試樣觀察方法及試樣前處理方法
【專利摘要】減少水生生物內(nèi)外的滲透壓差，防止從生物試樣內(nèi)部的脫水，由此，不會破環(huán)浸漬于離子液體水溶液中的水生生物的自然的形態(tài)，且保持外骨骼及關(guān)節(jié)部的柔軟性。首先向濃度低的離子液體投入水生生物，使離子液體的濃度連續(xù)升高，由此在保持水生生物的生物體時的形狀的狀態(tài)下，將水生生物內(nèi)的水分置換成濃度高的離子液體水溶液。通過利用自然干燥產(chǎn)生的緩慢的離子液體水溶液的濃度上升，由此減少水生生物內(nèi)外的滲透壓差并使水生生物內(nèi)部的離子液體濃度連續(xù)升高。
【專利說明】試樣觀察方法及試樣前處理方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及將觀察對象利用包含離子液體的水溶液進(jìn)行置換并利用掃描電子顯 微鏡等帶電粒子線裝置進(jìn)行觀察的方法、及使用設(shè)置在帶電粒子線裝置內(nèi)的探針來進(jìn)行觀 察對象的操作的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 為了對橈足動物、劍形水蚤、水蚤、鉤蝦、磷蝦、糠蝦、漣蟲、鱟蟲等微小甲殼類、大 型甲殼類的無節(jié)幼蟲、腺介幼蟲、蚤狀幼蟲、微細(xì)幼蟲、以及輪蟲或變形蟲等浮游動物、藍(lán) 藻、綠藻、薄鞭毛藻類等浮游植物等的微小水生生物進(jìn)行調(diào)査?研究，顯微鏡下的形態(tài)觀察 是必須的。尤其是在微小甲殼類、大型甲殼類的幼蟲的分類法中，被稱為附肢的微細(xì)的腿的 形態(tài)觀察被認(rèn)為是重要的。甲殼類的附肢復(fù)雜地互相纏繞，因此為了進(jìn)行詳細(xì)的觀察，需要 對各個附肢進(jìn)行分離?解剖。以往，雖然甲殼類的附肢的分離?解剖能夠在光學(xué)顯微鏡下 實(shí)施，但是在光學(xué)顯微鏡下，解剖器具的操作困難，解剖需要熟練的技術(shù)。
[0003] 電子顯微鏡的焦點(diǎn)深度深，適合于生物的立體的形狀的觀察，在電子顯微鏡的試 樣室內(nèi)能夠操作的探針也存在。然而，當(dāng)將微小水生生物從水中取出并暴露在大氣中時，會 發(fā)生干燥、收縮而無法保留原形。尤其是微小甲殼類或大型甲殼類的幼蟲，即便在使用乙 醇、戊二醛、福爾馬林等進(jìn)行了固定的情況下，也會產(chǎn)生由干燥、收縮引起的變形。在利用電 子顯微鏡進(jìn)行水生生物的觀察的情況下，需要從水或密封劑中取出水生生物，進(jìn)而放入到 真空環(huán)境下，因此難以在無試樣前處理的情況下進(jìn)行電子顯微鏡觀察。
[0004] 為了解決該問題，進(jìn)行了電子顯微鏡用的試樣前處理方法的開發(fā)。代表性的例子 是使用能夠在低真空氣氛中（1.3?270Pa)從零下幾十度到室溫附近地進(jìn)行試樣溫度的控 制的低真空低溫臺來防止生物體軟組織的形態(tài)破壞的方法。例如，在非專利文獻(xiàn)1中，使用 上述方法，成功地進(jìn)行了牽?；ㄈ~原基的低溫觀察。
[0005] 另一方面，作為在電子顯微鏡下對液體中的微細(xì)試樣進(jìn)行觀察及控制的方法，開 發(fā)了使用離子液體的方法。在專利文獻(xiàn)1中記載了利用即使在真空中也不蒸發(fā)的離子液體 的特性而能夠?qū)⑸矬w試樣以保持原形的狀態(tài)在電子顯微鏡下進(jìn)行觀察的方法。尤其是記 載了將含有水分的試樣浸漬在離子液體中然后在真空下將水分除去的方法、以及將用醇等 溶劑稀釋后的離子液體涂敷在試樣上然后在真空下將溶劑除去的方法。
[0006] 在該發(fā)明之后，使用了離子液體的生物試樣的觀察方法不斷地發(fā)展。例如，在非專 利文獻(xiàn)2中，報(bào)告了如下情況：向進(jìn)行了基于鋨酸的蒸氣固定的瓊脂培養(yǎng)基所培養(yǎng)出的抗 酸菌的集群滴下離子液體，得到了認(rèn)為是抗酸菌的集群的原本結(jié)構(gòu)的圖像。
[0007] 在專利文獻(xiàn)2中，公開了使用特定的離子液體來提高離子液體向生物體試樣的滲 透性的內(nèi)容。作為實(shí)施例，示出了裙帶菜、菠菜的莖、棉布、毛發(fā)、老鼠的骨頭、紅血球、鏈球 菌的觀察例。而且，記載了將該離子液體溶解于水等極性溶劑而形成液狀介質(zhì)、并將該液狀 介質(zhì)向試樣含浸、涂敷、霧狀噴射的方法。
[0008] 【在先技術(shù)文獻(xiàn)】
[0009] 【專利文獻(xiàn)】
[0010] 【專利文獻(xiàn)1】國際公開第2007/083756號（US2009/0173882)
[0011]【專利文獻(xiàn)2】日本特開2011-137807號公報(bào)
[0012] 【非專利文獻(xiàn)】
