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基于磁性表面分子印跡聚合物的阻抗型電化學(xué)傳感器構(gòu)建及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于磁性表面分子印跡聚合物的阻抗型電化學(xué)傳感器的構(gòu)建方法及其在蛋白質(zhì)檢測中的應(yīng)用，屬于電化學(xué)傳感【技術(shù)領(lǐng)域】。它先以血紅蛋白為模板分子，多巴胺為單體，利用多巴胺的自聚合性能和良好的粘附能力，在磁性納米粒子表面合成了分子印跡聚合物；洗脫血紅蛋白后，制備了對血紅蛋白具有良好識別作用的磁性表面分子印跡聚合物，在磁場的作用下將其固定在磁性玻碳電極表面，構(gòu)建了基于磁性分子印跡聚合物的血紅蛋白傳感界面，應(yīng)用于對血紅蛋白的檢測。本發(fā)明構(gòu)建的基于磁性表面分子印跡聚合物的電化學(xué)傳感器，方法簡單，對血紅蛋白的檢測靈敏度高和選擇性好。
【專利說明】基于磁性表面分子印跡聚合物的阻抗型電化學(xué)傳感器構(gòu)建及應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種基于磁性表面分子印跡聚合物的阻抗型電化學(xué)傳感器的構(gòu)建方法及其在蛋白質(zhì)檢測中的應(yīng)用，屬于電化學(xué)傳感【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002]受抗體形成機制的啟發(fā)，人們合成了以模板分子為導(dǎo)向、功能單體交聯(lián)聚合的仿生聚合物，這類聚合物被稱為分子印跡聚合物(MIPs)。MIPs具有與模板分子在空間結(jié)構(gòu)以及官能團上相互匹配、能形成多重作用位點的識別空腔，可以特異性識別目標(biāo)分子。MIPs的機械性強、穩(wěn)定性高、易規(guī)?；a(chǎn)且成本低，克服了生物分子的穩(wěn)定性差、價格昂貴、不易大規(guī)模生產(chǎn)等缺點。傳統(tǒng)的塊體印跡法傳質(zhì)速率慢、結(jié)合容量低、模板分子進出識別位點困難，為了克服這些缺點，人們在各種固體基質(zhì)特別是納米材料表面制備分子印跡聚合物，即表面分子印跡。表面分子印跡聚合物的印跡位點在或接近印跡聚合物表面，模板分子容易洗脫，傳質(zhì)速率快，結(jié)合動力學(xué)易平衡，結(jié)合容量明顯提高。Fe3O4納米粒子(NPs)具有制備方法簡單、磁性強、低毒、生物相容性好等優(yōu)點，是分子印跡聚合物的良好載體，廣泛用于各種傳感界面的構(gòu)建。磁性表面分子印跡聚合物集合了表面分子印跡聚合物和磁性納米材料的優(yōu)勢，常用于從復(fù)雜基質(zhì)中選擇性識別、分離和富集分析物。
[0003]多巴胺(3，4-二羥基苯)含有大量包括兒茶酚、氨基、羧基、π - 鍵等在內(nèi)的非共價鍵功能基團，具有良好的生物相容性和氧化聚合能力，可以在各種無機和有機材料表面形成粘附層，近年來，廣泛用于抗體、酶和血紅蛋白等生物物質(zhì)的固定化，是一種良好的生物固定材料及分子印跡單體。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供了一種基于磁性表面分子印跡聚合物的阻抗型電化學(xué)傳感器構(gòu)建及應(yīng)用。將磁性納米粒子、表面分子印跡聚合和多巴胺的優(yōu)良特性結(jié)合起來，為MIPs的制備提供了綠色環(huán)保的新方法和新途徑，也使傳感界面的構(gòu)建更簡便。
