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專(zhuān)利名稱(chēng)：一種草莓類(lèi)胡蘿卜素成分的含量測(cè)定方法
一種草莓類(lèi)胡蘿卜素成分的含量測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種草莓類(lèi)胡蘿卜素成分的含量測(cè)定方法。
背景技術(shù)：
草莓(Fragaria ananassa Duch)屬薔薇科多年生草本植物,果實(shí)鮮美紅嫩,濃郁多汁，果味芳香并且營(yíng)養(yǎng)豐富，素有“水果皇后”之稱(chēng)。近年來(lái)，隨著草莓經(jīng)濟(jì)價(jià)值的日益走俏，人們開(kāi)始越來(lái)越重視草莓的果實(shí)品質(zhì)。類(lèi)胡蘿卜素(Carotenoids)既是決定水果、蔬菜內(nèi)在營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的重要指標(biāo)，也是影響果實(shí)外觀品質(zhì)和花卉觀賞價(jià)值的重要因素。越來(lái)越多的醫(yī)學(xué)研究表明，除了不少類(lèi)胡蘿卜素是維生素A的前體外，許多類(lèi)胡蘿卜素在猝滅自由基、增強(qiáng)人體免疫力、預(yù)防心血管疾病和防癌抗癌等保護(hù)人類(lèi)健康方面起著重要的作用。目前草莓類(lèi)胡蘿卜素提取和測(cè)定尚未見(jiàn)報(bào)道，缺少準(zhǔn)確可靠的檢測(cè)方法，因此建立一種快速、準(zhǔn)確的測(cè)定方法對(duì)研究草莓果實(shí)類(lèi)胡蘿卜素積累規(guī)律、合理開(kāi)發(fā)和利用我國(guó)草莓資源具有重要的理論價(jià)值和應(yīng)用前景。檢測(cè)植物中類(lèi)胡蘿卜素的方法有紙層析法、柱層析法、薄層層析法、膜層析法和高效液相色譜法。超高效液相色譜(Ultra performance liquid chromatography, UPLC)是近幾年推出的一種新的液相色譜技術(shù)，相較于傳統(tǒng)的分析方法帶來(lái)的分辨率限制、操作繁雜、無(wú)法檢測(cè)到更多種類(lèi)的類(lèi)胡蘿卜素的缺點(diǎn)，UPLC以更短的填料色譜柱，耐受超高壓(40mpa)色譜泵和色譜系統(tǒng)，使分離速度、靈敏度、分離度達(dá)到普通HPLC的9、3、1.7倍，體現(xiàn)出明顯的超高選擇性、超高分離度、超高靈敏度以及超高速等優(yōu)勢(shì)，在蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)、天然產(chǎn)物、環(huán)境監(jiān)測(cè)等眾多高端領(lǐng)域得到應(yīng)用。利用UPLC測(cè)定草莓類(lèi)胡蘿卜素含量國(guó)內(nèi)外還未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題，在于提供一種草莓類(lèi)胡蘿卜素成分的含量測(cè)定方法，該測(cè)定方法簡(jiǎn)單快速，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的:一種草莓類(lèi)胡蘿卜素成分的含量測(cè)定方法，采用超高效液相色譜法在同一色譜條件下對(duì)草莓果實(shí)中的4種分別為葉黃素、β-胡蘿卜素、隱黃質(zhì)以及番茄紅素的類(lèi)胡蘿
卜素成分同時(shí)進(jìn)行含量測(cè)定；該方法包括如下步驟:(I)制備對(duì)照品溶液:分別稱(chēng)取葉黃素、β -胡蘿卜素、β -隱黃質(zhì)、番茄紅素對(duì)照品，加丙酮得到四種單個(gè)對(duì)照品溶液；再分別精密量取四種單個(gè)對(duì)照品溶液，置同一容量瓶中，得到混合對(duì)照品溶液；(2)制備供試品溶液:精密稱(chēng)定草莓果肉，用液氮快速研磨至粉末狀，置具塞錐形瓶中，精密加入丙酮:石油醚=1:2提取劑，于50°C下，避光浸提3小時(shí)，過(guò)濾出上清液；殘?jiān)磸?fù)浸提至殘?jiān)l(fā)白，合并上清液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀40°C蒸至糊狀；加入石油醚和10%K0H-甲醇，避光，室溫萃取，阜化過(guò)夜；然后過(guò)濾，將濾液轉(zhuǎn)入250ml分液漏斗中，并將分液漏斗下層的皂化液轉(zhuǎn)入錐形瓶，用石油醚反復(fù)萃取皂化液至石油醚層為無(wú)色，接著合并石油醚層至另一 250ml分液漏斗中，用雙蒸水反復(fù)洗滌石油醚層，去殘余的丙酮至雙蒸水層為中性，繼續(xù)加入無(wú)水硫酸鈉脫水后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀40°C蒸干，最后用丙酮定容，即得；(3)制定色譜條件:儀器:WATERSACQUITY UPLC H-Class 超高效液相色譜；色譜柱:ACQUITYUPLC BEH C18 規(guī)格為 2.1mmX50mm, 1.7u m 的色譜柱；流動(dòng)相:乙腈與甲醇；流動(dòng)相流速:0.5ml/min ;檢測(cè)波長(zhǎng):450nm；進(jìn)樣體積:5ul ;柱溫:27O;(4)進(jìn)行常規(guī)系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)，注入超高效液相色譜儀進(jìn)行葉黃素、β -胡蘿卜素、β-隱黃質(zhì)以及番茄紅素含量測(cè)定。