng)框架正好位于多孔裝置的頂部時(shí)，該框架的均勻的孔洞與該裝置的孔對(duì)準(zhǔn)。在一些情況下，插入物的尺寸設(shè)置為穩(wěn)定地適配于框架的孔洞中。例如，單獨(dú)的插入物將具有尺寸設(shè)置為適配通過(guò)框架的孔并插入至多孔裝置的孔中的底部，并且還將具有尺寸設(shè)置為大于框架的孔洞的尺寸以使插入物能夠位于框架內(nèi)的上唇部。在這種示例性的配置中，各個(gè)單獨(dú)的插入物可同時(shí)插入至孔中，并任選地從孔中移除。在一些情況下，插入物牢固地附接至框架，以使插入物和框架作為可插入至多孔裝置并任選地從其中移除的一個(gè)單元起作用。分析物[0048]在本發(fā)明的另一個(gè)方面，插入物具有固定于其上用于液體樣品中分析物的檢測(cè)的結(jié)合劑。該分析物可以是，但不限于蛋白質(zhì)、糖蛋白、多肽（包括其片段）、多糖、脂質(zhì)、核酸、生物顆粒、細(xì)胞區(qū)室、細(xì)胞、合金金屬或其他元件，或它們的任意組合。分析物還可以是，例如，藥物、前藥、藥劑、藥物代謝物、生物標(biāo)志物（例如，表達(dá)的蛋白質(zhì)或細(xì)胞標(biāo)志物、抗體或抗體片段、血清蛋白質(zhì)、細(xì)胞表面受體、受體配體或其功能性基序）。在一些實(shí)施方式中，分析物為分泌的蛋白質(zhì)。分泌的蛋白質(zhì)的非限制性實(shí)例包括激素、生長(zhǎng)因子、神經(jīng)遞質(zhì)、抗體、分泌的酶、分泌的毒素或任何包含將蛋白質(zhì)靶向至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的信號(hào)序列的分泌的蛋白質(zhì)。激素的非限制性實(shí)例包括褪黑激素、甲狀腺激素、腎上腺素、繆勒氏管抑制激素（antimullerianhormone)、脂聯(lián)素、促腎上腺皮質(zhì)激素、血管緊張素、抗利尿激素（加壓素）、心房鈉尿肽（atrial-natriureticpeptide)、降媽素、縮膽囊素、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（cortocotropin-releasinghormone)、促紅細(xì)胞生成素、促卵泡激素、胃泌素、生長(zhǎng)素釋放肽（ghrelin)、胰高血糖素、促性腺激素釋放激素、生長(zhǎng)激素、人絨毛膜促性腺激素、生長(zhǎng)激素、人胎盤催乳素、抑制素、胰島素、胰島素樣生長(zhǎng)因子、瘦素、黃體生成素(leutenizinghormone)、黑素細(xì)胞刺激激素、食欲肽（orexin)、催產(chǎn)素、甲狀旁腺激素、催乳素、松弛素、促胰液素（secretin)、促生長(zhǎng)素抑制素、血小板生成素、促甲狀腺激素、促甲狀腺激素釋放激素、皮質(zhì)醇、醛固酮、睪酮、脫氫表雄酮、雙氫睪酮、雌激素、孕酮、前列腺素、白三烯、內(nèi)皮素、腎素。生長(zhǎng)因子的非限制性實(shí)例包括腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、膠質(zhì)細(xì)胞系源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、血小板源性生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子α或β、腫瘤壞死因子α、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、胎盤生長(zhǎng)因子、白細(xì)胞介素1-7等。分泌的酶的非限制性實(shí)施包括消化酶，如蛋白酶、肽酶、脂肪酶、糖酶、核酸酶、I型分泌的蛋白質(zhì)、II型分泌的蛋白質(zhì)、III型分泌的蛋白質(zhì)、IV型分泌的蛋白質(zhì)、V型分泌的蛋白質(zhì)、VI型分泌的蛋白質(zhì)、植物分泌的蛋白質(zhì)等。分泌的毒素的非限制性實(shí)例包括耐熱腸毒素（heat-stableenterotoxin)、溶血素、膽固醇依賴型溶細(xì)胞素、RTX毒素、白喉毒素、霍亂毒素、百日咳毒素、透明質(zhì)酸酶、膠原酶等。在具體的實(shí)施方式中，分泌的蛋白質(zhì)是分泌的抗體。在更具體的實(shí)施方式中，分泌的抗體是單克隆抗體。結(jié)合劑[0049]多種結(jié)合劑可用于本發(fā)明。結(jié)合劑的選擇可取決于所測(cè)定的分析物。結(jié)合劑可以是，但不限于蛋白質(zhì)、糖蛋白、多肽、蛋白質(zhì)或肽片段、多糖、脂質(zhì)、核酸、生物顆粒、細(xì)胞區(qū)室、細(xì)胞或其任意組合。結(jié)合劑也可以是，例如，藥物、前藥、藥劑、藥物代謝物、生物標(biāo)志物(例如，表達(dá)的蛋白質(zhì)或細(xì)胞標(biāo)志物、抗體或抗體片段、血清蛋白質(zhì)、細(xì)胞表面受體、受體配體或其功能性基序）、配體、受體或半抗原。在一些情況下，結(jié)合劑包含親和素、生物素或鏈霉親和素。在一些實(shí)施方式中，結(jié)合劑是分泌的蛋白質(zhì)。本文提供了分泌的蛋白質(zhì)的非限制性實(shí)例。[0050]通常，結(jié)合劑的選擇將取決于用戶的需要和將要采用的結(jié)合測(cè)定的類型。一種常見(jiàn)的結(jié)合測(cè)定類型是夾心測(cè)定，其中結(jié)合劑與分析物結(jié)合，而分析物進(jìn)一步與經(jīng)標(biāo)記的示蹤物結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，結(jié)合劑基于其選擇性結(jié)合所研宄的分析物的能力而被選擇。例如，如果分析物是抗體，則結(jié)合劑包含能夠與該抗體選擇性相互作用的抗原。對(duì)于另一個(gè)例子，如果分析物是分泌的蛋白質(zhì)（例如，胰島素），則結(jié)合劑是能夠與該分泌的蛋白質(zhì)結(jié)合的抗體（例如，抗胰島素抗體）。[0051]另一種常見(jiàn)的結(jié)合測(cè)定類型是競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定，其中結(jié)合劑與分析物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合經(jīng)標(biāo)記的示蹤物。因此，在一些實(shí)施方式中，結(jié)合劑被選擇為包含與分析物具有類似的結(jié)合經(jīng)標(biāo)記的示蹤物的能力的基序、分子、生物顆粒、物質(zhì)或其他結(jié)構(gòu)。在其他實(shí)施方式中，示蹤物用作參考來(lái)指導(dǎo)比參考化合物更好地結(jié)合的化合物的選擇。在特定實(shí)施方式中，結(jié)合劑是與分析物相同的物質(zhì)。例如，如果分析物是抗體，則抗原包含相同的抗體。在其他實(shí)施方式中，結(jié)合劑是與分析物不同的物質(zhì)，但與分析物具有類似的針對(duì)經(jīng)標(biāo)記的示蹤物的結(jié)合親和力。結(jié)合劑向插入物上的固定[0052]用于將結(jié)合劑固定在固體表面上的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。通常，任何合適的固定方法可以用于將結(jié)合劑固定至本發(fā)明的插入物上。例如，已知許多技術(shù)用于通過(guò)共價(jià)鍵、非共價(jià)鍵或吸附將核酸和/或肽固定至固體表面上，或固定至連接體部分，或固定至被固定的部分。這類技術(shù)在以下文獻(xiàn)中有描述，例如，Beier等人，NucleicAcidsRes.27:1970-1-977(1999)，Joos等人，Anal.Chem.247:96-101(1997)，Guschin等人，Anal.Biochem.250:203-211(1997)，Bhatia等人1998,AnalyticalBiochemistry,178408-13，Tedeschi等人2003,BiosensorsandBioelectronics，（19)85-93，MethodsMol.Biol.Vol.20(1993)，Tischer和Wedekind.,TopicsinCurrentChemistry200:95-126(1999)，所有這些文獻(xiàn)均通過(guò)引用并入本文。[0053]在一些實(shí)施方式中，通過(guò)交聯(lián)劑將結(jié)合劑固定到插入物上。在一些實(shí)施方式中，該交聯(lián)劑是具有至少兩個(gè)反應(yīng)性末端以將結(jié)合劑連接至固體支持材料上的分子。通常，適當(dāng)?shù)慕宦?lián)劑的選擇通過(guò)將交聯(lián)劑的反應(yīng)性末端與固體支持材料的官能團(tuán)并且與結(jié)合劑的官能團(tuán)進(jìn)行匹配來(lái)獲知。在一些情況下，交聯(lián)劑包含對(duì)蛋白質(zhì)上共同的官能團(tuán)具有特異性的反應(yīng)性基團(tuán)，例如，羧基、胺、巰基或羥基。這些反應(yīng)性基團(tuán)可用來(lái)將蛋白質(zhì)性結(jié)合劑交聯(lián)至固體支持物，例如本發(fā)明的插入物。交聯(lián)劑反應(yīng)性基團(tuán)的非限制性實(shí)例包括η-羥基琥珀酰亞胺酯（NHS酯）、亞氨酸酯、馬來(lái)酰亞胺、鹵代乙?；⑦拎せ蚧?、五氟苯基酯、羥甲基膦、硫代磺酸酯、乙烯基磺酸酯、酰肼、烷氧基胺、芳基疊氮化物、異氰酸酯、二琥珀酰亞胺基辛二酸醋和雙B丫丙啶（diazirines)。[0054]在其他實(shí)施方式中，如果結(jié)合劑是糖蛋白，則可以使用為了固定目的利用碳水化合物基團(tuán)將糖蛋白（即，包含碳水化合物側(cè)鏈的蛋白質(zhì)）固定到插入物上的方法。例如，凝集素在本領(lǐng)域中是已知的，并用來(lái)將碳水化合物基團(tuán)固定到固體支持物上。在一個(gè)實(shí)施方式中，插入物由凝集素修飾的非微孔性材料制成，用于糖蛋白結(jié)合劑的固定。[0055]在另外其他的實(shí)施方式中，結(jié)合劑包含親和結(jié)合標(biāo)簽。親和標(biāo)簽的非限制性實(shí)例包括IgG結(jié)合域、組氨酸標(biāo)簽、精氨酸標(biāo)簽、纖維素結(jié)合域、鏈霉親和素、鏈霉親和素結(jié)合域、生物素、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST)標(biāo)簽等等。