[0005]本發(fā)明是這樣來實現(xiàn)的:以血紅蛋白為模板分子，多巴胺為單體，利用多巴胺的自聚合性能和良好的粘附能力，在磁性納米粒子表面合成了分子印跡聚合物。洗脫血紅蛋白后，制備了對血紅蛋白具有良好識別作用的磁性表面分子印跡聚合物，在磁場的作用下將其固定在磁性玻碳電極表面，構(gòu)建了基于磁性分子印跡聚合物的血紅蛋白傳感界面，應(yīng)用于對血紅蛋白的檢測。
[0006]采用分子印跡技術(shù)，以多巴胺為功能單體、血紅蛋白(Hb)為模板分子、Fe3O4 NPs為支撐材料，氯鉬酸的氧化性使多巴胺氧化聚合為聚多巴胺(PDA)，同時，多巴胺的還原性使得氯鉬酸原位還原為PtNPs，PDA的強粘附性將Hb和PtNPs —起固定于Fe3O4納米粒子表面，一步合成了含有Hb的磁性表面分子印跡聚合物(Fe304/PDA-PtNPs-Hb)，用十二烷基硫酸鈉溶液洗脫模板分子Hb后，制得含有特異性識別Hb的磁性表面分子印跡聚合物(Fe3O4/PDA-PtNPs/MIPs)。利用磁性將Fe304/PDA-PtNPS/MIPS固定于磁性玻碳電極表面，制成可用于識別檢測Hb的傳感器。當(dāng)樣品中含有Hb時，傳感界面的Fe304/PDA-PtNPS/MIPS特異性識別Hb于印跡空腔內(nèi)，由于蛋白質(zhì)的導(dǎo)電性能差，傳感界面的阻抗增加，據(jù)此構(gòu)建了基于磁性表面分子印跡聚合物的阻抗型電化學(xué)傳感器，為蛋白質(zhì)的高靈敏和選擇性檢測提供了普適性平臺，具有良好的應(yīng)用前景。
[0007]本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
(1)Fe3O4磁性納米粒子的制備:將1.35克六水合三氯化鐵溶解在40 mL乙二醇溶液中，再加入1.0克聚乙二醇和3.6克三水合醋酸鈉；將上述混合溶液超聲并攪拌I小時后，轉(zhuǎn)移到聚四氟乙烯高壓反應(yīng)釜中，于180 °C加熱6小時，收集的產(chǎn)物分別用乙醇和超純水清洗三次，用真空干燥箱于60 ° C干燥12小時，即制得粒徑80-120 nm的Fe3O4磁性納米粒子；
(2)磁性分子印跡聚合物的制備:將Fe3O4、多巴胺和血紅蛋白(Hb)溶于20mL pH 6.98的磷酸鹽(PBS)緩沖溶液中，再加入2.1 mL質(zhì)量百分比為2%的氯鉬酸，4 °C下機械攪拌反應(yīng)30分鐘后，在室溫下繼續(xù)攪拌2小時。磁性收集反應(yīng)產(chǎn)物，用二次水清洗三次后，用質(zhì)量百分比為10%的十二烷基硫酸鈉溶液洗脫產(chǎn)物中的Hb，再用超純水洗三次后，將制得含有Hb印跡空腔的磁性分子印跡聚合物分散于10 mM pH 6.98的PBS緩沖溶液中；
(3)傳感器的制備:將磁性玻碳電極依次用1.0,0.3和0.05 μ m的氧化鋁懸濁液打磨，再依次用0.1 mol/L的硝酸、無水乙醇和超純水清洗，用氮氣吹干電極，將10 μ L磁性分子印跡聚合物懸浮液滴加在電極表面，自然晾干后用二次水清洗，即獲得基于磁性表面分子印跡聚合物的阻抗型電化學(xué)傳感器；
上述步驟中，所述步驟(2)中，F(xiàn)e3O4:多巴胺:血紅蛋白的質(zhì)量比為10:10:1。
[0008]基于磁性表面分子印跡聚合物的阻抗型電化學(xué)傳感器的應(yīng)用，是指它在Hb檢測中的應(yīng)用:將制備的傳感器置于含不同濃度的Hb溶液中反應(yīng)15分鐘，用10 mM pH 6.98的PBS緩沖溶液清洗電極表面，以5.0 mM Fe (CN) 64_/3_為電化學(xué)探針測量傳感器的交流阻抗；隨著Hb濃度的增加，結(jié)合到傳感界面的Hb增多，傳感器的阻抗增大，交流阻抗值與Hb濃度在0.14 μ g/mL-2.7 μ g/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。所述阻抗型電化學(xué)傳感器對Hb有良好的響應(yīng)，而對細胞色素C、辣根過氧化物酶和肌紅蛋白的響應(yīng)很小，表明本所述阻抗型電化學(xué)傳感器對Hb的檢測具有良好的選擇性。
