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一種蛋白酶譜電泳檢測(cè)方法在快速鑒定細(xì)菌胞外蛋白酶種類上的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種蛋白酶譜電泳檢測(cè)方法在快速鑒定蛋白酶種類上的應(yīng)用，包括以下步驟：a.制備不含蛋白酶底物的SDS聚丙烯酸胺凝膠；b.蛋白酶樣品與不含β-巰基乙醇的加樣緩沖液混勻后加樣，且加樣時(shí)樣品不在沸水浴中加熱；c.電泳；d.洗膠；e.將膠在含有不同蛋白酶抑制劑的底物溶液中浸泡；f.反應(yīng)顯色。本發(fā)明方法能對(duì)不同蛋白酶進(jìn)行定性，比傳統(tǒng)方法在耗時(shí)上明顯縮短；省去了分離純化蛋白酶的繁瑣步驟；重復(fù)性好，靈敏度高，活性條帶測(cè)定準(zhǔn)確，非常有利于后續(xù)的蛋白酶鑒定及有目的的純化工作；可以用于各種蛋白酶類型的檢測(cè)，有廣闊的應(yīng)用空間。
【專利說(shuō)明】一種蛋白酶譜電泳檢測(cè)方法在快速鑒定細(xì)菌胞外蛋白酶種 類上的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于蛋白酶種類鑒定【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種利用蛋白酶譜的活性電泳檢測(cè)技 術(shù)和蛋白酶抑制劑反應(yīng)對(duì)蛋白酶種類進(jìn)行快速鑒定的應(yīng)用方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 蛋白酶（proteases, proteinases)也稱為肽酶（peptidases)，是一類能水解蛋 白質(zhì)和多肽水解的酶類，廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物中，執(zhí)行許多不同的生理功能。 MER0PS數(shù)據(jù)庫(kù)記錄了蛋白酶及蛋白酶的肽類抑制劑的相關(guān)信息，根據(jù)催化中心參與催化的 氨基酸的不同，在該數(shù)據(jù)庫(kù)中蛋白酶可分成6大類：天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、谷 氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶、絲氨酸蛋白酶、蘇氨酸蛋白酶和未知催化類型的蛋白酶。蛋白酶 是用途最廣泛的酶制劑之一，占了世界酶類銷售總額的60%，在食品、醫(yī)藥、紡織、制革、洗 滌劑、化妝品、動(dòng)植物蛋白以及廢物處理等行業(yè)都有著很好的應(yīng)用前景。
[0003] 蛋白酶抑制劑（protease inhibitor, PI)是一類分子量較小的多肽或蛋白質(zhì)，它 們能與蛋白酶活性部位或變構(gòu)部位結(jié)合抑制酶的活性。蛋白酶抑制劑根據(jù)其作用于酶的活 性部位的不同，分為絲氨酸蛋白酶抑制劑、半胱氨酸蛋白酶抑制劑（巰基蛋白酶抑制劑）、 金屬羧肽酶蛋白酶抑制劑和天冬氨酸蛋白酶抑制劑。利用蛋白酶抑制劑可以研究蛋白酶活 性中心的催化特性，初步推斷蛋白酶的種類。
[0004] 利用蛋白酶抑制劑檢測(cè)蛋白酶的常規(guī)方法為，將蛋白酶與抑制劑混合反應(yīng)后，根 據(jù)福林酚法測(cè)定其對(duì)酪蛋白的酶活。該方法中使用的如果是純酶，則可以直觀的判斷蛋白 酶的類型，但如果是粗酶提取液，結(jié)果就不直觀，那是由于粗酶液內(nèi)含多種蛋白酶，利用該 方法，只能粗略判斷粗酶液中可能含有哪種類型的酶，并不能直觀的看到具體是哪一種或 幾種蛋白酶被抑制。