[0056]在其他實(shí)施方式中，通過(guò)將插入物與包被緩沖液和結(jié)合劑一起溫育而將結(jié)合劑固定到插入物上。在結(jié)合劑包含交聯(lián)劑或親和結(jié)合標(biāo)簽的一些情況下，包被緩沖液包含對(duì)該交聯(lián)劑或結(jié)合標(biāo)簽具有親和力的試劑。例如，如果親和結(jié)合標(biāo)簽包含GST，則包被緩沖液中的試劑包含GST結(jié)合試劑，例如，抗-GST抗體或谷胱甘肽。在親和結(jié)合標(biāo)簽包含鏈霉親和素的一些情況下，包被緩沖液中的試劑是生物素。在親和結(jié)合標(biāo)簽是組氨酸標(biāo)簽的其他情況下，包被緩沖液中的試劑是與組氨酸相互作用的金屬，例如，銅或鎳。對(duì)于另一個(gè)例子，如果結(jié)合劑包含交聯(lián)劑，則包被緩沖液包含與該交聯(lián)劑結(jié)合的試劑。例如，在交聯(lián)劑包含巰基的一些情況下，包被緩沖液包含與巰基形成穩(wěn)定的硫酯鍵的活化的馬來(lái)酰亞胺。[0057]用于將結(jié)合劑固定到固體表面上的非特異性包被緩沖液也是本領(lǐng)域已知的，并且包括，例如，堿性碳酸鹽緩沖液、堿性磷酸鹽緩沖液或基于tris的堿性緩沖液。在一些實(shí)施方式中，包被緩沖液是具有摩爾濃度為約0.05M、0.06M、0.07M、0.08M、0.09M、0.IM或0.2M碳酸鈉的碳酸鹽緩沖液。在一些實(shí)施方式中，該碳酸鹽緩沖液是碳酸鈉緩沖液、碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖液或碳酸氫鈉緩沖液。在一些實(shí)施方式中，包被緩沖液具有約7.5或更高、約8.O或更高、約8.5或更高或者約9.O或更高的pH。在其他實(shí)施方式中，包被緩沖液具有約7.5-9、約8-9.5或約9-10的pH。在特定實(shí)施方式中，包被緩沖液是pH約9-10的碳酸鈉緩沖液。在其他實(shí)施方式中，包被緩沖液是磷酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖鹽水、基于tris的緩沖液或tris-緩沖鹽水。包被緩沖液的非限制性實(shí)例包括0.2M碳酸氫鈉，pH9.4;PBS-50mM磷酸鹽，pH0,0·15MNaCl;碳酸鹽-碳酸氫鹽；含有L7mMNaH2P04、98mMNa2HPO4.7H20、0·1%NaN3的磷酸鹽緩沖液，pH8·5;TBS-50mMTRIS，pH8·0,0·15MNaCl。[0058]圖2描繪了用于插入到多孔裝置（200)的孔中的插入物的特定實(shí)施方式的示意圖。該插入物可用于進(jìn)行結(jié)合測(cè)定。插入物210的尺寸設(shè)置為用于插入并任選地從孔（220)中移除，并且進(jìn)一步在內(nèi)表面和外表面上已固定有結(jié)合劑（230)。液體樣品[0059]在本發(fā)明的另一方面，利用插入物在含有液體樣品的孔中進(jìn)行結(jié)合測(cè)定。通常，該液體樣品可以是被懷疑含有感興趣的分析物的任何液體。在一些實(shí)施方式中，該液體樣品是體液樣品，例如，血液、血清、血漿、唾液、尿液、羊水、房水、玻璃體液、膽汁、乳汁、腦脊髓液、耵聹、內(nèi)淋巴、外淋巴、精液、女性射出液、胃液、粘液、腹膜液、胸膜液、皮脂、汗液、淚液、陰道分泌物或嘔吐物。在其他實(shí)施方式中，該液體樣品是蛋白質(zhì)樣品或DNA樣品。在其他實(shí)施方式中，該液體樣品是裂解的細(xì)胞樣品。在特定的實(shí)施方式中，該液體樣品是被懷疑攜帶分析物的細(xì)胞培養(yǎng)基。經(jīng)標(biāo)記的示蹤物[0060]進(jìn)行結(jié)合測(cè)定的一般方法利用包含可檢測(cè)標(biāo)記的經(jīng)標(biāo)記的示蹤物。對(duì)于本發(fā)明而言，術(shù)語(yǔ)"經(jīng)標(biāo)記的示蹤物"被定義為能夠在結(jié)合測(cè)定中用于檢測(cè)分析物的實(shí)體，其中示蹤物另外包含可檢測(cè)標(biāo)記。對(duì)標(biāo)記的檢測(cè)和測(cè)量可用來(lái)確定分析物的存在、不存在或量。在結(jié)合測(cè)定是競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定的一些實(shí)施方式中，經(jīng)標(biāo)記的示蹤物能夠與分析物結(jié)合或與結(jié)合劑結(jié)合。在特定實(shí)施方式中，經(jīng)標(biāo)記的示蹤物能夠以類似的親和力與分析物或結(jié)合劑結(jié)合。僅舉例來(lái)說(shuō)，如果分析物和結(jié)合劑是特定的抗體，則示蹤物包含能夠結(jié)合該抗體的標(biāo)記的抗原。舉另一個(gè)例子，如果分析物和結(jié)合劑是特定的抗原，則示蹤物包含能夠結(jié)合該抗原的標(biāo)記的抗體。[0061]在結(jié)合測(cè)定是夾心測(cè)定的一些實(shí)施方式中，如果結(jié)合劑能夠在第一位點(diǎn)結(jié)合分析物，則選擇經(jīng)標(biāo)記的示蹤物以使其能夠與分析物在第二位點(diǎn)結(jié)合。在其他實(shí)施方式中，經(jīng)標(biāo)記的示蹤物能夠與分析物在第二位點(diǎn)結(jié)合，并且對(duì)結(jié)合劑沒(méi)有或幾乎沒(méi)有親和力。僅舉例來(lái)說(shuō)，如果分析物是抗原，并且結(jié)合劑是能夠在特定表位處結(jié)合該抗原的抗體，則經(jīng)標(biāo)記的示蹤物是能夠在不同的表位處結(jié)合該抗原的第二抗體。在任一種情況下，經(jīng)標(biāo)記的示蹤物均可包含但不限于蛋白質(zhì)、糖蛋白、多肽、多糖、脂質(zhì)、核酸或其任意組合。經(jīng)標(biāo)記的示蹤物還可包含，例如，藥物、前藥、藥劑、藥物代謝物、生物標(biāo)志物（例如，表達(dá)的蛋白質(zhì)或細(xì)胞標(biāo)志物、抗體或抗體片段、血清蛋白質(zhì)、細(xì)胞表面受體、受體配體或其功能性基序）。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)標(biāo)記的示蹤物是分泌的蛋白質(zhì)。在本文中描述了分泌的蛋白質(zhì)的例子。[0062]在一些實(shí)施方式中，經(jīng)標(biāo)記的示蹤物是偶聯(lián)至可檢測(cè)標(biāo)記的分子。有多種標(biāo)記可用于本發(fā)明，標(biāo)記的選擇取決于所需的靈敏度、偶聯(lián)的難易程度、穩(wěn)定性需要、可獲得的儀器和檢測(cè)方法以及處置的提供。[0063]在一些實(shí)施方式中，可檢測(cè)標(biāo)記包含熒光染料。通常，熒光染料包含吸收第一波長(zhǎng)范圍的光能并且重新發(fā)射第二波長(zhǎng)范圍內(nèi)的光的熒光團(tuán)。在一些實(shí)施方式中，該熒光染料是氧雜蒽類衍生物，諸如，例如，熒光素、若丹明、TRITC、X_若丹明、麗絲胺若丹明B、俄勒岡綠或德克薩斯紅。在其他實(shí)施方式中，該熒光染料是花菁衍生物，諸如，例如，花菁、吲哚羰花菁、氧雜羰花菁、硫雜羰花菁（thiacarbocyanine)或部花青。在另外其他的實(shí)施方式中，該熒光染料是萘衍生物，諸如，例如，丹?；騞rodan衍生物。在其他實(shí)施方式中，該熒光染料是香豆素衍生物。在其他實(shí)施方式中，該熒光染料是噁二唑衍生物，諸如，例如，吡啶基噁唑、硝基苯并噁二唑或苯并噁二唑。在其他實(shí)施方式中，該熒光染料是噁嗪衍生物，諸如，例如，尼羅紅、尼羅藍(lán)或噁嗪170。熒光染料的其他例子包括，例如，CF染料（Biotium-參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利號(hào)8148518、8092784、7803943、7601498、7776567,均通過(guò)引用而并入）、BODIPY(Invitrogen)、DyLightFluor(Thermoscientific)、Atto和Tracy(SigmaAldrich)、FluoProbes(Interchim)、DY和MegaStokes染料（Dyomics)、Seatau和Square染料（SETABioMedicals)、Quasar和CalFluor染料（BiosearchTechnologies)、太平洋藍(lán)（PacificBlue)、太平洋橙（PacificOrange)、螢光黃或別藻藍(lán)蛋白。[0064]在另外其他的實(shí)施方式中，所述熒光染料包含吲哚鑰環(huán)體系，其中吲哚鑰環(huán)的3-碳上的取代基包含化學(xué)反應(yīng)性基團(tuán)或偶聯(lián)的物質(zhì)。在更具體的實(shí)施方式中，該熒光染料是AlexaFluor染料，諸如，例如，AlexaFluor350、AlexaFluor405、AlexaFluor430、AlexaFluor488、AlexaFluor532、AlexaFluor546、AlexaFluor555、AlexaFluor568、AlexaFluor594、AlexaFluor610、AlexaFluor633、AlexaFluor635、AlexaFluor647、AlexaFluor660、AlexaFluor680、AlexaFluor.700、AlexaFluor750或AlexaFluor790〇[0065]在其他實(shí)施方式中，可檢測(cè)標(biāo)記包含熒光蛋白。熒光蛋白是本領(lǐng)域公知的。熒光蛋白的非限制性實(shí)例包括Y66H、Y66F、EGFP、EGFP2、Azurite、GFP、T-Sapphire、Cerulean、CFP、TagCFP、TurboCFP、ECFP、CyPet、Y66W、mKeima-Red、AmCyanl、TFPl、Midori-ishiCyan、GFP、TurboGFP、TagGFP、EGFP、S65C、S65L、Emerald、S65T、AzamiGreen、ZsGreenl、YFP、TagYFP、EYFP、TurboYFP、Topaz、Venus、mCitrine、m0range、RFP、TagRFP、TurboRFP、DsRecUmStrawberry、R-藻紅蛋白、B-藻紅蛋白、mCherry、Pe;ridininChlorophyll(PerCP)、mPlum、mOrange或mRaspberry。