[0009]本發(fā)明的技術(shù)效果是:本發(fā)明結(jié)合聚多巴胺的良好生物相容性和粘附性、氯鉬酸的還原性以及Fe3O4 NPs的大比表面積，制備了對Hb具有特異識別作用的Fe304/PDA-PtNPs/MIPs，用于對Hb的高靈敏和特異性識別。優(yōu)點如下:(I)利用PDA的粘附性將Hb和PtNPs一步固定于Fe3O4 NPs制備磁性分子印跡聚合物的方法簡單易行；(2)原位生成的PtNPs不僅對PDA膜具有支撐作用，有助于增強分子印跡膜的穩(wěn)定性和維持印跡空穴的剛性結(jié)構(gòu)，PtNPs良好的導(dǎo)電性，還改善了傳感器的電子傳導(dǎo)性；(3)利用Fe304/PDA-PtNPS/MIPS良好的磁性能，僅僅通過磁固定技術(shù)即可以方便地將其固定在磁性玻碳電極表面，傳感界面的構(gòu)建方法簡單易行；(4)通過調(diào)節(jié)反應(yīng)時間可簡單地實現(xiàn)PDA厚度的可控，使Hb的印跡位點大部分位于Fe3O4 NPs表面，有利于對樣品中Hb的快速識別。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0010]圖1是(A)磁性表面分子印跡聚合物制備過程和(B)傳感器構(gòu)建示意圖。
[0011]圖 2 是 Fe304/PDA_PtNPs/MIPs 的 EDS 圖譜。
[0012]圖 3 是(a) Fe3O4, (b) PDA, (c) Hb, (d) Fe304/PDA-PtNPs_Hb，(e) Fe3O4/PDA-PtNPs/MIPs的紫外-可見吸收光譜圖。
[0013]圖 4 是(a) Fe304/PDA-PtNPs_Hb/MGCE，(b) Fe304/PDA_PtNPs/MIPs/MGCE，(c)電極(b)重結(jié)合Hb后和(d) Fe304/PDA-PtNPs/NIP/MGCE的交流阻抗曲線。
[0014]圖5是Fe304/PDA-PtNPs/MIPs/MGCE對不同濃度Hb的交流阻抗曲線。

【具體實施方式】
[0015]下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明作進一步闡述，但本發(fā)明并不限于此。
[0016]實施例1
(1)Fe3O4磁性納米粒子的制備:將1.35克六水合三氯化鐵溶解在40 mL乙二醇溶液中，再加入1.0克聚乙二醇和3.6克三水合醋酸鈉。將上述混合溶液超聲并攪拌I小時后，轉(zhuǎn)移到聚四氟乙烯高壓反應(yīng)釜中，于180 °C加熱6小時，收集的產(chǎn)物分別用乙醇和超純水清洗三次，用真空干燥箱于60 °C干燥12小時，即制得粒徑80-120 nm的Fe3O4磁性納米粒子；
(2)如圖1(A)所示，磁性分子印跡聚合物的制備:將Fe3O4、多巴胺和Hb溶于20 mL pH6.98的PBS緩沖溶液中，再加入2.1 mL質(zhì)量百分比為2%的氯鉬酸，4 °(:下機械攪拌反應(yīng)30分鐘后，在室溫下繼續(xù)攪拌2小時。磁性收集反應(yīng)產(chǎn)物，用二次水清洗三次后，用質(zhì)量百分比為10%的十二烷基硫酸鈉溶液洗脫產(chǎn)物中的Hb，再用超純水清洗三次后，將制得含有Hb印跡空腔的磁性分子印跡聚合物分散于10 mM pH 6.98的PBS緩沖溶液中；
