高內(nèi)涵圖像流式生物顯微分析系統(tǒng)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種高內(nèi)涵圖像流式生物顯微分析系統(tǒng)，包括：液流系統(tǒng)、光學(xué)系統(tǒng)；液流系統(tǒng)使樣本細(xì)胞懸液中的細(xì)胞在系統(tǒng)鞘液流的約束下聚焦在液流的中心，逐個(gè)流過流動(dòng)室的檢測(cè)窗口；光學(xué)系統(tǒng)包括光源、光路系統(tǒng)、濾光片堆棧；光源包括鹵素?zé)?、激光器；通過光路系統(tǒng)和由多個(gè)二向色鏡構(gòu)成的濾光片堆棧，所述光學(xué)系統(tǒng)產(chǎn)生一個(gè)明場(chǎng)細(xì)胞圖像，一個(gè)六通道熒光細(xì)胞圖像及六個(gè)不同波段的PMT光強(qiáng)信號(hào)。本發(fā)明將流式細(xì)胞術(shù)與熒光顯微成像結(jié)合于一身，它具有多個(gè)檢測(cè)通道，能夠?qū)νㄟ^流動(dòng)室的細(xì)胞逐個(gè)采集的細(xì)胞圖像，并利用分析軟件對(duì)每個(gè)細(xì)胞圖像進(jìn)行量化分析，從而提供細(xì)胞群的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)以及細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞結(jié)構(gòu)和亞細(xì)胞信號(hào)分布的信息。
【專利說明】高內(nèi)涵圖像流式生物顯微分析系統(tǒng)
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及流式細(xì)胞術(shù)，具體地，涉及高內(nèi)涵圖像流式生物顯微分析系統(tǒng)。
【背景技術(shù)】
[0002]流式細(xì)胞術(shù)是一種對(duì)液流中排成單列的細(xì)胞或其它生物微粒(如微球、細(xì)菌、小型模式生物等)逐個(gè)進(jìn)行快速定量分析和分選的技術(shù)。使用傳統(tǒng)的流式細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)，研究人員可以分析成千上萬個(gè)細(xì)胞，獲得每個(gè)細(xì)胞的散射光信號(hào)和熒光信號(hào)的數(shù)值，從而得到細(xì)胞群體的各種統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，并可以找到稀有的細(xì)胞亞群。
[0003]但是傳統(tǒng)流式細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)仍然存在局限，那就是獲得的細(xì)胞信息很有限。細(xì)胞對(duì)研究人員來說，只是散點(diǎn)圖上的一個(gè)點(diǎn)，而不是真實(shí)的細(xì)胞圖像，缺乏細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞結(jié)構(gòu)及亞細(xì)胞水平信號(hào)分布的相關(guān)信息。要想獲得細(xì)胞圖像，研究人員就必須使用顯微鏡進(jìn)行觀察，但顯微鏡能夠觀察的細(xì)胞數(shù)量是非常有限的，很難提供細(xì)胞群體的量化與統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。因此，使用傳統(tǒng)的細(xì)胞分析技術(shù)，我們就只能面對(duì)這樣的兩難選擇，沒有一種技術(shù)可以既提供細(xì)胞群體的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，又獲得細(xì)胞圖像。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004]針對(duì)目前現(xiàn)有技術(shù)中單個(gè)流式細(xì)胞儀存在的缺陷，本發(fā)明的目的是設(shè)計(jì)一個(gè)合理的光學(xué)成像系統(tǒng)，其中，能高速采集經(jīng)過鞘液室的單個(gè)細(xì)胞明場(chǎng)和熒光圖像是設(shè)計(jì)的重點(diǎn)，這樣既可以利用明場(chǎng)圖像來觀察細(xì)胞的形態(tài)特征，又可以利用熒光來測(cè)定細(xì)胞中的關(guān)鍵成分，實(shí)現(xiàn)流式細(xì)胞術(shù)和顯微成像的有機(jī)結(jié)合。
[0005]根據(jù)本發(fā)明提供的一種高內(nèi)涵圖像流式生物顯微分析系統(tǒng)，包括:液流系統(tǒng)、光學(xué)系統(tǒng)；