[0066]在其他實(shí)施方式中，可檢測(cè)標(biāo)記包含發(fā)光或化學(xué)發(fā)光標(biāo)簽。常見(jiàn)的發(fā)光/化學(xué)發(fā)光標(biāo)簽包括但不限于過(guò)氧化物酶，如辣根過(guò)氧化物酶（HRP)、大豆過(guò)氧化物酶（SP)、堿性磷酸酶和螢光素酶。只要給予適當(dāng)?shù)牡孜铮ɡ?，氧化試劑加化學(xué)發(fā)光化合物），這些蛋白質(zhì)標(biāo)簽?zāi)軌虼呋瘜W(xué)發(fā)光反應(yīng)。已知許多化合物家族在多種條件下提供化學(xué)發(fā)光?；瘜W(xué)發(fā)光化合物家族的非限制性實(shí)例包括2,3-二氫-1，4-酞嗪二酮魯米諾，5-氨基-6,7,8-三甲氧基-和二甲基氨基[ca]苯并類似物。這些化合物在堿性過(guò)氧化氫或次氯酸媽和堿的存在下能夠發(fā)光?；瘜W(xué)發(fā)光化合物家族的其他實(shí)例包括，例如，2,4,5-三苯基咪唑，對(duì)二甲基氨基和-甲氧基取代基，草酸酯，如草?；钚怎?，對(duì)硝基苯基，N-烷基吖啶酯，螢光素，光澤精(Iucigenins)，或吖啶酯。化學(xué)發(fā)光蛋白質(zhì)標(biāo)簽的許多底物是本領(lǐng)域公知且可商購(gòu)獲得的，并且應(yīng)當(dāng)理解，化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的任何合適的底物都可以在本發(fā)明中使用。[0067]用于將可檢測(cè)標(biāo)記偶聯(lián)或耦合到分子上的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，并且可用來(lái)制備經(jīng)標(biāo)記的示蹤物。在一些實(shí)施方式中，標(biāo)記通過(guò)間接手段連接。在特定實(shí)施方式中，標(biāo)記通過(guò)以下步驟連接：（1)配體分子與聚合物共價(jià)結(jié)合。（2)配體與抗配體分子結(jié)合，該抗配體分子可以是本身可檢測(cè)的，或者可以共價(jià)地結(jié)合至信號(hào)系統(tǒng)。許多配體/抗配體組合是本領(lǐng)域中已知并可獲得的，例如，生物素/鏈霉親和素、甲狀腺素/甲狀腺素結(jié)合球蛋白、半抗原/抗體或抗原/抗體。信號(hào)系統(tǒng)的例子包括，例如，可檢測(cè)的酶或化學(xué)發(fā)光化合物。在其他實(shí)施方式中，可檢測(cè)標(biāo)記與分子的偶聯(lián)涉及分子克隆，例如，重組DNA技術(shù)。進(jìn)行結(jié)合測(cè)定的方法[0068]在另一方面，本發(fā)明提供了使用本文所述的單獨(dú)的插入物或插入物陣列來(lái)測(cè)量存在于多孔裝置的一個(gè)孔或多個(gè)孔中的液體樣品中的分析物的方法。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種在競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定中使用插入物或插入物陣列的方法。圖3A提供了使用本發(fā)明的插入物或插入物陣列（300)的示例性競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定的示意圖。在一些實(shí)施方式中，該方法包括向包含液體樣品320的孔中加入包含可檢測(cè)標(biāo)記的經(jīng)標(biāo)記的示蹤物310。在使用插入物陣列的一些實(shí)施方式中，該方法包括向包含多個(gè)液體樣品320的多個(gè)孔中加入包含可檢測(cè)標(biāo)記的經(jīng)標(biāo)記的示蹤物310。在一些實(shí)施方式中，液體樣品被懷疑含有分析物330，分析物330以淺灰色圓形示出。在一些實(shí)施方式中，所述孔包含其上固定有結(jié)合劑350的插入物340。在使用插入物陣列的一些實(shí)施方式中，所述多個(gè)孔包含其上固定有結(jié)合劑350的插入物340的陣列。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)標(biāo)記的示蹤物能夠與分析物結(jié)合并且另外能夠與結(jié)合劑結(jié)合。在特定實(shí)施方式中，經(jīng)標(biāo)記的示蹤物能夠以類似的親和力與分析物和結(jié)合劑結(jié)合。在特定實(shí)施方式中，結(jié)合劑與分析物是相同類型的分子，因此，經(jīng)標(biāo)記的示蹤物能夠與兩者以基本相等的親和力結(jié)合。在更具體的實(shí)施方式中，分析物本身不具有對(duì)結(jié)合劑的顯著的結(jié)合親和力。在一些實(shí)施方式中，向液體樣品中加入經(jīng)標(biāo)記的示蹤物形成了包含液體樣品320、分析物330和經(jīng)標(biāo)記的示蹤物310的混合物。[0069]在一些實(shí)施方式中，所述方法進(jìn)一步包括將混合物溫育足夠的一段時(shí)間，從而允許分析物和結(jié)合劑競(jìng)爭(zhēng)經(jīng)標(biāo)記的示蹤物的結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，該溫育步驟包括溫育約0、0·5、1、1·5、2、3、4、5、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24小時(shí)或更長(zhǎng)。在需要時(shí)，該溫育步驟包括溫育約24小時(shí)或更長(zhǎng)。該溫育步驟也可進(jìn)行不到約24小時(shí)、不到約20小時(shí)、不到約16小時(shí)、不到約12小時(shí)、不到約8小時(shí)、不到約4小時(shí)、不到約2小時(shí)、不到約1.5小時(shí)、不到約1小時(shí)、不到約0.5小時(shí)。在另外其他的實(shí)施方式中，該溫育步驟包括溫育約0.5-2小時(shí)、約1-4小時(shí)、約2-8小時(shí)、約4-12小時(shí)、約8-24小時(shí)或更長(zhǎng)。溫育可在任何適合于給定測(cè)定的溫度，例如約37攝氏度、約室溫或約20-25攝氏度下進(jìn)行。在另外其他的實(shí)施方式中，該溫育步驟包括在約4攝氏度下溫育。在一些實(shí)施方式中，該溫育步驟包括振蕩和/或搖動(dòng)。在其他實(shí)施方式中，該溫育步驟不需要振蕩或搖動(dòng)。在特定的實(shí)施方式中，該溫育步驟包括在進(jìn)行或不進(jìn)行振蕩和/或搖動(dòng)的情況下，在約37攝氏度下溫育0.5-2小時(shí)。在另一個(gè)特定的實(shí)施方式中，該溫育步驟包括在進(jìn)行或不進(jìn)行振蕩和/或搖動(dòng)的情況下，在室溫（例如，20-25攝氏度）下溫育約1-12小時(shí)。在另一個(gè)特定的實(shí)施方式中，該溫育步驟包括在進(jìn)行或不進(jìn)行振蕩和/或搖動(dòng)的情況下，在約4攝氏度下溫育約8-24小時(shí)或更長(zhǎng)。在一些實(shí)施方式中，所述競(jìng)爭(zhēng)導(dǎo)致形成一個(gè)或多個(gè)包含經(jīng)標(biāo)記的示蹤物和分析物的復(fù)合物360。在其他實(shí)施方式中，所述競(jìng)爭(zhēng)導(dǎo)致形成一個(gè)或多個(gè)包含經(jīng)標(biāo)記的示蹤物和結(jié)合劑的復(fù)合物370。在另外其他的實(shí)施方式中，所述競(jìng)爭(zhēng)導(dǎo)致形成一個(gè)或多個(gè)復(fù)合物360和一個(gè)或多個(gè)復(fù)合物370。在一些實(shí)施方式中，一個(gè)或多個(gè)復(fù)合物370被隔離到或結(jié)合到插入物的內(nèi)表面和/或外表面上，而一個(gè)或多個(gè)復(fù)合物360保留在混合物中。對(duì)于本發(fā)明而言，短語(yǔ)"保持在混合物中"或"保留在混合物中"是指在混合物中基本保持自由漂浮并且未結(jié)合到插入物上。[0070]在一些實(shí)施方式中，所述方法進(jìn)一步包括測(cè)量孔中保留在混合物中的可檢測(cè)標(biāo)記的量。在一些情況下，保留在混合物中的可檢測(cè)標(biāo)記的量與存在于液體樣品中的分析物的量成比例。在特定實(shí)施方式中，對(duì)保留在混合物中的可檢測(cè)標(biāo)記的量的測(cè)量基本上排除了測(cè)量被隔離到或結(jié)合到插入物的內(nèi)表面和/或外表面上的可檢測(cè)標(biāo)記的量。在更具體的實(shí)施方式中，通過(guò)在不含插入物的檢測(cè)區(qū)380中進(jìn)行測(cè)量而排除了測(cè)量被隔離到插入物上的標(biāo)記的量。在另外其他的【具體實(shí)施方式】中，通過(guò)在測(cè)量步驟之前移除插入物而排除了測(cè)量被隔離到插入物上的標(biāo)記的量。[0071]在圖3B所示的備選的實(shí)施方式301中，所述方法與如上描述的方法基本相同，不同之處在于，該方法并非測(cè)量保留在溶液中的可檢測(cè)標(biāo)記的量，而是包括通過(guò)在包含插入物的檢測(cè)區(qū)390中進(jìn)行測(cè)量而測(cè)量孔中被隔離到插入物上的可檢測(cè)標(biāo)記的量。在特定的備選的實(shí)施方式中，在檢測(cè)區(qū)390中進(jìn)行測(cè)量基本上排除了保留在混合物中的可檢測(cè)標(biāo)記的量。在這些備選的實(shí)施方式中，被隔離到插入物上的可檢測(cè)標(biāo)記的量與存在于液體樣品中的分析物的量成反比。在一些實(shí)施方式中，在溫育步驟后，包含孔的裝置在約4攝氏度下儲(chǔ)存任意合適的一段時(shí)間，之后進(jìn)行分析物的測(cè)量。[0072]在另一方面，本發(fā)明提供了在夾心型測(cè)定中使用單獨(dú)的插入物或插入物陣列的方法。圖4A提供了使用本發(fā)明的插入物或插入物陣列（400)的示例性?shī)A心型結(jié)合測(cè)定的示意圖。在一些實(shí)施方式中，該方法包括向包含液體樣品420的孔中加入包含可檢測(cè)標(biāo)記的經(jīng)標(biāo)記的示蹤物410。在使用插入物陣列的實(shí)施方式中，該方法包括向包含多個(gè)液體樣品420的多個(gè)孔中加入包含可檢測(cè)標(biāo)記的經(jīng)標(biāo)記的示蹤物410。