進(jìn)一步地，流動(dòng)相各組分的體積比為乙腈:甲醇=9:1。進(jìn)一步地，步驟(I)對(duì)照品溶液的制備為:分別精密稱(chēng)取葉黃素、胡蘿卜素、β -隱黃質(zhì)、番爺紅素對(duì)照品各1.0mg,加丙酮定容于5ml容量瓶中，得到濃度為200ug/ml單個(gè)對(duì)照品溶液；分別精密量取單個(gè)對(duì)照品溶液，置同一容量瓶，得到混合對(duì)照品溶液。進(jìn)一步地，步驟(2)中加入的丙酮、石油醚以及10%K0H_甲醇中均含0.1%BHT。本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn):本發(fā)明確定了適用于草莓類(lèi)胡蘿卜素成分測(cè)定的超高效液相法，本方法精密度高、靈敏度強(qiáng)、重復(fù)性好、回收率高，本發(fā)明的流動(dòng)相組合可以將4種類(lèi)胡蘿卜素成分徹底分離，且在同一色譜條件下對(duì)草莓中4種類(lèi)胡蘿卜素成分同時(shí)進(jìn)行分離和含量測(cè)定，流動(dòng)相試劑用量少，方法簡(jiǎn)單快速，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，在5分鐘內(nèi)就可完成檢測(cè)，大大提高了分析速度和減少了溶劑消耗；本發(fā)明方法采用皂化處理工藝步驟，可以提高草莓果實(shí)中類(lèi)胡蘿
卜素提取效果，因此本發(fā)明是適合草莓果實(shí)類(lèi)胡蘿卜素定性和定量分析的最佳方法，為草莓果實(shí)類(lèi)胡蘿卜素研究提供技術(shù)基礎(chǔ)。

下面參照附圖結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明`作進(jìn)一步的說(shuō)明。圖1為葉黃素對(duì)照品溶液超高效液相色譜(UPLC)圖。圖2為β -胡蘿卜素對(duì)照品溶液超高效液相色譜(UPLC)圖。圖3為β -隱黃質(zhì)對(duì)照品溶液超高效液相色譜(UPLC)圖。圖4為番茄紅素對(duì)照品溶液超高效液相色譜(UPLC)圖。圖5為葉黃素、β -隱黃質(zhì)、番茄紅素、β -胡蘿卜素對(duì)照品混合溶液超高效液相色譜(UPLC)圖。圖6為實(shí)施例1的供試品溶液的超高效液相色譜(UPLC)圖。圖7為實(shí)施例2的供試品溶液的超高效液相色譜(UPLC)圖。
具體實(shí)施方式
請(qǐng)參閱圖1 7所示，對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的說(shuō)明。一、實(shí)驗(yàn)條件1、儀器與試藥超高效液相色譜儀為美國(guó)WATERS ACQUITY UPLC H_Class，包括四元溶劑管理器、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、PDA檢測(cè)器以及Empower色譜工作站；β -胡蘿卜素對(duì)照品，番茄紅素對(duì)照品，葉黃素對(duì)照品，β-隱黃質(zhì)對(duì)照品為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；乙睛和甲醇為色譜純，來(lái)自Fisher公司；其他試劑均為分析純。2、流動(dòng)相各組分的體積比為乙腈:甲醇=9:1。3、本試驗(yàn)選擇450nm作為類(lèi)胡蘿卜素檢測(cè)吸收波長(zhǎng)。4、提取劑為丙酮:石油醚=1:2提取劑且含0.1%BHT。二、保留時(shí)間和峰面積的重復(fù)性、精密度試驗(yàn)取上述四種類(lèi)胡蘿卜素對(duì)照品制成四種對(duì)照品溶液，在超高液相色譜儀中分別重復(fù)進(jìn)樣5次，分別計(jì)算保留時(shí)間和峰面積的平均值、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)，來(lái)測(cè)定儀器的性能以及方法的精密型，結(jié)果見(jiàn)表1，四種類(lèi)胡蘿卜素對(duì)照品保留時(shí)間的變異系數(shù)分別為
1.90%、1.43%、1.92%、1.91%,峰面積的變異系數(shù)分別為 1.38%、1.97%、1.98%、1.53%，均小于2%，說(shuō)明超高液相色譜儀性能良好，用該方法測(cè)定類(lèi)胡蘿卜素成分的重現(xiàn)性高。表I四種對(duì)照品的保留時(shí)間和峰面積的平均值、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)(n=5)