[0013] 【非專利文獻(xiàn)1】植田和弘、山田滿彥、后藤真知夫、松島久、久保木健三，基于低真 空SEM的低溫觀察的嘗試，日本電子顯微鏡學(xué)會第49回學(xué)術(shù)講演會預(yù)備稿集，社團(tuán)法人日 本電子顯微鏡學(xué)會，P274,1993
[0014] 【非專利文獻(xiàn)2】橫山滿、小川綠（小川A e >9 )、市原剛志，基于離子液體的抗酸菌 的SEM觀察，醫(yī)學(xué)生物學(xué)電子顯微鏡技術(shù)學(xué)會第27回學(xué)術(shù)講演會及總會綱要?預(yù)備稿集， 醫(yī)學(xué)生物學(xué)電子顯微鏡技術(shù)學(xué)會，P29, 2011
【發(fā)明內(nèi)容】
[0015] 【發(fā)明要解決的課題】
[0016] 在專利文獻(xiàn)1中，示出了利用離子液體即使在真空中也不蒸發(fā)的特性而能夠?qū)⑸?物體試樣以保持原形的狀態(tài)在電子顯微鏡下進(jìn)行觀察的方法，但是當(dāng)向耐受滲透壓的變化 弱的水生生物直接涂敷離子液體或者向離子液體中投入水生生物時，存在因滲透壓差而使 水生生物內(nèi)的水分喪失，即使在離子液體中水生生物也會干涸的問題。
[0017] 而且，在專利文獻(xiàn)1記載的方法中，將利用醇等溶劑稀釋后的離子液體向試樣涂 敷并將溶劑在真空下除去，因此存在溶劑在真空中發(fā)生溯沸的可能性。在水生生物具有的 殼的內(nèi)部（生物體內(nèi)）發(fā)生溯沸的情況下，殼的內(nèi)壓急劇升高，存在殼破壞而殼的碎片飛散 的可能性。因此，不僅發(fā)生試樣破壞，而且存在將SEM試樣室內(nèi)污染的可能性。
[0018] 在專利文獻(xiàn)2中，雖然記載了將離子液體溶解于水等極性溶劑來形成液狀介質(zhì)、 并將該液狀介質(zhì)向試樣含浸、涂敷、霧狀噴射的方法，但是關(guān)于溶劑的除去方法完全沒有公 開。
[0019] 本發(fā)明的目的在于提供一種試樣觀察方法，在使用離子液體水溶液來抑制耐受滲 透壓的變化弱的水生生物的形態(tài)的變化、損傷的狀態(tài)下利用電子顯微鏡等帶電粒子線觀察 裝置進(jìn)行觀察。
[0020] 【用于解決課題的方案】
[0021] 本發(fā)明的試樣觀察方法的特征在于，將所述觀察對象浸漬于包含離子液體的溶液 中，在使包含離子液體的溶液的滲透壓與觀察對象的內(nèi)部的滲透壓相抗衡的狀態(tài)下，使包 含離子液體的溶液干燥，由此使溶液中的離子液體的濃度上升，向內(nèi)部含浸有離子液體的 觀察對象照射帶電粒子線而取得觀察對象的圖像。
[0022] 【發(fā)明效果】
[0023] 根據(jù)本發(fā)明，能夠在使用離子液體水溶液來抑制耐受滲透壓的變化弱的水生生物 的形態(tài)的變化、損傷的狀態(tài)下利用電子顯微鏡等帶電粒子線觀察裝置進(jìn)行觀察。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0024] 圖1是實(shí)施例1的電子顯微鏡的試樣室側(cè)視圖。
[0025] 圖2是表示實(shí)施例1的試樣觀察方法的次序的說明圖。
[0026] 圖3是實(shí)施例1中的向利用水置換后的鉤蝦滴下離子液體水溶液的狀態(tài)的說明 圖。
[0027] 圖4是在實(shí)施例1中，在鉤蝦的內(nèi)部含浸有離子液體的狀態(tài)的說明圖。
[0028] 圖5是表示使前端部變細(xì)的紙與鉤蝦接觸，由此將附著在腿的周圍等細(xì)小的部位 上的離子液體水溶液除去的方法的說明圖。
[0029] 圖6是實(shí)施例1中的鉤蝦的電子顯微鏡圖像。
[0030] 圖7是實(shí)施例1中的從背面觀察到的鉤蝦的電子顯微鏡圖像。
[0031] 圖8是實(shí)施例1中的使電子顯微鏡用的試樣臺傾斜45°而拍攝到的鉤蝦的電子顯 微鏡圖像。
[0032] 圖9是表示不使用實(shí)施例1的方法而觀察鉤蝦的例子的電子顯微鏡圖像。
[0033] 圖10是實(shí)施例2中的橈足動物的電子顯微鏡圖像。
[0034] 圖11是表示不使用實(shí)施例2的方法而觀察橈足動物的例子的電子顯微鏡圖像。
[0035] 圖12是表示使用設(shè)置在電子顯微鏡的試樣室內(nèi)的探針在電子顯微鏡觀察下對含 浸有離子液體水溶液的水生生物進(jìn)行解剖的說明圖。
【具體實(shí)施方式】
[0036] 首先，更詳細(xì)地說明現(xiàn)有技術(shù)的課題。
[0037] 在利用冷凍后的常溫真空干燥的現(xiàn)有方法即非專利文獻(xiàn)1中，存在關(guān)節(jié)等的柔軟 性喪失而難以移動腿或其他的可動部這樣的問題。因此，在利用設(shè)置在電子顯微鏡的試樣 室內(nèi)的探針等嘗試進(jìn)行水生生物的解剖的情況下，干燥的水生生物可能會發(fā)生破損。