[0006]液流系統(tǒng)包括流動(dòng)室,流動(dòng)室用于接收注入的樣本細(xì)胞懸液和系統(tǒng)鞘液中，并使樣本細(xì)胞懸液中的細(xì)胞在系統(tǒng)鞘液流的約束下聚焦在液流的中心，逐個(gè)流過流動(dòng)室的檢測(cè)窗口 ；
[0007]光學(xué)系統(tǒng)包括光源、光路系統(tǒng)、濾光片堆棧；
[0008]所述光源，用于照射通過檢測(cè)窗口的細(xì)胞，從而產(chǎn)生光信號(hào)；光源包括用于產(chǎn)生明場(chǎng)細(xì)胞圖像的鹵素?zé)簟⒂糜诋a(chǎn)生熒光細(xì)胞圖像的激光器；
[0009]光源照射細(xì)胞產(chǎn)生的光信號(hào)被物鏡收集，通過兩組楔形光柵分別收集前向光信號(hào)、側(cè)向光信號(hào)到兩個(gè)TDI相機(jī)中，然后通過光路系統(tǒng)傳遞到主要由多個(gè)二向色鏡構(gòu)成的濾光片堆棧，光信號(hào)在濾光片堆棧處被分成不同波段投射到一個(gè)六通道PMT陣列上；進(jìn)而所述光學(xué)系統(tǒng)產(chǎn)生一個(gè)明場(chǎng)細(xì)胞圖像，一個(gè)六通道熒光細(xì)胞圖像及六個(gè)不同波段的PMT光強(qiáng)信號(hào)。
[0010]優(yōu)選地，還包括激光補(bǔ)光裝置，其中，所述激光補(bǔ)光裝置用于通過在細(xì)胞側(cè)向補(bǔ)光來調(diào)整光強(qiáng)度，降低TDI相機(jī)延遲積分的時(shí)間，減少細(xì)胞的高速流動(dòng)帶來的積分時(shí)間過短造成光強(qiáng)偏弱的缺陷。
[0011]優(yōu)選地，還包括自動(dòng)對(duì)焦裝置，其中，所述自動(dòng)對(duì)焦裝置用于利用激光光點(diǎn)法，通過測(cè)量彌散斑的邊緣和尺寸來計(jì)算細(xì)胞的聚焦位置。
[0012]優(yōu)選地，還包括速度測(cè)量裝置，其中，所述速度測(cè)量裝置用于利用激光測(cè)距來測(cè)定限定時(shí)間內(nèi)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)距離，折算出細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)速率。所述TDI相機(jī)根據(jù)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)速率捕獲在流動(dòng)室內(nèi)的單細(xì)胞的圖像。
[0013]優(yōu)選地，還包括分析系統(tǒng)，其中，所述分析系統(tǒng)采用熒光和明場(chǎng)的圖像配準(zhǔn)方式，校正熒光和明場(chǎng)的成像偏差，使得光斑中心重合，并且通過多光譜PMT光信號(hào)和多光譜的熒光圖像來校正圖像的熒光強(qiáng)度，使得輸出的熒光強(qiáng)度與PMT保持一致。
[0014]優(yōu)選地，所述分析系統(tǒng)通過PMT光信號(hào)來調(diào)節(jié)熒光圖像的分割閾值，并且通過圖像微觀結(jié)構(gòu)的分析來確定大量細(xì)胞中的異常細(xì)胞。
[0015]優(yōu)選地，所述物鏡的孔徑數(shù)值NA大于0.75。
[0016]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果:
[0017]1、本發(fā)明既能提供細(xì)胞群的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，又可以獲得單個(gè)細(xì)胞的圖像，從而提供細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞結(jié)構(gòu)和亞細(xì)胞信號(hào)分布的信息。
[0018]2、本發(fā)明將流式細(xì)胞術(shù)與熒光顯微成像結(jié)合于一身，它具有多個(gè)檢測(cè)通道，能夠?qū)νㄟ^流動(dòng)室的細(xì)胞逐個(gè)采集的細(xì)胞圖像，并利用分析軟件對(duì)每個(gè)細(xì)胞圖像進(jìn)行量化分析，從而提供細(xì)胞群的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)以及細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞結(jié)構(gòu)和亞細(xì)胞信號(hào)分布的信息。