在一些實(shí)施方式中，液體樣品被懷疑含有分析物430,分析物430以淺灰色新月形示出。在一些實(shí)施方式中，所述孔包含其上固定有結(jié)合劑450的插入物440。在使用插入物陣列的一些實(shí)施方式中，所述多個(gè)孔包含其上固定有結(jié)合劑450的插入物440的陣列。在一些實(shí)施方式中，向液體樣品中加入經(jīng)標(biāo)記的示蹤物形成了包含液體樣品420、分析物430和經(jīng)標(biāo)記的示蹤物410的混合物。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)標(biāo)記的示蹤物410能夠與分析物430在第一位點(diǎn)結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，結(jié)合劑450能夠與分析物430在第二位點(diǎn)結(jié)合。在特定實(shí)施方式中，經(jīng)標(biāo)記的示蹤物不具有對(duì)結(jié)合劑450的顯著的結(jié)合親和力。在一些實(shí)施方式中，向液體樣品中加入經(jīng)標(biāo)記的示蹤物形成了包含液體樣品420、分析物430和經(jīng)標(biāo)記的示蹤物410的混合物。[0073]在一些實(shí)施方式中，所述方法進(jìn)一步包括將混合物溫育足夠的一段時(shí)間，從而允許形成包含經(jīng)標(biāo)記的示蹤物、分析物和結(jié)合劑的復(fù)合物，其中經(jīng)標(biāo)記的示蹤物與分析物在第一位點(diǎn)結(jié)合而結(jié)合劑與分析物在第二位點(diǎn)結(jié)合。本文中描述了溫育步驟的各種實(shí)施方式。在一些實(shí)施方式中，所述溫育導(dǎo)致一定量的未復(fù)合的經(jīng)標(biāo)記的示蹤物460保留在混合物中。在其他實(shí)施方式中，所述溫育導(dǎo)致形成一個(gè)或多個(gè)復(fù)合物470,該復(fù)合物470包含經(jīng)標(biāo)記的示蹤物410、分析物430和結(jié)合劑450。在另外其他的實(shí)施方式中，所述競(jìng)爭(zhēng)產(chǎn)生一定量的未復(fù)合的經(jīng)標(biāo)記的示蹤物460和一個(gè)或多個(gè)復(fù)合物470。在一些實(shí)施方式中，一個(gè)或多個(gè)復(fù)合物470被隔離到或結(jié)合到插入物的內(nèi)表面和/或外表面上，而未復(fù)合的經(jīng)標(biāo)記的示蹤物460保留在混合物中。[0074]在一些實(shí)施方式中，所述方法進(jìn)一步包括測(cè)量孔中保留在混合物中的可檢測(cè)標(biāo)記的量。在一些情況下，保留在混合物中的可檢測(cè)標(biāo)記的量與存在于液體樣品中的分析物的量成反比。在特定實(shí)施方式中，對(duì)保留在混合物中的可檢測(cè)標(biāo)記的量的測(cè)量基本上排除了測(cè)量被隔離到或結(jié)合到插入物的內(nèi)表面和/或外表面上的可檢測(cè)標(biāo)記的量。在更具體的實(shí)施方式中，通過(guò)在不含插入物的檢測(cè)區(qū)480中進(jìn)行測(cè)量而排除了測(cè)量被隔離到插入物上的標(biāo)記的量。在另外其他的【具體實(shí)施方式】中，通過(guò)在測(cè)量步驟之前移除插入物而排除了測(cè)量被隔離到插入物上的標(biāo)記的量。在圖4B所示的備選的實(shí)施方式401中，所述方法與以上描述的方法基本相同，不同之處在于，該方法并非測(cè)量保留在溶液中的可檢測(cè)標(biāo)記的量，而是包括通過(guò)在包含插入物的檢測(cè)區(qū)490中進(jìn)行測(cè)量而測(cè)量孔中被隔離到插入物上的可檢測(cè)標(biāo)記的量。在特定的備選的實(shí)施方式中，在檢測(cè)區(qū)490中進(jìn)行測(cè)量基本上排除了保留在混合物中的可檢測(cè)標(biāo)記的量。在這些備選的實(shí)施方式中，被隔離到插入物上的可檢測(cè)標(biāo)記的量與存在于液體樣品中的分析物的量成正比。在一些實(shí)施方式中，包含孔的裝置可以在溫育步驟后、在測(cè)量前在4攝氏度下儲(chǔ)存不定的一段時(shí)間。[0075]本文公開的方法特別適合于以線性檢測(cè)測(cè)量大范圍的分析物濃度。在一些實(shí)施方式中，所述方法可以測(cè)量約0-100μg/ml的分析物、約0-90μg/ml的分析物、約0-80μg/ml的分析物、約0-70μg/ml的分析物、約0-60μg/ml的分析物、約0-50μg/ml的分析物、約0-40μg/ml的分析物、約0-30μg/ml的分析物、約0-20μg/ml的分析物、約0-10μg/ml的分析物、約0-5μg/ml的分析物或約0-2.5μg/ml的分析物。[0076]在實(shí)施上述方法時(shí)，可以調(diào)節(jié)經(jīng)標(biāo)記的示蹤物、結(jié)合劑和/或分析物的相對(duì)量以提高結(jié)合測(cè)定的效率和/或準(zhǔn)確度。在一些實(shí)施方式中，相對(duì)于結(jié)合劑的結(jié)合容量調(diào)節(jié)經(jīng)標(biāo)記的示蹤物的相對(duì)濃度。在特定實(shí)施方式中，經(jīng)標(biāo)記的示蹤物的相對(duì)濃度為結(jié)合劑的相對(duì)結(jié)合容量的約100%、約95%、約90%、約85%、約80%、約75%、約70%、約65%、約60%、約55%、約50%、約45%、約40%、約35%、約30%、約25%、約20%、約15%、約10%或約5%。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)標(biāo)記的示蹤物的相對(duì)濃度為結(jié)合劑的相對(duì)結(jié)合容量的約10-90%、約20-80%、約30-70%、約40%-60%或約45%-55%。在特定的實(shí)施方式中，經(jīng)標(biāo)記的示蹤物的相對(duì)濃度為結(jié)合劑的相對(duì)結(jié)合容量的約50%。[0077]在其他實(shí)施方式中，相對(duì)于分析物的結(jié)合容量調(diào)節(jié)經(jīng)標(biāo)記的示蹤物的相對(duì)濃度。在特定實(shí)施方式中，經(jīng)標(biāo)記的示蹤物的相對(duì)濃度為分析物的相對(duì)結(jié)合容量的約100%、約95%、約90%、約85%、約80%、約75%、約70%、約65%、約60%、約55%、約50%、約45%、約40%、約35%、約30%、約25%、約20%、約15%、約10%或約5%。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)標(biāo)記的示蹤物的相對(duì)濃度為分析物的相對(duì)結(jié)合容量的約10-90%、約20-80%、約30-70%、約40%-60%或約45%-55%。在特定的實(shí)施方式中，經(jīng)標(biāo)記的示蹤物的相對(duì)濃度為分析物的相對(duì)結(jié)合容量的約50%。[0078]在另外其他的實(shí)施方式中，相對(duì)于分析物和結(jié)合劑的總結(jié)合容量調(diào)節(jié)經(jīng)標(biāo)記的示蹤物的相對(duì)濃度。在特定實(shí)施方式中，經(jīng)標(biāo)記的示蹤物的相對(duì)濃度為分析物和結(jié)合劑的總結(jié)合容量的約100%、約95%、約90%、約85%、約80%、約75%、約70%、約65%、約60%、約55%、約50%、約45%、約40%、約35%、約30%、約25%、約20%、約15%、約10%或約5%。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)標(biāo)記的示蹤物的相對(duì)濃度為分析物和結(jié)合劑的總結(jié)合容量的約10-90%、約20-80%、約30-70%、約40%-60%或約45%-55%。在特定的實(shí)施方式中，經(jīng)標(biāo)記的示蹤物的相對(duì)濃度為分析物和結(jié)合劑的總結(jié)合容量的約50%。檢測(cè)方法[0079]通常，以上描述的方法包括涉及標(biāo)記的檢測(cè)的測(cè)量步驟。檢測(cè)方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，并且任何合適的檢測(cè)方法均可用于本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，檢測(cè)方法的選擇取決于用戶的需求和所使用的可檢測(cè)標(biāo)記的類型。[0080]在可檢測(cè)標(biāo)記是熒光染料或熒光蛋白質(zhì)的一些實(shí)施方式中，測(cè)量步驟包括熒光檢測(cè)方法的使用。熒光檢測(cè)方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。在一些實(shí)施方式中，熒光檢測(cè)包括通過(guò)用源光照射目標(biāo)區(qū)域來(lái)激發(fā)熒光染料或蛋白質(zhì)，該源光的波長(zhǎng)范圍足以激發(fā)染料或蛋白質(zhì)中的熒光團(tuán)。源光可以由許多合適的光源提供，該光源包括，例如，激光、激光二極管和高強(qiáng)度燈，如氙弧燈或汞蒸汽燈。源光的波長(zhǎng)范圍可以使用例如光濾波器或單色儀系統(tǒng)來(lái)選擇。[0081]通常，熒光團(tuán)的激發(fā)導(dǎo)致響應(yīng)光的發(fā)射。在一些實(shí)施方式中，響應(yīng)光的波長(zhǎng)范圍比激發(fā)波長(zhǎng)范圍具有更高的波長(zhǎng)。在一些實(shí)施方式中，熒光檢測(cè)包括響應(yīng)光的檢測(cè)。例如，可以使用數(shù)碼相機(jī)、電荷耦合器件（CCD)、光電倍增管、光電管或CMOS圖像傳感器來(lái)完成檢測(cè)。[0082]熒光偏振代表一種熒光檢測(cè)方法，其能夠進(jìn)一步區(qū)分結(jié)合的或未結(jié)合的經(jīng)標(biāo)記的示蹤物。通常，熒光偏振使用分子的翻滾動(dòng)作來(lái)定量結(jié)合事件。