采用掃描電鏡對Fe3O4和Fe304/PDA_PtNPs/MIPs的形貌進行表征。Fe3O4 NPs表面粗糙，平均粒徑為80-120 nm ;當(dāng)在Fe3O4 NPs表面聚合一層PDA-PtNPs-Hb并洗脫Hb后，F(xiàn)e3O4/PDA-PtNPs/MIPs仍較好地保持了磁性納米粒子的球形結(jié)構(gòu)，平均粒徑增大為90-140 nm,表明PDA-PtNPs/MIPs殼的厚度約為7 nm。Fe304/PDA-PtNPs/MIPs懸浮液分散均勻且呈黑色，當(dāng)施加一個外磁場時，F(xiàn)e304/PDA-PtNPS/MIPS迅速朝向磁鐵方向移動，在磁鐵附近形成一個棕黑色的斑點，溶液則澄清透明。以上結(jié)果表明，F(xiàn)e304/PDA-PtNPS/MIPS有很好的水溶性和磁性能，僅在外磁場作用下即可實現(xiàn)Fe304/PDA-PtNPS/MIPS在磁性電極表面的簡單和有效固定化，同時，利用Fe304/PDA_PtNPs/MIPs的磁性，還可實現(xiàn)復(fù)雜樣品中目標(biāo)物的簡單快速捕獲和分離富集。
[0017]采用X射線能譜(EDS)對Fe304/PDA-PtNPs/MIPs進行元素分析。由圖2可見，F(xiàn)e3O4/PDA-PtNPs/MIPs中含有Pt、Fe、C、O、N等元素的能譜峰，表明在多巴胺的氧化聚合過程中，H2PtCl6被還原為PtNPs而同時固定在PDA膜中，進而負載在Fe3O4 NPs表面。此外，由于多巴胺聚合過程中溶液相的部分離子被嵌入到聚合物中，因此圖中還出現(xiàn)了少量K和Cl元素的能譜峰。
[0018]采用紫外-可見吸收光譜法對Fe304/PDA-PtNPs/MIPs進行了表征(圖3)。由曲線a 可見，F(xiàn)e3O4 在 200-800 nm 內(nèi)沒有明顯的吸收峰；Fe304/PDA-PtNPs-Hb 在 406 nm 和 280nm處均有明顯的吸收峰(曲線d)，分別對應(yīng)于PDA和Hb的特征吸收(曲線b和c) ；Fe304/PDA-PtNPs/MIPs只在280 nm處有明顯的吸收峰(曲線e)，表明大部分模板分子被洗脫。以上結(jié)果表明，采用本發(fā)明方法成功制備了 Fe304/PDA-PtNPS/MIPS。
[0019]實施例2
如圖1 (B)所示，基于磁性表面分子印跡聚合物的阻抗型電化學(xué)傳感器構(gòu)建:將磁性玻碳電極依次用1.0、0.3和0.05 μ m的氧化招懸池液打磨,再依次用0.1 mol/L的硝酸、無水乙醇和超純水清洗，用氮氣吹干電極，將10 μ L磁性分子印跡聚合物懸浮液滴加在電極表面，自然晾干后用二次水清洗，即獲得基于磁性表面分子印跡聚合物的阻抗型電化學(xué)傳感器。
[0020]采用循環(huán)伏安法和交流阻抗法(圖4)對傳感界面的性能進行表征。Fe3O4/PDA-PtNPs-Hb/MGCE在PBS中有一對明顯的氧化還原峰，當(dāng)將Hb洗脫后，F(xiàn)e304/PDA_PtNPs/MIPs/MGCE的氧化還原峰消失。由圖4可見，F(xiàn)e304/PDA-PtNPs_Hb/MGCE的阻抗值較大(曲線a);當(dāng)將Hb洗脫后，F(xiàn)e304/PDA-PtNPs/MIPs/MGCE的阻抗值降低(曲線b);而當(dāng)Fe3O4/PDA-PtNPs/MIPs/MGCE重結(jié)合了樣品中的Hb分子后，阻抗值增加(曲線c );而Fe3O4/PDA-PtNPs/NIPs/MGCE的阻抗值則很低(曲線d)。以上結(jié)果進一步表明，采用本發(fā)明方法成功制備了磁性分子印跡聚合物，而且構(gòu)建的傳感器對Hb具有良好的識別作用。
[0021]實施例3
基于磁性表面分子印跡聚合物的阻抗型電化學(xué)傳感器的應(yīng)用:將制備的傳感器置于含不同濃度Hb的溶液中反應(yīng)15分鐘，用10 mM pH 6.98的磷酸鹽緩沖溶液清洗電極表面，以5.0 mM Fe (CN) 64_/3_為電化學(xué)探針測量傳感器的交流阻抗；隨著Hb的增加，結(jié)合到傳感界面的Hb增多，傳感器的阻抗增大(圖5)。交流阻抗值與Hb濃度在0.14 μ g/mL-2.7 μ g/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，檢出限為0.05 μ g/mL(S/N)。按照相同方法將Fe304/PDA-PtNPs/NIPs/MGCE在不同濃度Hb溶液中浸泡15分鐘，記錄的阻抗值變化不大，表明非特異性吸附的影響很小。本發(fā)明構(gòu)建的傳感器對Hb有良好的響應(yīng)，而對細胞色素C、辣根過氧化物酶和肌紅蛋白的響應(yīng)很小，表明本發(fā)明構(gòu)建的阻抗型電化學(xué)傳感器對Hb的檢測具有良好的選擇性。