[0038] 在專利文獻(xiàn)1中，示出了利用離子液體即使在真空中也不蒸發(fā)的特性而能夠?qū)⑸?物體試樣以保持原形的狀態(tài)在電子顯微鏡下進(jìn)行觀察的方法，但是當(dāng)向耐受滲透壓的變化 弱的水生生物直接涂敷離子液體或者向離子液體中投入水生生物時，存在因滲透壓差而使 水生生物內(nèi)的水分喪失，即使在離子液體中水生生物也會干涸的問題。而且，雖然記載了將 利用醇等溶劑稀釋后的離子液體向試樣涂敷的方法，但是由于將溶劑在真空下除去，因此 存在溶劑在真空中發(fā)生溯沸的可能性。
[0039] 在非專利文獻(xiàn)2中，在基于鋨酸的蒸氣固定后，向利用瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)的抗酸菌 的集群滴下離子液體，得到了良好的結(jié)果。然而，微小甲殼類等水生生物遠(yuǎn)比抗酸菌等微生 物大型，因此離子液體與生物體內(nèi)的滲透壓差所引起的脫水·破壞效果成為無法忽視的大 問題。而且，鋨酸的蒸氣的毒性高，也存在安全性的問題。在鋨酸的蒸氣固定法以外的基 于戊二醛的化學(xué)固定中，也難以得到能夠與滲透壓差產(chǎn)生的破壞強(qiáng)度相抗衡那樣的機(jī)械強(qiáng) 度。
[0040] 在專利文獻(xiàn)2中，示出了裙帶菜、菠菜的莖、棉布、毛發(fā)、老鼠的骨頭、紅血球、鏈球 菌的觀察例，但未示出水生生物的觀察例。專利文獻(xiàn)2所示的生物體組織為多孔質(zhì)，溶劑迅 速地向試樣內(nèi)部滲透。另一方面，為了非破壞地觀察微小甲殼類等具有殼（外骨骼）的水 生生物的形狀，當(dāng)然需要使離子液體透過非破壞的外骨骼而向固體整體滲透，與生物體組 織相比，浸漬或干燥花費(fèi)時間。而且，水生生物的外骨骼有時不滲離子液體，因此存在必須 將微小甲殼類等水生生物強(qiáng)制性地沉入到離子液體之中的情況。因此，使用離子液體水溶 液來觀察水生生物的方法與使離子液體向解剖完的生物組織或游離細(xì)胞滲透的方法需要 發(fā)明出根本不同的方案。
[0041] 另外，在專利文獻(xiàn)2中雖然記載了將離子液體溶解于水等極性溶劑而形成液狀介 質(zhì)、并將該液狀介質(zhì)向試樣含浸、涂敷、霧狀噴射的方法，但是對于溶劑的除去方法沒有公 開。
[0042] 在本發(fā)明中，首先向濃度低的離子液體（2?10% )投入水生生物，連續(xù)地提高離 子液體的濃度，由此在保持水生生物的生物體時的形狀的狀態(tài)下將水生生物內(nèi)的水分置換 成濃度高的離子液體水溶液。由此，能夠?qū)崿F(xiàn)如下情況：減少水生生物內(nèi)外的滲透壓差，能 夠防止從生物試樣內(nèi)部的脫水，不會破壞浸入到離子液體水溶液中的水生生物的自然的形 態(tài)，且保持外骨骼及關(guān)節(jié)部的柔軟性。尤其是通過利用基于自然干燥的緩慢的離子液體水 溶液的濃度上升，從而實(shí)現(xiàn)了減少水生生物內(nèi)外的滲透壓差并使水生生物內(nèi)部的離子液體 濃度平緩地升高。
[0043] 以下，使用附圖，對本申請發(fā)明的各實(shí)施例進(jìn)行說明。
[0044] 需要說明的是，在以下的實(shí)施例中列舉掃描電子顯微鏡（SEM)來進(jìn)行說明，但本 發(fā)明沒有限定于此。本發(fā)明能夠適用于使用了掃描透射電子顯微鏡（STEM)、離子顯微鏡或 者帶電粒子線的試樣觀察裝置等所進(jìn)行的觀察。
[0045] 另外，以下，作為試樣或觀察對象，列舉水生生物來進(jìn)行說明，但本發(fā)明沒有限定 于此。本發(fā)明對于耐受滲透壓的變化或干燥弱的觀察對象特別有效。作為觀察對象，可考 慮例如橈足動物、劍形水蚤、水蚤、鉤蝦、磷蝦、糠蝦、漣蟲、鱟蟲等微小甲殼類、大型甲殼類 的無節(jié)幼蟲、腺介幼蟲、蚤狀幼蟲、微細(xì)幼蟲、以及輪蟲或變形蟲等浮游動物、藍(lán)藻、綠藻、薄 鞭毛藻類等浮游植物等的微小水生生物、吸水性樹脂、瓊脂、明膠、筠篛等耐受滲透壓的變 化弱的觀察對象、線蟲、蚯蚓、蟯蟲等那樣即使在常壓環(huán)境下因干燥也會發(fā)生變形的觀察對 象、昆蟲、蜱、蜘蛛等那樣雖然在常壓下能抵抗干燥但是在真空環(huán)境下發(fā)生變形的觀察對 象。
[0046] 【實(shí)施例1】
[0047] 圖1示出本實(shí)施例的電子顯微鏡的試樣室側(cè)視圖。本實(shí)施例的電子顯微鏡是掃描 電子顯微鏡，雖然未圖示，但是具備產(chǎn)生電子線的電子槍、包括使電子線會聚的透鏡系統(tǒng)和 使電子線偏轉(zhuǎn)以在試樣上進(jìn)行掃描的偏轉(zhuǎn)器的電子光學(xué)系統(tǒng)、對電子光學(xué)系統(tǒng)進(jìn)行控制的 控制部、基于來自檢測器的信號而生成資料的圖像的圖像生成部、顯示拍攝到的圖像的顯 示器等顯示部、對掃描電子顯微鏡的各功能進(jìn)行操作的鼠標(biāo)或控制臺等操作部、對在內(nèi)部 具有電子源或電子光學(xué)系統(tǒng)的鏡筒進(jìn)行真空排氣的真空泵。可以通過該真空泵將試樣室排 氣成低真空或高真空，也可以通過其它的真空泵對試樣室進(jìn)行排氣，通常電子顯微鏡的試 樣室保持為真空狀態(tài)，因此試樣在真空狀態(tài)下被觀察。需要說明的是，上述的控制部、圖像 生成部可以通過專用的電路基板而作為硬件構(gòu)成，也可以通過與電子顯微鏡連接的計(jì)算機(jī) 所執(zhí)行的程序來構(gòu)成。