[0005] 本發(fā)明針對(duì)上述問(wèn)題進(jìn)行了技術(shù)改進(jìn)，利用蛋白酶譜的活性電泳產(chǎn)物通過(guò)抑制劑 加底物浸泡的方法解決了上述傳統(tǒng)方法可能的造成的誤差，可有效應(yīng)用于蛋白酶譜定性的 分析。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種更為快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的檢測(cè)蛋白 酶種類的新方法，應(yīng)用該方法，可以不用分離純化蛋白酶，不使用昂貴儀器，就可直觀的對(duì) 細(xì)菌胞外蛋白酶進(jìn)行分類。大大的縮短了實(shí)驗(yàn)周期，實(shí)現(xiàn)對(duì)多種蛋白酶譜進(jìn)行高通量快速 檢測(cè)。
[0007] 本發(fā)明的目的是通過(guò)以下方式實(shí)現(xiàn)的：
[0008] 一種蛋白酶譜電泳檢測(cè)方法在快速鑒定蛋白酶種類上的應(yīng)用方法，包括以下步 驟：
[0009] a.制備不含蛋白酶底物的SDS聚丙烯酰胺凝膠；
[0010] b.蛋白酶樣品與不含β-巰基乙醇的加樣緩沖液混勻后加樣，且加樣時(shí)樣品不在 沸水浴中加熱；
[0011] c.電泳；
[0012] d.洗膠；
[0013] e.將膠放入含有不同蛋白酶抑制劑的底物溶液中浸泡；
[0014] f.反應(yīng)顯色。
[0015] 步驟a制備不含蛋白酶底物的SDS聚丙烯酰胺凝膠的過(guò)程如下：配制質(zhì)量濃度 為 12. 5% 的分離膠：30% w/v 凝膠吧備液 1. 6ml，ρΗ8· 8 的 1. 5mol/L Tris-HCll. 0ml，蒸 餾水1. 4ml，10% w/v過(guò)硫酸銨25 μ 1，TEMED2. 5 μ 1 ;混勻后立即將分離膠注入準(zhǔn)備好的 玻璃板間隙中，用滴管輕輕在其頂層加入lml蒸餾水，以阻止空氣中的氧氣對(duì)凝膠聚合的 抑制作用；聚合完成之后，倒掉覆蓋液體；配制5% w/v的上層濃縮膠：30% w/v凝膠貯備 液0.151111，？?jī)?cè).8的0.5111〇1/11'1^8-!1(：10.351111，蒸餾水0.51111，10%￥八過(guò)硫酸銨2(^1， TEMED2. 0μ 1 ;插入梳子，避免混入氣泡，放置室溫下。
[0016] 步驟b中使用的不含β-巰基乙醇的加樣緩沖液配方為：60mM Tris-HCl ρΗ6. 8、 SDS2%w/v、溴酚藍(lán)0· l%w/v、甘油25% ν/ν組成，加樣時(shí)樣品和加樣緩沖液的體積比為4 : 1〇
[0017] 4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白酶譜電泳檢測(cè)方法在快速鑒定蛋白酶種類上的應(yīng) 用方法，其特征在于，
[0018] 步驟C中電泳緩沖液為ρΗ8. 8的Tris-甘氨酸緩沖液；電泳在冰浴中進(jìn)行；采用垂 直板式不連續(xù)系統(tǒng)電泳方法，5mA穩(wěn)流進(jìn)樣后，10mA穩(wěn)流分離樣品直至溴酚藍(lán)指示劑到達(dá) 膠的最前沿。
[0019] 步驟d中電泳結(jié)束后，用預(yù)冷的2. 5% Triton X-100v/v將膠洗三次，每次15min ; 然后用預(yù)冷的蒸餾水漂洗數(shù)次去除殘留的Triton X-100。
[0020] 步驟e中將膠浸泡在用Tris-HCl緩沖液配制的含有5mM蛋白酶抑制劑和質(zhì)量濃 度為0.1-2%底物的溶液中，30-401：溫浴1-311。
[0021] 優(yōu)選將膠浸泡在用pH8. 0的Tris-HCl緩沖液配制的含有5mM蛋白酶抑制劑和質(zhì) 量濃度為〇. 1%底物的溶液中，37°C溫浴lh后用蒸餾水將膠上殘留的底物沖洗干凈。
[0022] 蛋白酶抑制劑包括苯甲基磺酰氟，1，10-鄰菲啰啉。
[0023] 步驟f的具體過(guò)程為：用0. 1 % w/v的考馬斯亮藍(lán)R-250染色液染色3h,然后用脫 色液脫色直至透明條帶清晰，其中染色液配方為：lg考馬斯亮藍(lán)R-250, 350ml乙醇，100ml 乙酸，加水至l〇〇〇ml ;脫色液配方為：250ml乙醇，100ml乙酸，加水至1000ml。
[0024] 蛋白酶樣品來(lái)源于將細(xì)菌菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，在相應(yīng)培養(yǎng)條件下震蕩培養(yǎng) 3?4天，4°C，13000rpm離心lOmin后得到的上清液，或是其他來(lái)源的蛋白酶液。