【權(quán)利要求】
1.基于磁性表面分子印跡聚合物的阻抗型電化學(xué)傳感器構(gòu)建，其特征在于所述阻抗型電化學(xué)傳感器構(gòu)建包括以下步驟: (I )Fe304磁性納米粒子的制備:將1.35克六水合三氯化鐵溶解在40 mL乙二醇溶液中，再加入1.0克聚乙二醇和3.6克三水合醋酸鈉；將上述混合溶液超聲并攪拌I小時后，轉(zhuǎn)移到聚四氟乙烯高壓反應(yīng)釜中，于180 °C加熱6小時，收集的產(chǎn)物分別用乙醇和超純水清洗三次，用真空干燥箱于60 °C干燥12小時，即制得粒徑80-120 nm的Fe3O4磁性納米粒子； (2)磁性分子印跡聚合物的制備:將Fe3O4、多巴胺和血紅蛋白溶于20mL pH 6.98的磷酸鹽緩沖溶液中，再加入2.1 mL質(zhì)量百分比為2%的氯鉬酸，4 °C條件下機械攪拌反應(yīng)30分鐘后，在室溫下繼續(xù)攪拌2小時；磁性收集反應(yīng)產(chǎn)物，用二次水清洗三次后，用質(zhì)量百分比為10%的十二烷基硫酸鈉溶液洗脫產(chǎn)物中的血紅蛋白，再用超純水洗三次后，將制得含有血紅蛋白印跡空腔的磁性分子印跡聚合物分散于10 mM pH 6.98的磷酸鹽緩沖溶液中； (3)傳感器的制備:將磁性玻碳電極依次用1.0、0.3和0.05 μ m的氧化鋁懸濁液打磨，再依次用0.1 mol/L的硝酸、無水乙醇和超純水清洗，用氮氣吹干電極，將10 μ L磁性分子印跡聚合物懸浮液滴加在電極表面，自然晾干后用二次水清洗，即獲得基于磁性表面分子印跡聚合物的阻抗型電化學(xué)傳感器。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于磁性表面分子印跡聚合物的阻抗型電化學(xué)傳感器構(gòu)建，其特征在于所述步驟(2)中，F(xiàn)e3O4:多巴胺:血紅蛋白的質(zhì)量比為10:10:1。
3.—種權(quán)利要求1或2所述基于磁性表面分子印跡聚合物的阻抗型電化學(xué)傳感器的應(yīng)用，是指它在血紅蛋白檢測中的應(yīng)用:其特征在于，將制備的傳感器置于含不同濃度的血紅蛋白溶液中反應(yīng)15分鐘，用10 mM pH 6.98的磷酸鹽緩沖溶液清洗電極表面，以5.0 mMFe(CN)64_/3_為電化學(xué)探針測量傳感器的交流阻抗；隨著血紅蛋白濃度的增加，結(jié)合到傳感界面的血紅蛋白增多，傳感器的阻抗增大，交流阻抗值與血紅蛋白濃度在0.14 μ g/mL-2.7μ g/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系；所述阻抗型電化學(xué)傳感器對血紅蛋白有良好的響應(yīng)，而對細胞色素C、辣根過氧化物酶和肌紅蛋白的響應(yīng)很小，表明所述阻抗型電化學(xué)傳感器對血紅蛋白的檢測具有良好的選擇性。
【文檔編號】G01N27/26GK104181217SQ201410174948
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2014年4月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月29日
【發(fā)明者】邱建丁, 黃春芳, 梁汝萍 申請人:南昌大學(xué)