[0019]3、本發(fā)明可以用于細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)/通路分析、細(xì)胞間相互作用、分子共定位與胞內(nèi)分子轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞形態(tài)學(xué)、熒光原位雜交、基因表達(dá)分析、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期分析、白細(xì)胞亞群分析。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0020]通過閱讀參照以下附圖對(duì)非限制性實(shí)施例所作的詳細(xì)描述，本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點(diǎn)將會(huì)變得更明顯:
[0021]圖1為本發(fā)明的光路設(shè)計(jì)原理不意圖；
[0022]圖2為本發(fā)明的液流系統(tǒng)結(jié)構(gòu)示意圖。
[0023]圖中:
[0024]I為多通道激光束；
[0025]2為細(xì)胞對(duì)焦器；
[0026]3為聚光鏡；
[0027]4為分光鏡；
[0028]5為濾光片；
[0029]6 為 PMT ;
[0030]7為楔形光柵；
[0031]8 為 TDI 相機(jī)；
[0032]9為分光盤；
[0033]10為二色反光鏡。
【具體實(shí)施方式】
[0034]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。以下實(shí)施例將有助于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)。這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0035]根據(jù)本發(fā)明提供的高內(nèi)涵圖像流式生物顯微分析系統(tǒng)，主要由液流系統(tǒng)、光學(xué)系統(tǒng)、電子系統(tǒng)、流動(dòng)室等幾大部分組成。
[0036]液流系統(tǒng)包括流動(dòng)室，液流系統(tǒng)將樣本細(xì)胞懸液和系統(tǒng)鞘液注入流動(dòng)室中，流動(dòng)室用于使細(xì)胞在鞘液流的約束下聚焦在液流的中心，逐個(gè)流過流動(dòng)室的檢測(cè)窗口。流動(dòng)室具有分選功能，當(dāng)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中設(shè)定了被分選細(xì)胞的特性參數(shù)時(shí)，此類細(xì)胞在形成液滴時(shí)會(huì)被充電，使其帶有正電荷或負(fù)電荷，未被設(shè)定分選參數(shù)的細(xì)胞及空白液滴不帶電荷。帶電荷的液滴在落入電極偏轉(zhuǎn)板的高壓靜電場(chǎng)，依所帶電荷是正或是負(fù)而發(fā)生向右或向左道偏轉(zhuǎn)，落入指定的收集器中，完成細(xì)胞分選的目的。
[0037]光學(xué)系統(tǒng)包括光源、光路系統(tǒng)、濾光片堆棧。
[0038]光源照射通過檢測(cè)窗口的細(xì)胞，從而產(chǎn)生光信號(hào)；光源分為兩種，一種是用于產(chǎn)生明場(chǎng)細(xì)胞圖像的鹵素?zé)?，另一種是用于產(chǎn)生熒光細(xì)胞圖像的激光器。
[0039]光源照射細(xì)胞產(chǎn)生的光信號(hào)被具有很大數(shù)值孔徑(NA:0.75)的物鏡收集，通過兩組楔形光柵收集前向光信號(hào)和側(cè)向光信號(hào)到兩個(gè)TDI相機(jī)中，然后通過光路系統(tǒng)傳遞到主要由二向色鏡構(gòu)成的濾光片堆棧，光信號(hào)在這里被分成不同波段投射到一個(gè)六通道PMT陣列上，整個(gè)成像系統(tǒng)產(chǎn)生一個(gè)明場(chǎng)細(xì)胞圖像，一個(gè)六通道熒光細(xì)胞圖像及六個(gè)不同波段的PMT光強(qiáng)信號(hào)。該光路系統(tǒng)能夠自動(dòng)調(diào)整焦距，并實(shí)時(shí)測(cè)定細(xì)胞運(yùn)動(dòng)速度，而冷CCD采用時(shí)間延遲積分方式進(jìn)行信號(hào)采集，這些手段保證了系統(tǒng)采集到的細(xì)胞圖像的質(zhì)量。
[0040]進(jìn)一步地，高內(nèi)涵圖像流式生物顯微分析系統(tǒng)的創(chuàng)新點(diǎn)在于光路設(shè)計(jì)，結(jié)合了流式細(xì)胞儀和顯微成像的優(yōu)點(diǎn)，充分融合了兩者的優(yōu)勢(shì)。系統(tǒng)中，設(shè)置了分光鏡，把前向散射光和側(cè)向散射光一分為二，一路通過光電倍增管(PMT)米集信號(hào)，另一路通過楔形光柵分解，利用延時(shí)積分CCD(TDI)采集圖像信號(hào)。實(shí)現(xiàn)了宏觀和微觀的有機(jī)結(jié)合。