[0025] 本發(fā)明中所用的底物為酪蛋白或明膠。
[0026] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果
[0027] 1、現(xiàn)有的蛋白酶抑制劑檢測(cè)蛋白酶的常規(guī)方法是在溶液中將蛋白酶與抑制劑混 合反應(yīng)后，根據(jù)福林酚法測(cè)定其對(duì)酪蛋白的酶活；但一般檢測(cè)的是內(nèi)含多種蛋白粗酶提取 液，那么在多種蛋白酶的混合溶液中只能粗略判斷粗酶液中可能含有哪種類型的酶，因此 并不能直觀的看到具體是哪一種或幾種蛋白酶被抑制，除非對(duì)粗酶提取液進(jìn)行分離純化， 得到純酶后再進(jìn)行檢測(cè)和鑒定，可想而知，這樣的方法很復(fù)雜繁瑣，耗時(shí)耗力。本發(fā)明將蛋 白酶抑制劑反應(yīng)與蛋白酶譜的活性電泳檢測(cè)技術(shù)巧妙的結(jié)合在一起，將其應(yīng)用于蛋白酶種 類的鑒定和檢測(cè)；開(kāi)創(chuàng)性的提出了一種蛋白酶鑒定和檢測(cè)的新方法。該方法通過(guò)蛋白酶譜 的活性電泳，將不同的蛋白酶分離開(kāi)，同時(shí)不影響蛋白酶自身的活性，然后運(yùn)用含蛋白酶抑 制劑的底物浸泡方法，讓不同類型的蛋白酶抑制劑分別與蛋白酶作用，通過(guò)染色與否判斷 蛋白酶的種類。
[0028] 2、本發(fā)明方法能夠?qū)Σ煌鞍酌高M(jìn)行定性，通過(guò)活性電泳將蛋白酶一一分離，讓 它們與抑制劑單獨(dú)作用，可以很準(zhǔn)確的確認(rèn)蛋白酶的種類，傳統(tǒng)方法則完全做不到這一點(diǎn)。
[0029] 3、對(duì)特定蛋白酶進(jìn)行定性分析時(shí)，本發(fā)明省去了分離純化蛋白酶的繁瑣步驟，只 需根據(jù)其蛋白酶譜，就可以結(jié)論，從而在耗時(shí)上比傳統(tǒng)方法大大的縮短了。
[0030] 4、本發(fā)明的方法重復(fù)性好，靈敏度高，活性條帶測(cè)定準(zhǔn)確；因?yàn)殡娪炯夹g(shù)已經(jīng)很成 熟，而且準(zhǔn)確性、重復(fù)性、靈敏度都是公認(rèn)的。
[0031] 5、采用本發(fā)明方法之后的結(jié)果，清晰直觀，一目了然，通過(guò)電泳圖片中條帶的染色 與否可以很輕松準(zhǔn)確的得出結(jié)論。
[0032] 6、本發(fā)明的方法可以清晰的辨別細(xì)菌分泌的不同的胞外蛋白酶，非常有利于后續(xù) 的蛋白酶鑒定及有目的的純化工作。
[0033] 7、本發(fā)明的方法還可以用于各種蛋白酶類型的檢測(cè)，有廣闊的應(yīng)用空間。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0034] 圖1為本發(fā)明方法檢測(cè)假交替單胞菌（Pseudoalteromonas sp. SJN2)胞外蛋白酶 液加入不同抑制劑后的電泳染色圖譜；
[0035] 圖2為本發(fā)明方法檢測(cè)枯草桿菌Bacillus sp. SQN6-1胞外蛋白酶液加入不同抑 制劑后活性電泳圖譜的比較；
[0036] 圖3為本發(fā)明方法檢測(cè)胰蛋白酶液加入不同抑制劑后活性電泳圖譜的比較；
[0037] 圖4為本發(fā)明方法檢測(cè)膠原蛋白酶液加入不同抑制劑后活性電泳圖譜的比較；
[0038] 圖5為蛋白酶抑制劑的不同濃度的電泳染色圖譜；
[0039] 由圖5可知，蛋白酶抑制劑濃度為5mM時(shí)效果最好。

【具體實(shí)施方式】
[0040] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明所保護(hù)范圍不限于 此。
[0041] 本發(fā)明使用的試劑：丙稀酰胺、Ν，Ν' -甲叉雙丙稀酰胺、SDS、過(guò)硫酸銨（Sigma)， Tris(Sigma進(jìn)口分裝），甘氨酸（Sigma進(jìn)口分裝），酪蛋白、明膠（Sigma進(jìn)口分裝）， 0P (1，10-鄰菲羅啉，Aladdin)，PMSF (苯甲基磺酰氟，Sigma)，其他試劑均為普通市售產(chǎn)品。