[0048] 試樣室內(nèi)部包括電子顯微鏡的物鏡1、從電子顯微鏡的物鏡1向含浸有離子液體 水溶液的試樣2照射的電子束3、對來自含浸有離子液體水溶液的試樣2的反射電子信號4 進(jìn)行檢測的反射電子檢測器5、對來自含浸有離子液體水溶液的試樣2的二次電子信號6進(jìn) 行檢測的二次電子檢測器7。有時也將通過向試樣照射電子束而得到的信號即二次電子、反 射電子等統(tǒng)稱為二次粒子。含浸有離子液體水溶液的試樣2載放于電子顯微鏡用的試樣臺 8之上。試樣臺的材質(zhì)通常為鋁，但是為了得到將試樣臺上的多余的離子液體除去的效果， 也可以使用吸水性的材質(zhì)、例如碳制試樣臺。
[0049] 在本實(shí)施例中，說明以海洋的主要的水生生物即鉤蝦為試樣、并以含浸有離子液 體水溶液的水生生物為觀察對象的試樣來進(jìn)行觀察的方法。在此的實(shí)施例的形態(tài)沒有限定 為鉤蝦，也可以適應(yīng)于以節(jié)肢動物、浮游生物、培養(yǎng)細(xì)胞為代表的水生生物的觀察、耐受滲 透壓的變化弱的其他的試樣。在本實(shí)施例中使用的鉤蝦是體長3mm以下且在濃度90%以上 的乙醇溶液中保存了 1?4個月的鉤蝦，但也可以使用剛采集之后的試樣。
[0050] 圖2是表示通過本發(fā)明的實(shí)施方式得到鉤蝦的電子顯微鏡圖像的次序的說明圖。 首先將保存在乙醇溶液中的鉤蝦放入水中，利用水來置換乙醇。此時，在乙醇溶液中為半透 明的鉤蝦的體色在利用水置換之后變化為不透明、白色。在本實(shí)施例中將鉤蝦浸漬于水中 的時間為80分鐘，但只要能確認(rèn)到體色的變化即可，可以是更短的時間。接著從水中將鉤 蝦撈起，載放于電子顯微鏡用的試樣臺上，利用濾紙等吸引多余的水分。以上的步驟在使用 剛采集之后的鉤蝦時等試樣的內(nèi)部預(yù)先含有水的情況下可以省略。
[0051] 在吸收了多余的水分之后，在試樣干燥之前迅速地利用吸移管等滴下少量的離子 液體水溶液。圖3是表示此狀態(tài)的說明圖。在圖3中，將內(nèi)部用水置換后的鉤蝦10載放在 試樣臺8上。從其上方通過吸移管11滴下離子液體水溶液9。在剛滴下之后，由于鉤蝦10 的內(nèi)部由水含浸著，因此鉤蝦的體色仍然為不透明或白色。
[0052] 在鉤蝦的情況下，最佳的離子液體水溶液的濃度為2?5%，但是該濃度根據(jù)生物 的種類的不同或原料、組成、滲透壓的不同而有所不同。其中，從抑制滲透壓的變化所引起 的試樣的破壞或收縮的觀點(diǎn)出發(fā)，離子液體水溶液中的離子液體的濃度優(yōu)選為10%以下。 在本實(shí)施例中使用了 20ml的離子液體水溶液，但只要能將水生生物浸漬在離子液體水溶 液中即可，可以比20ml多，也可以比20ml少。離子液體優(yōu)選具有親水性的性質(zhì)，在本實(shí)施例 中使用了具有C 8H15N2BF4的化學(xué)式的離子液體。而且，雖然示出了使用水作為離子液體溶液 的溶劑的例子，但也可以是其他的溶劑。作為溶劑，除了水之外，還可考慮例如乙醇、甲醇、 丙酮、己烷、乙醚、含有甲醛的福爾馬林。
[0053] 在向鉤蝦滴下了離子液體水溶液之后，實(shí)施2小時以上的風(fēng)干。需要說明的是，以 下所說的風(fēng)干是指通過在大氣壓下放置一定時間由此自然地使溶劑蒸發(fā)（自然干燥）的方 法。而且，也可以有意地吹風(fēng)而加快干燥，還可以放置在調(diào)整了濕度的干燥器內(nèi)或進(jìn)行過熱 來加快干燥。如此，以下所說的風(fēng)干及自然干燥也包含控制了溫度或濕度的狀態(tài)。當(dāng)控制 溫度或濕度時，能夠控制溶劑干燥的速度。
[0054] S卩，只要是在使離子液體水溶液的滲透壓與觀察對象的內(nèi)部的滲透壓相抗衡的狀 態(tài)下使離子液體水溶液干燥，由此使溶液中的離子液體的濃度上升那樣的溶劑除去方法即 可。根據(jù)本實(shí)施例的干燥方法，溶液中的離子液體的濃度連續(xù)且平緩地上升。而且，在本實(shí) 施例的方法中，使試樣浸漬于離子液體水溶液的同時使溶劑蒸發(fā)，因此能夠保持使離子液 體水溶液的滲透壓與觀察對象的內(nèi)部的滲透壓相抗衡的狀態(tài)。
[0055] 利用自然干燥，從作為初始溶液的低濃度（約2?10% )的離子液體起使?jié)舛绕?緩地上升，由此能夠防止?jié)B透壓差引起的試樣破壞，且能夠?qū)舛忍岣咧良词乖谡婵罩幸?不會發(fā)生干燥破壞的濃度。