權(quán)利要求
1.一種草莓類(lèi)胡蘿卜素成分的含量測(cè)定方法，其特征在于:采用超高效液相色譜法在同一色譜條件下對(duì)草莓果實(shí)中的4種分別為葉黃素、β-胡蘿卜素、β-隱黃質(zhì)以及番茄紅素的類(lèi)胡蘿卜素成分同時(shí)進(jìn)行含量測(cè)定；該方法包括如下步驟: (1)制備對(duì)照品溶液:分別稱(chēng)取葉黃素、β-胡蘿卜素、β-隱黃質(zhì)、番茄紅素對(duì)照品，加丙酮得到四種單個(gè)對(duì)照品溶液；再分別精密量取四種單個(gè)對(duì)照品溶液，置同一容量瓶中，得到混合對(duì)照品溶液； (2)制備供試品溶液:精密稱(chēng)定草莓果肉，用液氮快速研磨至粉末狀，置具塞錐形瓶中，精密加入丙酮:石油醚=1:2提取劑，于50°C下，避光浸提3小時(shí)，過(guò)濾出上清液；殘?jiān)磸?fù)浸提至殘?jiān)l(fā)白，合并上清液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀40°C蒸至糊狀；加入石油醚和10%K0H-甲醇，避光，室溫萃取，阜化過(guò)夜；然后過(guò)濾，將濾液轉(zhuǎn)入250ml分液漏斗中，并將分液漏斗下層的皂化液轉(zhuǎn)入錐形瓶，用石油醚反復(fù)萃取皂化液至石油醚層為無(wú)色，接著合并石油醚層至另一 250ml分液漏斗中，用雙蒸水反復(fù)洗滌石油醚層，去殘余的丙酮至雙蒸水層為中性，繼續(xù)加入無(wú)水硫酸鈉脫水后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀40°C蒸干，最后用丙酮定容，即得； (3)制定色譜條件: 儀器:WATERS ACQUITY UPLC H-Class超高效液相色譜； 色譜柱:ACQUITY UPLC BEH C18 規(guī)格為 2.1mmX 50mm, 1.7u m 的色譜柱； 流動(dòng)相:乙腈與甲醇； 流動(dòng)相流速:0.5ml/min ； 檢測(cè)波長(zhǎng):450nm ； 進(jìn)樣體積:5ul ； 柱溫:27°C ; (4)進(jìn)行常規(guī)系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)，注入超高效液相色譜儀進(jìn)行葉黃素、β-胡蘿卜素、β-隱黃質(zhì)以及番茄紅素含量測(cè)定。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種草莓類(lèi)胡蘿卜素成分的含量測(cè)定方法，其特征在于:流動(dòng)相各組分的體積比為乙腈:甲醇=9:1。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種草莓類(lèi)胡蘿卜素成分的含量測(cè)定方法，其特征在于:步驟(1)對(duì)照品溶液的制備為:分別精密稱(chēng)取葉黃素、β-胡蘿卜素、β-隱黃質(zhì)、番茄紅素對(duì)照品各1.0mg，加丙酮定容于5ml容量瓶中，得到濃度為200ug/ml單個(gè)對(duì)照品溶液；分別精密量取單個(gè)對(duì)照品溶液，置同一容量瓶，得到混合對(duì)照品溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種草莓類(lèi)胡蘿卜素成分的含量測(cè)定方法，其特征在于:步驟(2)中加入的丙酮、石油醚以及10%K0H-甲醇中均含0.1%BHT。
全文摘要
本發(fā)明提供一種草莓類(lèi)胡蘿卜素成分的含量測(cè)定方法，即采用超高效液相色譜法在同一色譜條件下對(duì)草莓果實(shí)中的4種分別為葉黃素、β-胡蘿卜素、β-隱黃質(zhì)以及番茄紅素的類(lèi)胡蘿卜素成分同時(shí)進(jìn)行含量測(cè)定，本發(fā)明以丙酮石油醚=12作為提取劑，皂化提取草莓果實(shí)中類(lèi)胡蘿卜素，以乙腈甲醇=91為流動(dòng)相，檢測(cè)吸收波長(zhǎng)為450nm，檢測(cè)可以在5min內(nèi)完成。本方法精密度高、靈敏度強(qiáng)、重復(fù)性好、回收率高，對(duì)草莓中4種類(lèi)胡蘿卜素成分同時(shí)進(jìn)行分離和含量測(cè)定，方法簡(jiǎn)單快速，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，試劑用量少是適合草莓果實(shí)類(lèi)胡蘿卜素定性和定量分析的最佳方法。
文檔編號(hào)G01N30/88GK103175934SQ201310069898
公開(kāi)日2013年6月26日 申請(qǐng)日期2013年3月5日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月5日
發(fā)明者朱海生, 溫慶放, 陳敏氡 申請(qǐng)人:福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所