[0042] 實(shí)施例1 :采用本發(fā)明方法檢測(cè)海洋假交替單胞菌（Pseudoalteromonas sp. SJN2)胞外蛋白酶。海洋假交替單胞菌（Pseudoalteromonas sp. SJN2)為本實(shí)驗(yàn)室分離 自?？诩偃蘸┏遍g帶海沙的菌株。
[0043] 步驟如下：
[0044] (1)將假交替單胞菌劃線接種于固體培養(yǎng)基，在18°C條件下活化培養(yǎng)48h，然后接 種于5ml液體LB培養(yǎng)基中，在18°C、200rpm的條件下震蕩培養(yǎng)24h，然后按5% (v/v)的接 種量接種于l〇〇ml的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在18°C、200rpm的條件下震蕩培養(yǎng)4天，lOOOOrpm離 心，制得發(fā)酵液；
[0045] 上述固體培養(yǎng)基組分如下，均為重量份：
[0046] 蛋白胨1份，酵母粉0. 5份、1. 5份瓊脂，蒸餾水100份，pH為7. 5?8. 0 ;
[0047] LB培養(yǎng)基組分如下，均為重量份：
[0048] 蛋白胨1份，酵母粉0. 5份，蒸餾水100份，pH為7. 5?8. 0 ;
[0049] 發(fā)酵培養(yǎng)基組分如下，均為重量份：玉米粉1分，麩皮0. 5份，豆柏1份，Na2HP040. 4 份，ΚΗ2Ρ040· 03 份，CaCl20. 1 份，蒸餾水 100 份，ρΗ7· 5。
[0050] (2)將步驟⑴制得的發(fā)酵液在4°C條件下，lOOOOrpm離心lOmin，取上清，制得胞 外酶液；4°C冰箱保存待用。
[0051] (3)配制 12.5 % 分離膠：30 % 凝膠貯備液 1.6ml，1.5mol/L Tris-HCl(pH8.8)1.0ml，蒸餾水1.4ml，10%過(guò)硫酸銨25μl，TEMED2.5μl?；靹蚝罅⒓葱?心的將分離膠注入準(zhǔn)備好的玻璃板間隙中，用滴管輕輕在其頂層加入lml蒸餾水，以阻止 空氣中的氧氣對(duì)凝膠聚合的抑制作用。聚合完成之后，倒掉覆蓋液體。配制5%上層濃縮 膠：30%凝膠貯備液 0. 15ml，pH6. 8 的 0. 5mol/L Tris-HClO. 35ml，蒸餾水 0. 5ml，10%過(guò)硫 酸銨20 μ 1，TEMED2. 0 μ 1 ;插入梳子，小心避免混入氣泡，放置室溫下。
[0052] (4)將步驟⑵制得的胞外酶液20 μ 1與5 μ 1加樣緩沖液（使用的加樣緩沖液配 方為：60mMTris-HCl pH6. 8、SDS2%、溴酚藍(lán)0. 1%、甘油25%組成）混勻，樣品不在沸水浴 中加熱。電泳采用垂直板式不連續(xù)系統(tǒng)電泳方法，在Mini PR0TAIN3小型垂直電泳槽和蛋 白質(zhì)電泳儀電泳儀上進(jìn)行。在冰浴中穩(wěn)壓120V電泳，分離樣品直至溴酚藍(lán)指示劑到達(dá)膠的 最前沿。
[0053] (5)電泳結(jié)束后，將步驟⑷得到的電泳凝膠用預(yù)冷的Triton X-100 (2. 5% )洗 三次，每次15min。然后用預(yù)冷的蒸饋水漂洗數(shù)次去除殘留的Triton X-100。
[0054] (6)將步驟（5)清洗好的膠浸泡在用pH8. 0的Tris-HCl緩沖液配制的含有0. 2% 底物以及終濃度為5mM的蛋白酶抑制劑的溶液中，37°C恒溫震蕩浸泡lh，然后用蒸餾水將 膠上殘留的底物沖洗干凈，用0.1% (w/v)的考馬斯亮藍(lán)R-250染色液染色3h，然后用脫色 液脫色直至透明條帶清晰。其中染色液配方為：lg考馬斯亮藍(lán)R-250, 350ml乙醇，100ml乙 酸，加水至l〇〇〇ml ;脫色液配方為：250ml乙醇，100ml乙酸，加水至1000ml。酶譜條帶如 圖1所示。0P特異性結(jié)合二價(jià)金屬離子，可以抑制金屬蛋白酶活性，PMSF為絲氨酸蛋白酶 抑制劑，所以可以從圖1中清楚的看出，其中5條為絲氨酸蛋白酶條帶，因?yàn)榧尤隤MSF后其 活性條帶消失，有4條為金屬蛋白酶，在含有0P的活性電泳圖譜上降解帶消失，說(shuō)明被0P 強(qiáng)烈的抑制了，喪失了酶活性。