[0056] 另外，也可以準(zhǔn)備濃度不同的多個離子液體溶液，依次提高浸漬試樣的溶液的濃 度而進(jìn)行置換，但是利用自然干燥的話簡便得多。
[0057] 圖4是圖示了從圖3的狀態(tài)起經(jīng)過了 4小時的狀態(tài)的說明圖。離子液體水溶液通 過風(fēng)干而量逐漸減少，最終也使鉤蝦的一部分露出。為了保持與通過風(fēng)干而濃縮的離子液 體水溶液12的滲透壓平衡的狀態(tài)，鉤蝦13的內(nèi)部成為濃度更高的狀態(tài)。隨著離子液體水 溶液向鉤蝦的體內(nèi)滲透，鉤蝦的體色從白色變化為透明。由此能夠判斷出在鉤蝦的體內(nèi)含 浸有離子液體。而且，在上述的基于體色變化的方法中預(yù)先測定了在標(biāo)準(zhǔn)的試樣的內(nèi)部含 浸離子液體的時間，是否在實(shí)際觀察所使用的試樣中含浸有離子液體可以根據(jù)浸漬時間來 進(jìn)行判斷。需要說明的是，離子液體是否含浸于觀察對象的判斷并不局限于此，也可以根據(jù) 例如觀察對象的重量來進(jìn)行判斷。
[0058] 在滴下離子液體水溶液并開始風(fēng)干起大致2?3小時的期間，離子液體水溶液的 量持續(xù)減少，但是這以后離子液體水溶液的量不再變化，風(fēng)干完成。但是，風(fēng)干時間受到氣 候條件及離子液體水溶液的滴下量的影響。此時，由于離子液體水溶液與鉤蝦內(nèi)部的滲透 壓相等，因此不會引起試樣的破壞，即使放置一晝夜以上也能維持形態(tài)。
[0059] 在風(fēng)干完成之后，利用濾紙等紙或者薄紗等的擦拭構(gòu)件14來吸引多余的離子液 體水溶液。如圖5所示，使前端部變細(xì)的擦拭構(gòu)件14與鉤蝦接觸，由此能夠除去附著在腿 的周圍等細(xì)小的部位上的離子液體水溶液。此時，預(yù)先向?yàn)V紙或擦拭紙（Kimwipes(注冊商 標(biāo)）等）等紙、或者薄紗等滲入水或親水性的溶液，由此能夠吸附附著在腿與腿之間等細(xì)小 的部位上的離子液體水溶液。這是因?yàn)椋谠嚇颖砻嬉蚋稍锒承栽黾拥碾x子液體水溶液 通過與濾紙或擦拭紙等紙、或者薄紗等中含有的水或親水性的溶液接觸，而粘性下降，容易 由紙或擦拭紙等紙、或者薄紗等吸收。在難以除去離子液體水溶液的情況下，也可以利用濃 度低的離子液體水溶液或水進(jìn)行清洗。而且，若將鉤蝦移換到吸水性的材質(zhì)例如碳制試樣 臺上，則除去多余的離子液體水溶液的效果會進(jìn)一步提高。
[0060] 在將多余的離子液體除去之后，利用電子顯微鏡實(shí)施觀察。觀察所使用的電子顯 微鏡優(yōu)選為掃描電子顯微鏡（SEM)。圖6是使用本實(shí)施例的方法并利用電子顯微鏡拍攝鉤 蝦所得的圖像15。示出了能夠不使耐受滲透壓的變化弱的鉤蝦的形態(tài)發(fā)生變化、損傷而通 過電子顯微鏡進(jìn)行拍攝的情況。
[0061] 由于鉤蝦表面的離子液體水溶液也能除去，因此在圖6中，觸毛16等細(xì)小的結(jié)構(gòu) 也沒有被離子液體水溶液覆蓋而能進(jìn)行觀察。置換成離子液體水溶液的鉤奸在真空環(huán)境下 放置之后也能確保柔軟性，因此在第一次電子顯微鏡觀察后，可以將鉤蝦翻轉(zhuǎn)而進(jìn)行背面 的觀察，或者進(jìn)而可以在移動腿等的關(guān)節(jié)之后再次通過電子顯微鏡進(jìn)行觀察。圖7是這樣 進(jìn)行第一次電子顯微鏡觀察后，進(jìn)行翻轉(zhuǎn)，而再次通過電子顯微鏡觀察到的鉤蝦的圖像17。 與圖6為同一檢體且圖6中觀察的相反側(cè)為圖7。但是，關(guān)于圖7中的腿18,由于從圖6的 狀態(tài)移動了腿的關(guān)節(jié)，因此腿的方向發(fā)生變化。
[0062] 如圖7所示，用離子液體水溶液置換后的鉤蝦雖然能夠從電子顯微鏡用的試樣臺 容易地取下，但是通過極少量的離子液體水溶液而吸附于試樣臺，因此即便使電子顯微鏡 用的試樣臺傾斜釣蝦也不會滑落，能夠穩(wěn)定地進(jìn)行觀察。圖8是實(shí)際上使試樣臺傾斜45° 來觀察用離子液體水溶液置換后的鉤蝦的電子顯微鏡圖像19。
[0063] 作為參考，在圖9中示出未使用本實(shí)施例的方法而觀察鉤蝦的例子。左圖是不使 用離子液體而觀察鉤蝦得到的電子顯微鏡圖像20,右圖是將左圖的中央四畫框內(nèi)的腿放大 得到的電子顯微圖像21。圖9所示的例子除了使用離子液體這點(diǎn)以外，在與本實(shí)施例相同 的條件下進(jìn)行了觀察。明確可知在不使用本實(shí)施例而通過電子顯微鏡來觀察常溫的鉤蝦 時，試樣會發(fā)生干燥、干涸。尤其是從符號21所示的圖像可知，就腿而言，干燥所引起的變 形、破壞顯著。