例如，如果小熒光染料或蛋白質(zhì)與大得多的分子結(jié)合（例如，在經(jīng)標(biāo)記的示蹤物與分析物、結(jié)合劑，或者結(jié)合劑和分析物形成復(fù)合物的情況下），則與未結(jié)合的小熒光染料或蛋白質(zhì)（例如，如果經(jīng)標(biāo)記的示蹤物仍未結(jié)合）相比，熒光染料或蛋白質(zhì)的翻滾速度將會(huì)下降。熒光染料或蛋白質(zhì)分子的翻滾速度可通過(guò)用平面偏振光激發(fā)熒光團(tuán)來(lái)測(cè)定。如果熒光團(tuán)具有較低的翻滾速度（例如，在經(jīng)標(biāo)記的示蹤物已與另一種結(jié)合配偶體形成復(fù)合物的情況下），則發(fā)射的響應(yīng)光將傾向于在同一平面中保持偏振，相反，具有更高翻滾速度的熒光團(tuán)（例如，在經(jīng)標(biāo)記的示蹤物仍未結(jié)合的情況下）將傾向于在激發(fā)步驟中失去偏振，并因此發(fā)射相對(duì)于激發(fā)光平面具有更低偏振的響應(yīng)光。在特定實(shí)施方式中，測(cè)量步驟包括熒光偏振方法的使用。在更具體的實(shí)施方式中，測(cè)量保留在混合物中的可檢測(cè)標(biāo)記的量采用熒光偏振方法，該熒光偏振方法使得用戶能夠區(qū)分已與分析物形成復(fù)合物的經(jīng)標(biāo)記的示蹤物以及未結(jié)合的經(jīng)標(biāo)記的示蹤物。[0083]在可檢測(cè)標(biāo)記包含發(fā)光或化學(xué)發(fā)光標(biāo)簽的一些實(shí)施方式中，測(cè)量步驟包括發(fā)光檢測(cè)方法。發(fā)光檢測(cè)方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的（參見(jiàn)，例如，BiomedicalChromatography17:83-95(2003)，ComplementaryImmunoAssays，Ch.14,1988年版，CanadianJournalofChemistry,1987,65(6):1392-1396)、美國(guó)專利RE39047,所有這些均通過(guò)引用并入本文）。在一些實(shí)施方式中，測(cè)量步驟包括加入化學(xué)發(fā)光化合物和活化劑，其中化學(xué)發(fā)光標(biāo)簽催化該反應(yīng)。化學(xué)發(fā)光化合物是本領(lǐng)域公知的，并且在上述參考文獻(xiàn)中描述。在化學(xué)發(fā)光化合物選自2,3-二氫-1，4-酞嗪二酮魯米諾，5-氨基-6,7,8_三甲氧基-和二甲基氨基[ca]苯并類似物的一些實(shí)施方式中，測(cè)量步驟包括加入堿性過(guò)氧化氫或次氯酸鈣和堿，它們誘導(dǎo)標(biāo)記發(fā)光。在化學(xué)發(fā)光化合物為2,4,5-三苯基咪唑族或草酸酯族化合物（例如，草?；钚怎ィ┑钠渌麑?shí)施方式中，測(cè)量步驟包括加入含有氧化試劑的堿性緩沖液，其誘導(dǎo)該化合物發(fā)出綠光。在發(fā)光標(biāo)簽包含螢光素酶的另外其他的實(shí)施方式中，測(cè)量步驟包括加入螢光素以誘導(dǎo)發(fā)光。在化學(xué)發(fā)光化合物是吖啶酯族化合物的再進(jìn)一步的實(shí)施方式中，測(cè)量步驟包括在中性-堿性條件下加入超氧陰離子。[0084]在本文所述方法的一些實(shí)施方式中，分開測(cè)量保留在混合物中的可檢測(cè)標(biāo)記與被隔離到插入物上的可檢測(cè)標(biāo)記使得用戶能夠在溫育步驟后立即進(jìn)行該測(cè)量步驟，而不需要任何對(duì)混合物的中間調(diào)節(jié)或?qū)⒒旌衔镛D(zhuǎn)移到孔外（例如，不需要中間洗滌步驟）。在一些實(shí)施方式中，在不調(diào)節(jié)混合物的內(nèi)容物或?qū)⒒旌衔镛D(zhuǎn)移到孔外的情況下測(cè)量可檢測(cè)標(biāo)記的量。在特定實(shí)施方式中，分開測(cè)量保留在混合物中的標(biāo)記與被隔離到插入物上的標(biāo)記包括將插入物移至新的孔。在更具體的實(shí)施方式中，測(cè)量原始孔中保留在混合物中的可檢測(cè)標(biāo)記的量可以與測(cè)量新的孔中被隔離到插入物上的標(biāo)記的量的相結(jié)合，以指示液體樣品中的分析物的量（例如，通過(guò)比率測(cè)量分析）。[0085]使用本文所述的插入物陣列的方法可以用于眾多的高通量、多重分析。例如，插入物陣列可用于測(cè)量多個(gè)液體樣品中的感興趣的分析物，或者用于測(cè)量分配到多個(gè)孔中的液體樣品中的多種分析物，或者測(cè)量多個(gè)液體樣品中的多種分析物。在特定實(shí)施方式中，插入物陣列用于高通量細(xì)胞篩選目的。在更具體的實(shí)施方式中，插入物陣列用于利用以上描述的方法鑒定表達(dá)分泌的多肽的細(xì)胞。在更具體的實(shí)施方式中，該分泌的多肽是異源多肽。在這些實(shí)施方式中，該一種或多種液體樣品包含細(xì)胞培養(yǎng)基，在該細(xì)胞培養(yǎng)基中已培養(yǎng)有被懷疑表達(dá)所述多肽的細(xì)胞。設(shè)備[0086]在另一方面，本發(fā)明提供適合用于進(jìn)行本文所述的結(jié)合測(cè)定的設(shè)備。在一些實(shí)施方式中，該設(shè)備包括讀板儀器械，所述讀板儀器械能夠檢測(cè)和/或測(cè)量來(lái)自含有本發(fā)明的插入物的多孔板的一個(gè)或多個(gè)孔的信號(hào)。在一些實(shí)施方式中，讀板儀器械可配置用于檢測(cè)和/或測(cè)量來(lái)自6孔板、12孔板、24孔板、48孔板、96孔板、384孔板或3456孔板的信號(hào)。讀板儀是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，并且很容易購(gòu)得。例如，市售讀板儀的實(shí)例包括例如Perkin-ElmerLS55發(fā)光光譜儀、LJLBiosystemsAnalystPlateReader(MolecularDevices,Sunnyvale,CA)、CytoFluor.TM.2300機(jī)器（Millipore)〇[0087]在一些實(shí)施方式中，讀板儀器械包括光源、檢測(cè)器以及光中繼結(jié)構(gòu)，所述光中繼結(jié)構(gòu)被配置用于將光從光源引向與多孔裝置的孔相對(duì)應(yīng)的目標(biāo)區(qū)域。[0088]合適的光源包括例如高強(qiáng)度燈、白熾燈、焚光燈、電致發(fā)光器件、激光器、激光二極管以及發(fā)光二極管（LED)等。在一些實(shí)施方式中，光源被配置用于提供連續(xù)照射。在其他實(shí)施方式中，光源被配置用于提供時(shí)變照射，例如，脈沖激光器。光源可被配置用于產(chǎn)生相干和/或非相干光。光源還可被配置用于提供偏振和/或非偏振光。示例性光源包括Q開關(guān)YAG激光器、Nd:V04激光器、Nd:玻璃激光器、Nd:YAG激光器、氮激光器、Q開關(guān)氬激光器、Ti:藍(lán)寶石激光器、光纖激光器，或者任何合適的激光器或單色光源。[0089]在一些實(shí)施方式中，讀板儀包括光導(dǎo)引器，所述光導(dǎo)引器將源光引向與多孔裝置的一個(gè)或多個(gè)孔相對(duì)應(yīng)的一個(gè)或多個(gè)目標(biāo)區(qū)域。在特定實(shí)施方式中，光導(dǎo)引器被配置用于向與單個(gè)孔相對(duì)應(yīng)的單個(gè)目標(biāo)區(qū)域提供源光，以及在孔與孔之間移動(dòng)，并且在每個(gè)孔處存在停留時(shí)間，在此期間光導(dǎo)引器將源光引向孔的目標(biāo)區(qū)域。在這些情況下，將會(huì)一次一個(gè)地照射多孔裝置的孔。[0090]在其他實(shí)施方式中，光導(dǎo)引器包括光圖案發(fā)生器，該光圖案發(fā)生器能夠?qū)⒃垂庖蚺c多孔裝置的多個(gè)孔相對(duì)應(yīng)的多個(gè)目標(biāo)區(qū)域。光圖案發(fā)生器通常包括能夠?qū)⒐獠倏v成預(yù)選光圖案的任何機(jī)制。該圖案可以使用衍射、折射、反射和/或其他機(jī)制，或者它們的組合來(lái)創(chuàng)建。光圖案發(fā)生器可用于生成光的任何期望的圖案，包括一維或二維圖案（或陣列）。例如，光圖案發(fā)生器可被配置用于創(chuàng)建任何尺寸的規(guī)則形狀的子束陣列。例如，所期望的圖案可以是被定位成與多孔裝置的一個(gè)或多個(gè)目標(biāo)孔的間距相對(duì)應(yīng)的基本上相等的目標(biāo)區(qū)域的陣列。在一些情況下，光圖案發(fā)生器提供跨每個(gè)目標(biāo)區(qū)域的均一的光強(qiáng)度。在其他實(shí)施方式中，所期望的圖案對(duì)應(yīng)于多孔裝置的孔內(nèi)的多個(gè)目標(biāo)區(qū)域（例如，對(duì)應(yīng)于多個(gè)空腔）。在一些實(shí)施方式中，所期望的圖案對(duì)應(yīng)于基本上包括混合物體積但不包括插入物的孔的區(qū)域，或反之亦然。[0091]在一些實(shí)施方式中，讀板儀附加地包括檢測(cè)器設(shè)備，該檢測(cè)器設(shè)備檢測(cè)來(lái)自多孔裝置的多個(gè)孔的響應(yīng)光，并由所述響應(yīng)光生成與可檢測(cè)標(biāo)記有關(guān)的信號(hào)。在【具體實(shí)施方式】中，檢測(cè)器設(shè)備包括單個(gè)檢測(cè)器，該單個(gè)檢測(cè)器被配置用于檢測(cè)來(lái)自與多孔裝置的單個(gè)孔相對(duì)應(yīng)的單個(gè)目標(biāo)區(qū)域的光。在更具體的實(shí)施方式中，在孔與孔之間移動(dòng)所述單個(gè)檢測(cè)器，并且在每個(gè)孔處存在停留時(shí)間，在此期間來(lái)自響應(yīng)光的信號(hào)被數(shù)字化并存儲(chǔ)到存儲(chǔ)器中。[0092]在其他實(shí)施方式中，檢測(cè)器設(shè)備包括光中繼結(jié)構(gòu)，該光中繼結(jié)構(gòu)被配置用于將來(lái)自多個(gè)孔的響應(yīng)光引向與所述多個(gè)孔中的單獨(dú)的孔相對(duì)應(yīng)的多個(gè)光檢測(cè)器。