[0055] 實(shí)施例2 :采用本發(fā)明的方法檢測(cè)海洋細(xì)菌（Bacillus sp. SQN6-1)胞外蛋白酶的 各操作步驟同實(shí)施例1，發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間為72小時(shí)。海洋Bacillus sp. SQN6-1為本實(shí)驗(yàn)室分 離自?？诩偃蘸┖Ｋ木?。步驟同實(shí)施例1。蛋白酶譜條帶如圖2所示。0P特異性結(jié) 合二價(jià)金屬離子，可以抑制金屬蛋白酶活性，PMSF為絲氨酸蛋白酶抑制劑，所以可以從圖2 中清楚的看出，其中3條為絲氨酸蛋白酶條帶，因?yàn)榧尤隤MSF后其活性條帶消失，有1條為 金屬蛋白酶，在含有0P的活性電泳圖譜上降解帶消失，說(shuō)明被0P強(qiáng)烈的抑制了，喪失了酶 活性。
[0056] 實(shí)施例3 :采用本發(fā)明的方法檢測(cè)胰蛋白酶Trypsin的各操作步驟同實(shí)施例1，所 不同的是采用購(gòu)買的上海生工的商品酶制劑，胰蛋白酶Trypsin,本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖墙?shí)驗(yàn)方 法，胰蛋白酶是典型的絲氨酸蛋白酶，能夠被PMSF抑制劑抑制，但是抑制劑0P對(duì)其酶活并 沒(méi)有影響。胰蛋白酶譜條帶如圖3所示。胰蛋白酶為典型的絲氨酸蛋白酶，底物溶液加入 PMSF，保溫孵育后其活性條帶完全消失，而在含有0P的活性電泳圖譜上降解帶沒(méi)有變化。
[0057] 實(shí)施例4 :采用本發(fā)明的方法檢測(cè)膠原蛋白酶Collagenase蛋白酶的各操作 步驟同實(shí)施例1，所不同的是采用購(gòu)買的Invitrogen公司的商品酶制劑，膠原蛋白酶 Collagenase,本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖墙?shí)驗(yàn)方法，膠原蛋白酶是典型的金屬蛋白酶，能夠被0P抑 制劑抑制，但是抑制劑PMSF對(duì)其酶活并沒(méi)有影響。膠原蛋白酶譜條帶如圖4所示。膠原蛋 白酶為典型的金屬蛋白酶，底物溶液加入PMSF，保溫孵育后其活性條帶基本沒(méi)有變化，而在 含有0P的活性電泳圖譜上降解帶完全消失，說(shuō)明膠原蛋白酶的活性被0P所抑制。
【權(quán)利要求】
1. 一種蛋白酶譜電泳檢測(cè)方法在快速鑒定蛋白酶種類上的應(yīng)用方法，其特征在于，包 括以下步驟： a. 制備不含蛋白酶底物的SDS聚丙烯酰胺凝膠； b. 蛋白酶樣品與不含β_巰基乙醇的加樣緩沖液混勻后加樣，且加樣時(shí)樣品不在沸水 浴中加熱； c. 電泳； d. 洗膠； e. 將膠放入含有不同蛋白酶抑制劑的底物溶液中浸泡； f. 反應(yīng)顯色。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白酶譜電泳檢測(cè)方法在快速鑒定蛋白酶種類上的應(yīng)用方 法，其特征在于， 步驟a制備不含蛋白酶底物的SDS聚丙烯酰胺凝膠的過(guò)程如下：配制質(zhì)量濃度為 12. 5% 的分離膠：30% w/v 凝膠吧備液 1. 6ml，ρΗ8· 8 的 1. 5mol/L Tris-HCll. Oml，蒸饋 水1. 4ml，10% w/v過(guò)硫酸銨25 μ 1，TEMED2. 5 μ 1 ;混勻后立即將分離膠注入準(zhǔn)備好的玻 璃板間隙中，用滴管輕輕在其頂層加入lml蒸餾水，以阻止空氣中的氧氣對(duì)凝膠聚合的抑 制作用；聚合完成之后，倒掉覆蓋液體；配制5 % w/v的上層濃縮膠：30% w/v凝膠貯備 液 0· 15ml，ρΗ6· 8 的 0· 5mol/L Tris-HClO. 35ml，蒸餾水 0· 5ml，10% w/v 過(guò)硫酸銨 20μ 1， TEMED2. 0μ 1 ;插入梳子，避免混入氣泡，放置室溫下。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白酶譜電泳檢測(cè)方法在快速鑒定蛋白酶種類上的應(yīng)用方 法，其特征在于， 步驟b中使用的不含β-巰基乙醇的加樣緩沖液配方為：60mM Tris-HCl ρΗ6.8、 SDS2%w/v、溴酚藍(lán)0· l%w/v、甘油25% v/v組成，加樣時(shí)樣品和加樣緩沖液的體積比為4 : 1〇