[0064] 需要說明的是，以上說明的試樣制作方法可以通過試樣制作裝置自動地或按照使 用者的指示?操作來進(jìn)行。這樣的試樣制作裝置也被稱作前處理裝置。在通過試樣制作裝 置來進(jìn)行本實(shí)施例的方法的情況下，該裝置至少具備：使觀察對象浸漬于包含離子液體的 溶液的浸漬機(jī)構(gòu)；在使包含離子液體的溶液的滲透壓與觀察對象的內(nèi)部的滲透壓相抗衡的 狀態(tài)下，使包含離子液體的溶液干燥，由此使溶液中的離子液體的濃度上升的干燥機(jī)構(gòu)。在 此，浸漬機(jī)構(gòu)可以是例如微型吸移管那樣少量提取包含離子液體的溶液并向觀察對象滴下 的機(jī)構(gòu)。而且，干燥機(jī)構(gòu)可以是在大氣壓下預(yù)先放入有觀察對象的試樣室，也可以是能夠控 制溫度或濕度的干燥器等。而且，在干燥所需的時間預(yù)先確定的情況下，可以通過試樣制作 裝置具備的定時器來管理干燥時間。
[0065] 而且，試樣制作裝置可以具備能夠?qū)τ筛稍餀C(jī)構(gòu)干燥中的所述觀察對象進(jìn)行觀察 的光學(xué)顯微鏡，由此來確認(rèn)干燥引起的離子液體的減少程度、是否因離子液體而使觀察對 象發(fā)生了收縮或變形。而且，如上述那樣，在根據(jù)觀察對象的顏色的變化來判斷是否含浸有 離子液體的情況下有效。
[0066] 而且，在上述的實(shí)施例中，利用濾紙等紙或者薄紗等的擦拭構(gòu)件14吸引了干燥后 殘留的包含離子液體的溶液，但也可以在試樣制作裝置上安裝同樣的擦拭構(gòu)件來形成將由 干燥機(jī)構(gòu)干燥后殘留的包含離子液體的溶液除去的機(jī)構(gòu)。
[0067] 另外，可以使試樣制作裝置具備根據(jù)觀察對象的重量變化來檢測所述包含離子液 體的溶液的干燥的進(jìn)展?fàn)顩r的機(jī)構(gòu)，由此利用于離子液體是否含浸于觀察對象的判斷。 [0068]【實(shí)施例2】
[0069] 在本實(shí)施例中，說明以海洋的主要的水生生物即橈足動物（劍形水蚤類）為試樣 來觀察含浸有離子液體水溶液的水生生物的方法、及使用含浸有離子液體水溶液的水生生 物來制成光學(xué)顯微鏡用標(biāo)本的方法。需要說明的是，以下，對于與實(shí)施例1同樣的部分，省 略說明。在本實(shí)施例中使用的橈足動物是體長2mm以下且在濃度90 %以上的乙醇溶液中保 存了 1個月的橈足動物，但也可以使用剛采集之后的試樣。
[0070] 首先將保存在乙醇溶液中的橈足動物放入水中，利用水來置換乙醇。此時，在乙醇 溶液中為半透明的橈足動物的體色在利用水置換之后變化為不透明、白色。在本實(shí)施例中 將橈足動物浸漬于水的時間為80分鐘，但是只要能確認(rèn)到體色的變化即可，也可以為更短 的時間。接著，從水中將橈足動物撈起，載放于電子顯微鏡用的試樣臺，利用濾紙等吸引多 余的水分。以上的步驟在使用剛采集之后的鉤蝦時等試樣的內(nèi)部預(yù)先含有水的情況下可以 省略。
[0071] 在吸收了多余的水分之后，在試樣干燥之前迅速地利用吸移管等滴下少量的離子 液體水溶液，其方法與圖3相同。在橈足動物的情況下，最佳的離子液體水溶液的濃度為 10%，但是該濃度根據(jù)生物的種類的不同或原料、組成、滲透壓的不同而有所不同。在本實(shí) 施例中使用了 20ml的離子液體水溶液，但只要能將水生生物浸漬在離子液體水溶液中即 可，可以比20ml多，也可以比20ml少。離子液體優(yōu)選具有親水性的性質(zhì)，在本實(shí)施例中使 用了具有c8h15n2bf4的化學(xué)式的離子液體。而且，雖然示出了使用水作為離子液體溶液的溶 齊?的例子，但也可以是其他的溶齊?。作為溶劑，除了水之外，還可考慮例如乙醇、甲醇、丙酮、 己烷、乙醚、含有甲醛的福爾馬林。
[0072] 在向橈足動物滴下離子液體水溶液之后，實(shí)施2小時以上的風(fēng)干。風(fēng)干與實(shí)施例1 同樣，廣泛地表示在使離子液體水溶液的滲透壓與觀察對象的內(nèi)部的滲透壓相抗衡的狀態(tài) 下使離子液體水溶液干燥、由此連續(xù)地使所述溶液中的離子液體的濃度上升的溶劑除去方 法。離子液體水溶液通過風(fēng)干而量逐漸減少，最終也使橈足動物的一部分露出。隨著離子液 體水溶液向橈足動物的體內(nèi)滲透，橈足動物的體色從白色變化為透明。由此能夠判斷出在 鉤蝦的體內(nèi)含浸有離子液體。而且，在上述的基于體色變化的方法中預(yù)先測定了在標(biāo)準(zhǔn)的 試樣的內(nèi)部含浸離子液體的時間，是否在實(shí)際觀察所使用的試樣中含浸有離子液體可以根 據(jù)浸漬時間來進(jìn)行判斷。在滴下離子液體水溶液并開始風(fēng)干起大致2?3小時的期間，離子 液體水溶液的量持續(xù)減少，但是這以后離子液體水溶液的量不再變化，風(fēng)干完成。但是，風(fēng) 干時間受到氣候條件及離子液體水溶液的滴下量的影響。此時，由于離子液體水溶液與橈 足動物內(nèi)部的滲透壓相等，因此不會引起試樣的破壞，即使放置一晝夜以上也能維持形態(tài)。