在具體實(shí)施方式中，多個(gè)光檢測(cè)器同時(shí)檢測(cè)來(lái)自所述多個(gè)孔的響應(yīng)光。在更具體的實(shí)施方式中，檢測(cè)器設(shè)備通過(guò)使用CCD相機(jī)或其他成像設(shè)備（例如，基于CMOS芯片的相機(jī)）拍攝整個(gè)板的快照來(lái)同時(shí)檢測(cè)來(lái)自所述多個(gè)孔的響應(yīng)光。[0093]在一些實(shí)施方式中，該設(shè)備可任選地包括處理器，該處理器適于與讀板儀通信和處理來(lái)自讀板儀的數(shù)據(jù)。在一些實(shí)施方式中，讀板儀向處理器通信由檢測(cè)器設(shè)備所生成的信號(hào)。處理器可以將該信號(hào)轉(zhuǎn)換成指示出可檢測(cè)標(biāo)記在目標(biāo)區(qū)域中的存在或量的測(cè)量值。在一些實(shí)施方式中，處理器還被配置用于向讀板儀通信用戶定義的實(shí)驗(yàn)設(shè)置。例如，用戶可以設(shè)定讀板儀是進(jìn)行對(duì)板的頂部讀取還是底部讀取，可以選擇他/她希望從中獲得數(shù)據(jù)的孔，可以設(shè)定測(cè)定的類型（例如，熒光測(cè)定還是發(fā)光測(cè)定），可以定義熒光測(cè)定的激發(fā)/發(fā)射設(shè)置，或者可以定義用于將源光引向特定孔中的特定目標(biāo)區(qū)域的預(yù)選光圖案。本文所描述的處理器可以集成到讀板儀或作為體現(xiàn)在可操作地連接至讀板儀的計(jì)算機(jī)中的單獨(dú)的組件。在優(yōu)選實(shí)施方式中，由于孔的底部表面可能提供降低測(cè)量精確度的光學(xué)干涉，因此用戶選擇頂部讀取。[0094]在一些實(shí)施方式中，讀板儀能夠檢測(cè)來(lái)自單個(gè)孔內(nèi)的多個(gè)限定的目標(biāo)子區(qū)域（掃描點(diǎn)）的信號(hào)。在一些實(shí)施方式中，讀板儀能夠從來(lái)自多孔板的多個(gè)孔的相同的多個(gè)限定的目標(biāo)子區(qū)域檢測(cè)信號(hào)。在其他實(shí)施方式中，該設(shè)備包括軟件，該軟件能夠圖形地顯示來(lái)自每個(gè)目標(biāo)子區(qū)域的信號(hào)以創(chuàng)建每個(gè)孔的圖譜（map)。在其他實(shí)施方式中，該設(shè)備包括處理器，該處理器能夠使用戶能夠選擇或移除孔的單獨(dú)的目標(biāo)子區(qū)域或整個(gè)部分以便進(jìn)行分析，從而限定孔的檢測(cè)區(qū)。在一些實(shí)施方式中，用戶選擇基本上不包括插入物的檢測(cè)區(qū)。在其他實(shí)施方式中，用戶選擇通過(guò)基本上排除插入物的空腔而選擇包括插入物的檢測(cè)區(qū)。能夠以本文所述的方式對(duì)孔進(jìn)行掃描的讀板儀是本領(lǐng)域已知的，并且可商購(gòu)自多個(gè)供應(yīng)商，例如，PHERAstarFS(BMGLabtech)、EnSpireMultimodePlateReader(PerkinElmer)、GeminiEMFluorescenceMicroplateReader(MolecularDevices)等。[0095]在一些實(shí)施方式中，計(jì)算機(jī)附加地包括接口，該接口通信地耦合至云，該云可以包括用于數(shù)據(jù)存儲(chǔ)和/或進(jìn)一步處理的一個(gè)或多個(gè)外部服務(wù)器。[0096]圖5提供了本發(fā)明的示例性設(shè)備（500)的示意圖。該設(shè)備包括：多孔設(shè)備，其具有一個(gè)或多個(gè)孔，所述一個(gè)或多個(gè)孔在其中插入有本發(fā)明的插入物（510);讀板儀（520)，其能夠檢測(cè)與可檢測(cè)標(biāo)記有關(guān)的信號(hào)并將所述信號(hào)通信至計(jì)算機(jī)（530)，該計(jì)算機(jī)能夠?qū)⑺鲂盘?hào)轉(zhuǎn)換成指示出可檢測(cè)標(biāo)記的存在或量的測(cè)量數(shù)據(jù)，并且任選地能夠?qū)?shù)據(jù)中繼到云(540)。當(dāng)需要時(shí)，讀板儀本身或者可操作地連接的計(jì)算機(jī)包含被檢測(cè)的給定分析物的參考或標(biāo)準(zhǔn)圖表，以實(shí)現(xiàn)對(duì)測(cè)試樣品中該分析物的定量分析。試劑盒[0097]在另一方面，本發(fā)明提供用于測(cè)量多孔裝置的孔中的液體樣品中存在的分析物的試劑盒。在一些實(shí)施方式中，試劑盒包括一個(gè)或多個(gè)本文所述的插入物，其中所述插入物在其上固定有結(jié)合劑。在一些實(shí)施方式中，試劑盒還包括關(guān)于使用該插入物進(jìn)行結(jié)合測(cè)定以測(cè)量分析物的說(shuō)明書。[0098]在其他實(shí)施方式中，試劑盒包括經(jīng)標(biāo)記的示蹤物。在一些實(shí)施方式中，選擇經(jīng)標(biāo)記的示蹤物和結(jié)合劑，使得經(jīng)標(biāo)記的示蹤物對(duì)分析物和對(duì)結(jié)合劑具有相似的結(jié)合親和力。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，選擇結(jié)合劑使得其不具有明顯的對(duì)分析物的結(jié)合親和力。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，使用說(shuō)明書指導(dǎo)用戶測(cè)量保留在混合物中的可檢測(cè)標(biāo)記的量，其中所述量與液體樣品中的分析物的量成正比。在其他實(shí)施方式中，使用說(shuō)明書指導(dǎo)用戶測(cè)量被隔離到所述一個(gè)或多個(gè)插入物上的可檢測(cè)標(biāo)記的量，其中所述量與液體樣品中分析物的量成反比。[0099]在備選的實(shí)施方式中，選擇經(jīng)標(biāo)記的示蹤物和結(jié)合劑，使得所述結(jié)合劑能夠與分析物在第一位點(diǎn)結(jié)合，并且經(jīng)標(biāo)記的示蹤物能夠與分析物在第二位點(diǎn)結(jié)合。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，經(jīng)標(biāo)記的示蹤物不具有明顯的對(duì)結(jié)合劑的結(jié)合親和力。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，使用說(shuō)明書指導(dǎo)用戶測(cè)量保留在混合物中的可檢測(cè)標(biāo)記的量，其中所述量與液體樣品中分析物的量成反比。在其他實(shí)施方式中，使用說(shuō)明書指導(dǎo)用戶測(cè)量被隔離到所述一個(gè)或多個(gè)插入物上的可檢測(cè)標(biāo)記的量，其中所述量直接與液體樣品中分析物的量成正比。[0100]在一些實(shí)施方式中，試劑盒進(jìn)一步包括標(biāo)準(zhǔn)，例如，用于在本發(fā)明的測(cè)定中使用的標(biāo)準(zhǔn)。標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)例例如包括包含已知濃度的分析物的儲(chǔ)備溶液，其中所述儲(chǔ)備溶液可以連續(xù)稀釋以產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線。[0101]本文提供了本發(fā)明的插入物和方法的其他示例性實(shí)施方式。實(shí)施例1:利用本發(fā)明的插入物的競(jìng)爭(zhēng)性FLISA測(cè)定[0102]為了制備插入物，外徑為6mm且內(nèi)徑為4mm的塑料管購(gòu)自Graingers(目錄號(hào)2vdn6和2vdp4)并切成約6mm高的、具有鋒利刀片的圓柱體。將這些圓柱體在INNaHCCV^液中煮沸約10分鐘，用去離子水漂洗5遍，并風(fēng)干。然后將這些圓柱體浸沒(méi)于在包被緩沖液(0·INNaHCO3,pH9.0)中制備的5微克/ml山羊抗人IgG(H+L)(JacksonImmunoResearchLaboratories,Inc.，目錄號(hào)109-005-003)中，并在約4-9°C下溫育過(guò)夜。將包被的環(huán)在PBS中漂洗3遍，備用。包被的漂洗物可以風(fēng)干并貯存以供以后使用。將制備的免疫吸附性插入物插入到96孔板的孔中。圖6描繪了插入到96孔板中的插入物的示例性照片。[0103]將人γ球蛋白（JacksonImmunoResearchLaboratories,Inc.，目錄號(hào)009-000-002)和AlexaFluor⑧488偶聯(lián)的ChromoPure人IgG(JacksonImmunoResearchLaboratories,Inc.，目錄號(hào)009-540-003)在FLISA緩沖液（含有0·I%吐溫20和I%BSA的PBS)中稀釋。以1:2的比例從5微克/ml的起始濃度制備人γ球蛋白的一系列稀釋液。一式兩份，將人γ球蛋白溶液以100微升/孔添加到具有免疫吸附性插入物的96孔板中，或者添加到已用5微克/ml山羊抗-人IgG(H+L)包被的96孔板中。然后，除了只接受150微升FLISA緩沖液的空白對(duì)照孔外，向各孔添加50微升的45微克/mlAlexaFluor⑧488偶聯(lián)的ChromoPure人IgG。然后將板在振蕩器上短時(shí)混合，并在37°C下溫育2小時(shí)或在約4-9°C下溫育過(guò)夜，之后用PerkinElmerEnvision讀板儀讀取。使用493nm的激發(fā)光照射各孔，并從各孔檢測(cè)519nm的發(fā)射光。將數(shù)據(jù)作為重復(fù)試驗(yàn)的平均值來(lái)作圖，并通過(guò)曲線擬合進(jìn)行分析。圖7描繪了作為人γ球蛋白濃度的函數(shù)的熒光強(qiáng)度的圖。數(shù)據(jù)表明，在具有插入物（包被的環(huán)）的孔中，熒光強(qiáng)度隨人γ球蛋白濃度的增加（其范圍為0.08至2.5微克/ml)而線性增加。相反，不同的人γ球蛋白組的熒光強(qiáng)度在直接用抗體包被的板中保持為平線。實(shí)施例2:利用本發(fā)明的插入物的夾心FLISA測(cè)定[0104]為了制備插入物，外徑為1/4"的尼龍管購(gòu)自Graingers(目錄號(hào)2vdn6和2ν4)并切成約3mm高的、具有鋒利刀片的圓柱體。