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白酶譜電泳檢測(cè)方法在快速鑒定蛋白酶種類上的應(yīng)用方 法，其特征在于， 步驟c中電泳緩沖液為pH8. 8的Tris-甘氨酸緩沖液；電泳在冰浴中進(jìn)行；采用垂直板 式不連續(xù)系統(tǒng)電泳方法，5mA穩(wěn)流進(jìn)樣后，10mA穩(wěn)流分離樣品直至溴酚藍(lán)指示劑到達(dá)膠的 最前沿。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白酶譜電泳檢測(cè)方法在快速鑒定蛋白酶種類上的應(yīng)用方 法，其特征在于， 步驟d中電泳結(jié)束后，用預(yù)冷的2. 5% Triton X-lOOv/v將膠洗三次，每次15min ;然后 用預(yù)冷的蒸餾水漂洗數(shù)次去除殘留的Triton X-100。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白酶譜電泳檢測(cè)方法在快速鑒定蛋白酶種類上的應(yīng)用方 法，其特征在于， 步驟e中將膠浸泡在用Tris-HCl緩沖液配制的含有5mM蛋白酶抑制劑和質(zhì)量濃度為 0.1-2%底物的溶液中，30-401：溫浴1-311。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的蛋白酶譜電泳檢測(cè)方法在快速鑒定蛋白酶種類上的應(yīng)用方 法，其特征在于， 將膠浸泡在用PH8. 0的Tris-HCl緩沖液配制的含有5mM蛋白酶抑制劑和質(zhì)量濃度為 0. 1 %底物的溶液中，37°c溫浴lh后用蒸餾水將膠上殘留的底物沖洗干凈。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1或6或7所述的蛋白酶譜電泳檢測(cè)方法在快速鑒定蛋白酶種類上的 應(yīng)用方法，其特征在于，蛋白酶抑制劑包括苯甲基磺酰氟，1，10-鄰菲啰啉或EDTA。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白酶譜電泳檢測(cè)方法在快速鑒定蛋白酶種類上的應(yīng)用方 法，其特征在于， 步驟f的具體過(guò)程為：用〇. 1 % w/v的考馬斯亮藍(lán)R-250染色液染色3h，然后用脫色液 脫色直至透明條帶清晰，其中染色液配方為：lg考馬斯亮藍(lán)R_250,350ml乙醇，100ml乙酸， 加水至l〇〇〇ml ;脫色液配方為：250ml乙醇，100ml乙酸，加水至1000ml。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白酶譜電泳檢測(cè)方法在快速鑒定蛋白酶種類上的應(yīng)用方 法，其特征在于，蛋白酶樣品來(lái)源于將細(xì)菌菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，在相應(yīng)培養(yǎng)條件下震蕩 培養(yǎng)3?4天，4°C，13000rpm離心lOmin后得到的上清液，或是其他來(lái)源的蛋白酶液。
【文檔編號(hào)】G01N27/447GK104122317SQ201410309658
【公開(kāi)日】2014年10月29日 申請(qǐng)日期:2014年7月1日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月1日
【發(fā)明者】何海倫, 劉丹, 武翠玲, 楊興昊, 吳日幫, 黃嘉封, 黃雅雯 申請(qǐng)人:中南大學(xué)