[0073] 在風(fēng)干完成之后，利用濾紙或擦拭紙等紙或者薄紗等的擦拭構(gòu)件來吸引多余的離 子液體水溶液。其方法與圖5相同。此時，預(yù)先向?yàn)V紙或Kimwipes等紙、或者薄紗等滲入水 或親水性的溶液，由此能夠吸附附著在腿與腿之間等細(xì)小的部位上的離子液體水溶液。這 是因?yàn)椋蛟嚇颖砻娴母稍锒承栽黾拥碾x子液體水溶液通過與濾紙或擦拭紙等紙、或者 薄紗等中含有的水或親水性的溶液接觸，而粘性下降，容易由紙或擦拭紙等紙、或者薄紗等 吸收。在難以除去離子液體水溶液的情況下，也可以利用濃度低的離子液體水溶液或水進(jìn) 行清洗。而且，若將橈足動物移換到吸水性的材質(zhì)例如碳制試樣臺上，則除去多余的離子液 體水溶液的效果會進(jìn)一步提高。
[0074] 在將多余的離子液體除去之后，利用電子顯微鏡實(shí)施觀察。觀察所使用的電子顯 微鏡優(yōu)選為掃描電子顯微鏡（SEM)。SEM的基本結(jié)構(gòu)如實(shí)施例1中說明的那樣。圖10是使 用本實(shí)施例的方法并利用電子顯微鏡拍攝橈足動物所得的圖像，示出了能夠不使耐受滲透 壓的變化弱的橈足動物的形態(tài)發(fā)生變化、損傷而通過電子顯微鏡進(jìn)行拍攝的情況。圖10的 電子顯微鏡圖像22是使試樣臺傾斜45°而拍攝到的圖像，根據(jù)該說明圖還明確可知能夠 進(jìn)行傾斜觀察。
[0075] 作為參考，圖11中示出不使用本實(shí)施例的方法對橈足動物進(jìn)行了觀察的例子。圖 11所示的例子除了使用離子液體這點(diǎn)以外，在與本實(shí)施例相同的條件下進(jìn)行了觀察。根據(jù) 圖11的電子顯微鏡圖像23可知，橈足動物極其不耐受干燥，在常溫、常壓下顯著變形。不 使用本實(shí)施例對常溫下干燥的橈足動物進(jìn)行觀察是不可能的。
[0076] 通常橈足動物的觀察在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行。根據(jù)本實(shí)施例那樣的觀察試樣制成方 法，借助極少量的離子液體水溶液而吸附于試樣臺，因此無需將試樣利用碳膠帶、碳糊劑等 粘接劑固定于試樣臺。因此，在電子顯微鏡觀察及解剖后，從電子顯微鏡用的專用試樣臺 取下試樣，利用水或其他的密封劑將作為試樣的水生生物密封，從而能夠制成光學(xué)顯微鏡 用標(biāo)本。在利用電子顯微鏡觀察了橈足動物之后，將電子顯微鏡觀察后的由離子液體水溶 液置換了的橈足動物利用水或加拿大香脂等密封劑密封，由此能夠在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀 察。
[0077] 就利用以往的冷凍干燥法等進(jìn)行了處理的橈足動物而言，在橈足動物內(nèi)部產(chǎn)生空 洞，難以使水或加拿大香脂侵入至該空洞，存在產(chǎn)生氣泡的問題。若是本實(shí)施例的方法那樣 水生生物的內(nèi)部由離子液體水溶液充滿的狀態(tài)，則在橈足動物內(nèi)部不會產(chǎn)生空洞，即使制 成光學(xué)顯微鏡用標(biāo)本，在水生生物內(nèi)部產(chǎn)生氣泡的可能性也少。
[0078] 需要說明的是，本實(shí)施例的試樣制作方法也可以通過實(shí)施例1記載的試樣制作裝 置來執(zhí)行。而且，試樣制作裝置可以具備對含浸有離子液體的觀察對象滴下密封劑而如上 述那樣制作光學(xué)顯微鏡用標(biāo)本的光學(xué)顯微鏡用試樣制成機(jī)構(gòu)。
[0079]【實(shí)施例3】
[0080] 在微小甲殼類、大型甲殼類的幼蟲的分類法中，被稱為附肢的微細(xì)的腿的形態(tài)觀 察被認(rèn)為是重要的。甲殼類的附肢由于復(fù)雜地互相纏繞，因此為了進(jìn)行詳細(xì)的觀察，需要對 各個附肢進(jìn)行分離?解剖。以往，甲殼類的附肢的分離?解剖在光學(xué)顯微鏡下實(shí)施，但是在 光學(xué)顯微鏡下解剖器具的操作困難，解剖需要熟練的技術(shù)。在本實(shí)施例中，為了解決該問題 點(diǎn)，說明在電子顯微鏡下對甲殼類進(jìn)行解剖的方法。需要說明的是，以下，對于與實(shí)施例1 同樣的部分，省略說明。
[0081] 圖12是表示使用設(shè)置在電子顯微鏡的試樣室內(nèi)的探針在電子顯微鏡觀察下對因 含浸有離子液體水溶液而得到了柔軟性的水生生物進(jìn)行解剖的情況的說明圖。在圖12中， 因含浸有離子液體水溶液而得到了柔軟性的水生生物24是進(jìn)行了實(shí)施例1或?qū)嵤├?所 示的處理的試樣。設(shè)置在電子顯微鏡的試樣室內(nèi)的探針25優(yōu)選能夠邊進(jìn)行電子顯微鏡觀 察邊進(jìn)行操作。通過在基于電子線的圖像取得中進(jìn)行試樣的操作，由此能得到試樣的動態(tài) 圖像，能夠視覺性地識別試樣的動態(tài)狀態(tài)。