將這些圓柱體在IMNaHCO3溶液中煮沸10分鐘，用去離子水漂洗5遍，并風(fēng)干。然后將這些圓柱體浸沒(méi)于在包被緩沖液（0.INNaHCO3,pH9.0)中制備的5微克/1111山羊抗人]^61〇輕鏈（5〇111:1161'1113;[(^6(311，目錄號(hào)2060-01)中，并在4-9°C下溫育過(guò)夜。包被的環(huán)在PBS中漂洗3遍，通過(guò)在PBS中與0.5%牛白蛋白一起溫育而封閉，備用。將制備的環(huán)插入到96孔板（E&KScientific，EK-25076)的孔中。[0105]將人γ球蛋白（JacksonImmunoResearchLaboratories,Inc.，目錄號(hào)009-000-002)在樣品緩沖液（含有0.I%吐溫20和I%BSA的PBS)中稀釋。從1微克/ml的濃度開始，以稀釋倍數(shù)2制備人γ球蛋白的一系列稀釋液。一式兩份，將人γ球蛋白溶液以100微升/孔添加到96孔板的孔中，該96孔板具有用上述抗-人κ輕鏈抗體包被的圓柱形插入物。在室溫下溫育60分鐘后，采用洗板器，用300微升/孔含有0.1%吐溫20的PBS洗板3次。然后，除了只接受100微升Probe緩沖液（含有0.1%吐溫20和0.1%BSA的PBS)的空白對(duì)照孔外，以100ng/ml的濃度添加（100微升/孔）在Probe緩沖液中稀釋的AlexaFlu〇?488偶聯(lián)的AffiniPure抗-人IgGFc特異性抗體（JacksonImmunoResearchLaboratories,Inc.，目錄號(hào)109-545-098)。將板在室溫下在輕輕振搖下溫育45分鐘，之后用PerkinElmerEnvisionMultipurpose讀板儀讀?。ぐl(fā)493nm，發(fā)射519nm)。將數(shù)據(jù)作為重復(fù)試驗(yàn)的平均值來(lái)作圖，并采用MicrosoftExcel通過(guò)曲線擬合進(jìn)行分析。如圖8所示，熒光強(qiáng)度隨人γ球蛋白濃度的增加而線性降低。[0106]雖然本文已經(jīng)顯示和描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，但本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)明白，這些實(shí)施方式僅以實(shí)例的方式提供。在不背離本發(fā)明的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員現(xiàn)在將會(huì)想到許多變更、變化和替換。應(yīng)當(dāng)理解，本文描述的本發(fā)明實(shí)施方式的各種備選的方式可用于實(shí)施本發(fā)明。下面的權(quán)利要求旨在限定本發(fā)明的范圍，因此由此涵蓋這些權(quán)利要求范圍內(nèi)的方法和結(jié)構(gòu)及其等同物?！緳?quán)利要求】1.一種用于插入到多孔裝置的孔中的插入物，所述插入物包含基本上不含微孔的內(nèi)表面和外表面；其中所述內(nèi)表面和/或外表面在其上固定有結(jié)合劑；其中所述插入物的尺寸設(shè)置為小于所述孔，使得所述插入物可以插入到所述孔中。2.-種用于插入到多孔裝置的孔中的插入物，所述插入物包含內(nèi)表面和外表面，其中所述內(nèi)表面和/或外表面在其上固定有結(jié)合劑，其中所述外表面具有的直徑小于所述孔的直徑，使得所述插入物可以插入到所述孔中；其中所述插入物向多孔裝置的孔中的所述插入使得所述孔與所述裝置的相鄰孔在光學(xué)上隔離。3.如權(quán)利要求1或2所述的插入物，其中所述插入物由不透明的材料制成。4.如權(quán)利要求1或2所述的插入物，其中所述插入物在形狀上為圓柱形。5.如權(quán)利要求1或2所述的插入物，其中所述插入物是中空的。6.如權(quán)利要求1或2所述的插入物，其中所述插入物包含多個(gè)空腔。7.如權(quán)利要求1或2所述的插入物，其中所述插入物的尺寸設(shè)置為可從所述孔中移除。8.如權(quán)利要求1或2所述的插入物，其中所述結(jié)合劑包含抗體。9.如權(quán)利要求1或2所述的插入物，其中所述結(jié)合劑包含抗原。10.-種用于插入到多孔裝置的多個(gè)孔中的插入物陣列，其中每個(gè)單獨(dú)的插入物被安裝在連續(xù)的固體框架上，所述框架的尺寸設(shè)置為允許同時(shí)向所述多個(gè)孔的每個(gè)單獨(dú)的孔中插入和任選地移除每個(gè)單獨(dú)的插入物，其中所述單獨(dú)的插入物包含內(nèi)表面和外表面，所述內(nèi)表面和外表面中的任一個(gè)或兩個(gè)在其上固定有結(jié)合劑，其中所述內(nèi)表面和/或外表面基本上不含微孔。11.一種用于插入到多孔裝置的多個(gè)孔中的插入物陣列，其中每個(gè)單獨(dú)的插入物被安裝在連續(xù)的固體框架上，所述框架的尺寸設(shè)置為允許同時(shí)向所述多個(gè)孔的每個(gè)單獨(dú)的孔中插入和任選地移除每個(gè)單獨(dú)的插入物，其中所述單獨(dú)的插入物包含內(nèi)表面和外表面，所述內(nèi)表面和外表面中的任一個(gè)或兩個(gè)在其上固定有結(jié)合劑，其中所述單獨(dú)的插入物向所述單獨(dú)的孔中的插入使得所述孔與所述裝置上的其他相鄰孔在光學(xué)上隔離。12.如權(quán)利要求10或11所述的插入物陣列，其中所述框架的尺寸設(shè)置為允許同時(shí)向所述多孔裝置的每個(gè)單獨(dú)的孔中插入和移除所述每個(gè)單獨(dú)的插入物。13.-種多孔裝置，其包含如權(quán)利要求10或11所述的插入物陣列。14.如權(quán)利要求13所述的多孔裝置，其中所述多孔裝置是具有6、12、24、96、384、1536或3456個(gè)孔的多孔板。15.-種包含多個(gè)孔的多孔裝置，所述多個(gè)孔中的至少一個(gè)孔包含如權(quán)利要求1或2所述的插入物。16.如權(quán)利要求15所述的多孔裝置，其中所述多孔裝置是具有6、12、24、96、384、1536或3456個(gè)孔的多孔板。17.-種測(cè)量孔中液體樣品中存在的分析物的方法，其包括：(a)向含有液體樣品的孔中加入包含可檢測(cè)標(biāo)記的經(jīng)標(biāo)記的示蹤物以形成混合物，其中所述孔中包含如權(quán)利要求1或2所述的插入物；(b)使所述分析物和所述結(jié)合劑競(jìng)爭(zhēng)所述示蹤物的結(jié)合一段充足的時(shí)間，以實(shí)現(xiàn)復(fù)合物的形成，該復(fù)合物包含在混合物中的該示蹤物以及該分析物或該結(jié)合劑中之一，其中所述競(jìng)爭(zhēng)導(dǎo)致第一量的所述可檢測(cè)標(biāo)記保留在所述混合物中而第二量的所述可檢測(cè)標(biāo)記被隔離到所述插入物的內(nèi)表面和/或外表面上；以及(C)測(cè)量所述孔中保留在所述混合物中的所述可檢測(cè)標(biāo)記的所述第一量，其中所述第一量與存在于該混合物中的所述分析物的量成比例。18.-種測(cè)量孔中液體樣品中存在的分析物的方法，其包括：(a)向含有液體樣品的孔中加入經(jīng)標(biāo)記的示蹤物以形成混合物，其中所述孔中包含如權(quán)利要求1或2所述的插入物；(b)使得在所述插入物的內(nèi)表面和/或外表面上形成復(fù)合物，其中該復(fù)合物包含（1)與所述分析物上的第一結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合的經(jīng)標(biāo)記的示蹤物，和（2)與同一分析物上的第二結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合的結(jié)合劑，所述形成導(dǎo)致第一量的所述可檢測(cè)標(biāo)記保留在所述混合物中而第二量的所述可檢測(cè)標(biāo)記被隔離到所述插入物的內(nèi)表面和/或外表面上；以及(c)測(cè)量所述孔中保留在所述混合物中的所述可檢測(cè)標(biāo)記的所述第一量，其中所述第一量與存在于該混合物中的所述分析物的量成反比。19.如權(quán)利要求17或18所述的方法，其中在不將所述混合物轉(zhuǎn)移到孔外或調(diào)節(jié)所述混合物的內(nèi)容物的情況下測(cè)量保留在所述混合物中的所述可檢測(cè)標(biāo)記的所述第一量。20.如權(quán)利要求17或18所述的方法，其中在從所述孔中移除插入物后測(cè)量保留在所述混合物中的所述可檢測(cè)標(biāo)記的所述第一量。21.如權(quán)利要求17或18所述的方法，其中所述方法能夠以3.9至1000ng/ml的線性檢測(cè)范圍測(cè)量所述分析物。22.-種測(cè)量孔中液體樣品中存在的分析物的方法，其包括：(a)向含有液體樣品的孔中加入包含可檢測(cè)標(biāo)記的經(jīng)標(biāo)記的示蹤物以形成混合物，其中所述孔中包含如權(quán)利要求1或2所述的插入物；(b)使所述分析物和所述結(jié)合劑競(jìng)爭(zhēng)所述示蹤物的結(jié)合一段充足的時(shí)間，以實(shí)現(xiàn)復(fù)合物的形成，該復(fù)合物包含在混合物中的該示蹤物以及該分析物或該結(jié)合劑中之一，其中所述競(jìng)爭(zhēng)導(dǎo)致第一量的所述可檢測(cè)標(biāo)記保留在所述混合物中而第二量的所述可檢測(cè)標(biāo)記被隔離到所述插入物的內(nèi)表面和/或外表面上；以及(c)測(cè)量被隔離到所述插入物的內(nèi)表面和/或外表面上的所述可檢測(cè)標(biāo)記的所述第二量，其中所述第二量與存在于該混合物中的所述分析物的量成反比。23.-種測(cè)量孔中液體樣品中存在的分析物的方法，其包括：(a)向含有液體樣品的孔中加入包含可檢測(cè)標(biāo)記的經(jīng)標(biāo)記的示蹤物以形成混合物，其中所述孔中包含如權(quán)利要求1或2所述的插入物；(b)使得在所述插入物的內(nèi)表面和/或外表面上形成復(fù)合物，其中該復(fù)合物包含（1)與所述分析物上的第一結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合的經(jīng)標(biāo)記的示蹤物，和（2)與同一分析物上的第二結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合的結(jié)合劑，所述形成導(dǎo)致第一量的所述可檢測(cè)標(biāo)記保留在所述混合物中而第二量的所述可檢測(cè)標(biāo)記被隔離到所述插入物的內(nèi)表面和/或外表面上；以及(c)測(cè)量被隔離到所述插入物的內(nèi)表面和/或外表面上的可檢測(cè)標(biāo)記的所述第二量，其中所述第二量與存在于該混合物中的所述分析物的量成比例。