[0041]該系統(tǒng)創(chuàng)新性的設(shè)計(jì)了激光補(bǔ)光裝置、自動(dòng)對(duì)焦裝置和速度測(cè)量裝置。
[0042]激光補(bǔ)光裝置是為了解決激發(fā)熒光太弱導(dǎo)致成像不清晰，通過在細(xì)胞側(cè)向補(bǔ)光來調(diào)整光強(qiáng)度，降低延遲積分的時(shí)間，減少細(xì)胞的高速流動(dòng)帶來的積分時(shí)間過短造成光強(qiáng)偏弱的缺陷。整個(gè)補(bǔ)光系統(tǒng)在初次使用時(shí)，需要做系統(tǒng)的整體校正，在限定時(shí)間內(nèi)，使得選擇的不同波段的光源強(qiáng)度一致。
[0043]自動(dòng)對(duì)焦裝置解決的是在細(xì)胞的高速流動(dòng)中，選擇最佳的對(duì)準(zhǔn)位置觸發(fā)拍照，此處用的是激光光點(diǎn)法，通過測(cè)量彌散斑的邊緣和尺寸來計(jì)算最佳的聚焦位置。
[0044]速度測(cè)量裝置利用的激光測(cè)距來測(cè)定限定時(shí)間內(nèi)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)距離，折算出細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)速率。配合TDI延遲積分相機(jī)，可以準(zhǔn)確的捕獲在流動(dòng)室內(nèi)的單細(xì)胞的圖像。
[0045]進(jìn)一步地，高內(nèi)涵圖像流式生物顯微分析系統(tǒng)設(shè)計(jì)了一套強(qiáng)大的分析軟件，該分析軟件采用熒光和明場(chǎng)的圖像配準(zhǔn)技術(shù)，校正熒光和明場(chǎng)的成像偏差，使得光斑中心重合，另外通過多光譜PMT光信號(hào)和多光譜的熒光圖像來校正圖像的熒光強(qiáng)度，使得輸出的熒光強(qiáng)度與PMT保持一致。該軟件采用熒光圖像和PMT光信號(hào)融合分析法，通過PMT光信號(hào)來調(diào)節(jié)熒光圖像的分割閾值，使得熒光圖像的生成結(jié)果與流式細(xì)胞儀的結(jié)果保持一致性，并且可以通過圖像微觀結(jié)構(gòu)的分析來確定大量細(xì)胞中的異常細(xì)胞。該軟件可以對(duì)每個(gè)細(xì)胞分析超過500種量化參數(shù)。這些參數(shù)不僅包括細(xì)胞整體的散射光和熒光信號(hào)強(qiáng)度，還包括對(duì)細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞結(jié)構(gòu)及亞細(xì)胞信號(hào)分布的分析。通過在細(xì)胞群體中對(duì)這些參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，分析軟件可以生成細(xì)胞群體的散點(diǎn)圖和柱狀圖，而這些統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)與細(xì)胞圖像是完全整合的，比如點(diǎn)擊散點(diǎn)圖上的點(diǎn)，就可以直觀的看到這個(gè)點(diǎn)代表的細(xì)胞的圖像。另外，使用者還能夠根據(jù)自身研究的特殊需要，進(jìn)行自定義參數(shù)的設(shè)定，進(jìn)行更深入的分析。系統(tǒng)可以生成多通道熒光的混合圖像，也可以生成單通道熒光的獨(dú)立圖像，并且可以通過軟件選擇所需的熒光通道。
[0046]整個(gè)系統(tǒng)可以用于細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)/通路分析、細(xì)胞間相互作用、分子共定位與胞內(nèi)分子轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞形態(tài)學(xué)、熒光原位雜交、基因表達(dá)分析、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期分析、白細(xì)胞亞群分析。
[0047]以上對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了描述。需要理解的是，本發(fā)明并不局限于上述特定實(shí)施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在權(quán)利要求的范圍內(nèi)做出各種變形或修改，這并不影響本發(fā)明的實(shí)質(zhì)內(nèi)容。
【權(quán)利要求】