24.如權(quán)利要求22或23所述的方法，其中在不將所述混合物轉(zhuǎn)移到孔外或調(diào)節(jié)所述混合物的內(nèi)容物的情況下測(cè)量保留在所述混合物中的所述可檢測(cè)標(biāo)記的第二量。25.如權(quán)利要求22或23所述的方法，其中在從所述孔中移除插入物后測(cè)量所述可檢測(cè)標(biāo)記的所述第二量。26.-種在多孔裝置中在分析物和包含可檢測(cè)標(biāo)記的經(jīng)標(biāo)記的示蹤物的混合物中進(jìn)行結(jié)合測(cè)定的方法，該方法包括：(a)向如權(quán)利要求10或權(quán)利要求11所述的陣列的多個(gè)插入物上添加所述經(jīng)標(biāo)記的示蹤物；(b)使所述分析物和所述結(jié)合劑競(jìng)爭(zhēng)所述示蹤物的結(jié)合一段充足的時(shí)間，以實(shí)現(xiàn)復(fù)合物的形成，該復(fù)合物包含在混合物中的該示蹤物以及該分析物或該結(jié)合劑中之一，其中所述競(jìng)爭(zhēng)導(dǎo)致第一量的所述可檢測(cè)標(biāo)記保留在所述混合物中而第二量的所述可檢測(cè)標(biāo)記被隔離到所述插入物的內(nèi)表面和/或外表面上；以及(c)測(cè)量所述多個(gè)孔中保留在所述混合物中的所述可檢測(cè)標(biāo)記的所述第一量，其中所述第一量與存在于該混合物中的所述分析物的量成比例。27.-種在多孔裝置中在分析物和包含可檢測(cè)標(biāo)記的經(jīng)標(biāo)記的示蹤物的混合物中進(jìn)行結(jié)合測(cè)定的方法，該方法包括：(a)向如權(quán)利要求10或權(quán)利要求11所述的陣列的多個(gè)插入物上添加所述經(jīng)標(biāo)記的示蹤物；(b)使得在所述插入物的內(nèi)表面和/或外表面上形成復(fù)合物，其中該復(fù)合物包含（1)與所述分析物上的第一結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合的經(jīng)標(biāo)記的示蹤物，和（2)與同一分析物上的第二結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合的結(jié)合劑，所述形成導(dǎo)致第一量的所述可檢測(cè)標(biāo)記保留在所述混合物中而第二量的所述可檢測(cè)標(biāo)記被隔離到所述插入物的內(nèi)表面和/或外表面上；以及(c)測(cè)量所述多個(gè)孔中保留在所述混合物中的所述可檢測(cè)標(biāo)記的所述第一量，其中所述第一量與存在于該混合物中的所述分析物的量成反比。28.-種鑒定表達(dá)分泌的異源多肽的細(xì)胞的方法，其包括：(a)提供包含多個(gè)孔的多孔裝置，其中所述多個(gè)孔中的每個(gè)孔中插有如權(quán)利要求1或2所述的插入物，并且其中所述多個(gè)孔中的每個(gè)孔包含細(xì)胞培養(yǎng)基，在該細(xì)胞培養(yǎng)基中已培養(yǎng)有被懷疑表達(dá)所述多肽的細(xì)胞；(b)向所述包含細(xì)胞培養(yǎng)基的多個(gè)孔中加入包含可檢測(cè)標(biāo)記的經(jīng)標(biāo)記的示蹤物以形成混合物；(c)使所述多肽和所述結(jié)合劑競(jìng)爭(zhēng)所述示蹤物的結(jié)合一段充足的時(shí)間，以實(shí)現(xiàn)復(fù)合物的形成，該復(fù)合物包含在混合物中的該示蹤物以及該多肽或該結(jié)合劑中之一，其中所述競(jìng)爭(zhēng)導(dǎo)致第一量的所述可檢測(cè)標(biāo)記保留在所述培養(yǎng)基中而第二量的所述可檢測(cè)標(biāo)記被隔離到所述插入物的內(nèi)表面和/或外表面上；以及(d)測(cè)量所述孔中保留在所述混合物中的所述可檢測(cè)標(biāo)記的所述第一量，其中所述第一量與存在于所述細(xì)胞培養(yǎng)基中的所述多肽的量成比例，由此鑒定表達(dá)分泌的異源多肽的細(xì)胞。29.-種鑒定表達(dá)分泌的異源多肽的細(xì)胞的方法，該方法包括：(a)提供包含多個(gè)孔的多孔裝置，其中所述多個(gè)孔中的每個(gè)孔中插有如權(quán)利要求1或2所述的插入物，并且其中所述多個(gè)孔中的每個(gè)孔包含細(xì)胞培養(yǎng)基，在該細(xì)胞培養(yǎng)基中已培養(yǎng)有被懷疑表達(dá)所述多肽的細(xì)胞；(b)向所述包含細(xì)胞培養(yǎng)基的多個(gè)孔中加入包含可檢測(cè)標(biāo)記的經(jīng)標(biāo)記的示蹤物以形成混合物；(C)使得在所述插入物的內(nèi)表面和/或外表面上形成復(fù)合物，其中該復(fù)合物包含（1)與所述多肽上的第一結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合的經(jīng)標(biāo)記的示蹤物，和（2)與同一多肽上的第二結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合的結(jié)合劑，所述形成導(dǎo)致第一量的所述可檢測(cè)標(biāo)記保留在所述培養(yǎng)基中而第二量的所述可檢測(cè)標(biāo)記被隔離到所述插入物的內(nèi)表面和/或外表面上；以及(d)測(cè)量所述孔中保留在所述培養(yǎng)基中的所述可檢測(cè)標(biāo)記的所述第一量，其中所述第一量與存在于該培養(yǎng)基中的所述多肽的量成反比；由此鑒定表達(dá)所述異源多肽的細(xì)胞。30.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述可檢測(cè)標(biāo)記是放射性探針。31.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述可檢測(cè)標(biāo)記是光學(xué)可檢測(cè)的標(biāo)記。32.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述可檢測(cè)標(biāo)記包含熒光染料。33.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述分析物是分泌的蛋白質(zhì)。34.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述測(cè)量包括將光引向所述孔中的觀察體積，其中所述觀察體積基本上被所述第一量的所述可檢測(cè)標(biāo)記所占據(jù)，但基本上不含所述第二量的所述可檢測(cè)標(biāo)記。35.-種用于測(cè)量孔中液體樣品中存在的分析物的設(shè)備，其包含：(a)多孔裝置，其包含（i)其中插入一個(gè)或多個(gè)如權(quán)利要求1或2所述的插入物的一個(gè)或多個(gè)孔，其中所述孔包含含有經(jīng)標(biāo)記的示蹤物的混合物，該經(jīng)標(biāo)記的示蹤物包含可檢測(cè)標(biāo)記；(b)讀板儀，其能夠（i)從所述一個(gè)或多個(gè)孔檢測(cè)所述標(biāo)記。36.如權(quán)利要求35所述的設(shè)備，其中所述讀板儀包含被編程為產(chǎn)生與所述檢測(cè)的標(biāo)記相對(duì)應(yīng)的信號(hào)的處理器，并且其中所述讀板儀可操作地連接到計(jì)算機(jī)，該計(jì)算機(jī)被配置成（i)從所述讀板儀接收所述信號(hào)；并（ii)從所述信號(hào)生成定量測(cè)量數(shù)據(jù)；以及任選地(iii)將所述定量測(cè)量數(shù)據(jù)中繼到云服務(wù)器。37.如權(quán)利要求35所述的設(shè)備，其中所述讀板儀能夠被配置成從基本不含所述一個(gè)或多個(gè)插入物的限制的體積中檢測(cè)所述標(biāo)記。38.如權(quán)利要求35所述的設(shè)備，其中所述讀板儀能夠檢測(cè)放射性標(biāo)記。39.如權(quán)利要求35所述的設(shè)備，其中所述讀板儀能夠檢測(cè)光學(xué)可檢測(cè)的標(biāo)記。40.如權(quán)利要求39所述的設(shè)備，其中所述光學(xué)可檢測(cè)的標(biāo)記包含熒光染料。41.如權(quán)利要求40所述的設(shè)備，其中所述光學(xué)可檢測(cè)的標(biāo)記包含發(fā)光標(biāo)記。42.-種用于測(cè)量多孔裝置的一個(gè)或多個(gè)孔中液體樣品中存在的分析物的試劑盒，其包含：(a)-個(gè)或多個(gè)如權(quán)利要求1或2所述的插入物；(b)關(guān)于使用所述一個(gè)或多個(gè)插入物進(jìn)行結(jié)合測(cè)定以測(cè)量所述分析物的說(shuō)明書。43.如權(quán)利要求42所述的試劑盒，其進(jìn)一步包含含有可檢測(cè)標(biāo)記的經(jīng)標(biāo)記的示蹤物，其中所述經(jīng)標(biāo)記的示蹤物能夠與所述分析物或所述結(jié)合劑形成復(fù)合物。44.如權(quán)利要求43所述的試劑盒，其中所述結(jié)合劑能夠與所述分析物在第一結(jié)合位點(diǎn)形成復(fù)合物。45.如權(quán)利要求43所述的試劑盒，其進(jìn)一步包含含有可檢測(cè)標(biāo)記的經(jīng)標(biāo)記的示蹤物，其中所述經(jīng)標(biāo)記的示蹤物能夠與所述分析物在第二結(jié)合位點(diǎn)形成復(fù)合物?！疚臋n編號(hào)】G01N1/36GK104520690SQ201380039736【公開日】2015年4月15日申請(qǐng)日期:2013年3月13日優(yōu)先權(quán)日:2012年5月25日【發(fā)明者】李榮皓申請(qǐng)人:珠海愷瑞生物科技有限公司(中國(guó))
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