1.一種高內(nèi)涵圖像流式生物顯微分析系統(tǒng)，其特征在于，包括:液流系統(tǒng)、光學(xué)系統(tǒng)； 液流系統(tǒng)包括流動(dòng)室,流動(dòng)室用于接收注入的樣本細(xì)胞懸液和系統(tǒng)鞘液中，并使樣本細(xì)胞懸液中的細(xì)胞在系統(tǒng)鞘液流的約束下聚焦在液流的中心，逐個(gè)流過流動(dòng)室的檢測(cè)窗Π ； 光學(xué)系統(tǒng)包括光源、光路系統(tǒng)、濾光片堆棧； 所述光源，用于照射通過檢測(cè)窗口的細(xì)胞，從而產(chǎn)生光信號(hào)；光源包括用于產(chǎn)生明場(chǎng)細(xì)胞圖像的鹵素?zé)?、用于產(chǎn)生熒光細(xì)胞圖像的激光器； 光源照射細(xì)胞產(chǎn)生的光信號(hào)被物鏡收集，通過兩組楔形光柵分別收集前向光信號(hào)、側(cè)向光信號(hào)到兩個(gè)TDI相機(jī)中，然后通過光路系統(tǒng)傳遞到主要由多個(gè)二向色鏡構(gòu)成的濾光片堆棧，光信號(hào)在濾光片堆棧處被分成不同波段投射到一個(gè)六通道PMT陣列上；進(jìn)而所述光學(xué)系統(tǒng)產(chǎn)生一個(gè)明場(chǎng)細(xì)胞圖像，一個(gè)六通道熒光細(xì)胞圖像及六個(gè)不同波段的PMT光強(qiáng)信號(hào)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高內(nèi)涵圖像流式生物顯微分析系統(tǒng)，其特征在于，還包括激光補(bǔ)光裝置，其中，所述激光補(bǔ)光裝置用于通過在細(xì)胞側(cè)向補(bǔ)光來調(diào)整光強(qiáng)度，降低TDI相機(jī)延遲積分的時(shí)間，減少細(xì)胞的高速流動(dòng)帶來的積分時(shí)間過短造成光強(qiáng)偏弱的缺陷。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高內(nèi)涵圖像流式生物顯微分析系統(tǒng)，其特征在于，還包括自動(dòng)對(duì)焦裝置，其中，所述自動(dòng)對(duì)焦裝置用于利用激光光點(diǎn)法，通過測(cè)量彌散斑的邊緣和尺寸來計(jì)算細(xì)胞的聚焦位置。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高內(nèi)涵圖像流式生物顯微分析系統(tǒng)，其特征在于，還包括速度測(cè)量裝置，其中，所述速度測(cè)量裝置用于利用激光測(cè)距來測(cè)定限定時(shí)間內(nèi)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)距離，折算出細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)速率，所述TDI相機(jī)根據(jù)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)速率捕獲在流動(dòng)室內(nèi)的單細(xì)胞的圖像。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高內(nèi)涵圖像流式生物顯微分析系統(tǒng)，其特征在于，還包括分析系統(tǒng)，其中，所述分析系統(tǒng)采用熒光和明場(chǎng)的圖像配準(zhǔn)方式，校正熒光和明場(chǎng)的成像偏差，使得光斑中心重合，并且通過多光譜PMT光信號(hào)和多光譜的熒光圖像來校正圖像的熒光強(qiáng)度，使得輸出的熒光強(qiáng)度與PMT保持一致。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的高內(nèi)涵圖像流式生物顯微分析系統(tǒng)，其特征在于，所述分析系統(tǒng)通過PMT光信號(hào)來調(diào)節(jié)熒光圖像的分割閾值，并且通過圖像微觀結(jié)構(gòu)的分析來確定大量細(xì)胞中的異常細(xì)胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高內(nèi)涵圖像流式生物顯微分析系統(tǒng)，其特征在于，所述物鏡的孔徑數(shù)值NA大于0.75。
【文檔編號(hào)】G01N15/14GK104266955SQ201410443148
【公開日】2015年1月7日 申請(qǐng)日期:2014年9月2日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月2日
【發(fā)明者】胡潔, 戚進(jìn), 劉超 申請(qǐng)人:上海凱度機(jī)電科技有限公司
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