[0082] 在水生生物24的方向不適合于實(shí)施解剖的情況下，使用探針25使水生生物24以 滾動的方式旋轉(zhuǎn)。水生生物滾動時的狀態(tài)與圖7同樣。在圖12的說明圖中，電子顯微鏡用 的試樣臺8根據(jù)需要可以傾斜。
[0083] 在調(diào)好水生生物24的方向之后，使用探針25來移動附肢的關(guān)節(jié)或者進(jìn)行附肢的 切離等解剖。此時若在電子顯微鏡試樣室內(nèi)設(shè)置2根以上的探針，則其操作變得容易。因 此，電子顯微鏡試樣室內(nèi)的探針的根數(shù)優(yōu)選為2根以上。用設(shè)置在電子顯微鏡的試樣室內(nèi) 的探針解剖后的水生生物的腿26由探針25切離。
[0084] 如本實(shí)施例那樣將水生生物中的水或其他的溶液置換成離子液體水溶液并利用 電子顯微鏡進(jìn)行觀察的方法具有如下效果：即使在電子顯微鏡內(nèi)的高真空環(huán)境下，也不會 喪失關(guān)節(jié)等的柔軟性，能夠移動腿或其他的可動部。因此，具有在電子顯微鏡觀察后或電子 顯微鏡觀察中，能夠使用設(shè)置在電子顯微鏡試樣室內(nèi)的探針等一邊移動水生生物的腿或其 他的可動部一邊進(jìn)行觀察這樣的效果。而且，也能夠進(jìn)行作為試樣的水生生物的解剖。 [0085] 解剖后的水生生物的腿由離子液體水溶液置換，因此具有導(dǎo)電性。因此，能夠減少 與充電（charge up)現(xiàn)象相伴的碎片的飛散、及碎片的飛散造成的電子顯微鏡室內(nèi)的污染。 而且，用離子液體水溶液置換后的水生生物保持著柔軟性，因此能夠在不破壞試樣的情況 下進(jìn)行彎曲附肢等的操作。
[0086] 解剖后的試樣直接在電子顯微鏡下進(jìn)行觀察，但是根據(jù)需要，也可以利用其他的 分析設(shè)備、例如光學(xué)顯微鏡進(jìn)行再觀察。這種情況下，可以如實(shí)施例2說明的方法那樣利用 密封劑來制成光學(xué)顯微鏡用標(biāo)本。在利用生物顯微鏡進(jìn)行觀察的情況下，也可以在光學(xué)顯 微鏡用的玻璃載片或玻璃蓋片上進(jìn)行上述的處理。通常玻璃為絕緣物，會發(fā)生充電現(xiàn)象，但 是也可以通過向玻璃表面較薄地涂敷離子液體來附加導(dǎo)電性。
[0087] 需要說明的是，本發(fā)明沒有限定為上述的實(shí)施例，可以包含各種變形例。例如，上 述的實(shí)施例是為了容易理解本發(fā)明而詳細(xì)說明的實(shí)施例，沒有限定為必須具備所說明的全 部結(jié)構(gòu)。而且，可以將某實(shí)施例的結(jié)構(gòu)的一部分置換成其他的實(shí)施例的結(jié)構(gòu)，而且，也可以 向某實(shí)施例的結(jié)構(gòu)中加入其他的實(shí)施例的結(jié)構(gòu)。而且，對于各實(shí)施例的結(jié)構(gòu)的一部分，可以 進(jìn)行其他的結(jié)構(gòu)的追加、刪除、置換。
[0088] 【符號說明】
[0089] 1 物鏡
[0090] 2 試樣
[0091] 3電子束
[0092] 4反射電子信號
[0093] 5反射電子檢測器
[0094] 6二次電子信號
[0095] 7二次電子檢測器
[0096] 8試樣臺
[0097] 9離子液體水溶液
[0098] 10用水置換后的鉤蝦
[0099] 11吸移管
[0100] 12濃縮后的離子液體水溶液
[0101] 13 鉤蝦
[0102] 14擦拭構(gòu)件
[0103] 15用離子液體水溶液置換后的鉤蝦的電子顯微鏡圖像
[0104] 16鉤蝦的觸毛
[0105] 17在第一次電子顯微鏡觀察后，進(jìn)行翻轉(zhuǎn)，而再次通過電子顯微鏡觀察到的鉤蝦 的電子顯微鏡圖像
[0106] 18在第一次電子顯微鏡觀察后移動了關(guān)節(jié)的腿
[0107] 19使電子顯微鏡試樣臺傾斜45°而觀察到的用離子液體水溶液置換后的鉤蝦的 電子顯微鏡圖像
[0108] 20不使用離子液體而觀察鉤蝦得到的電子顯微鏡圖像
[0109] 21將因干燥而變形的鉤蝦的腿放大得到的電子顯微鏡圖像
[0110] 22用離子液體水溶液置換后的橈足動物的電子顯微鏡圖像
[0111] 23不使用離子液體而觀察橈足動物得到的電子顯微鏡圖像
[0112] 24水生生物
[0113] 25 探針
[0114] 26水生生物的腿
【權(quán)利要求】
1. 一種試樣觀察方法，其檢測向觀察對象照射帶電粒子線而得到的信號來取得所述觀 察對象的圖像， 所述試樣觀察方法的特征在于，包括： 將所述觀察對象浸漬于包含離子液體的溶液中的浸漬步驟； 在使所述包含離子液體的溶液的滲透壓與所述觀察對象的內(nèi)部的滲透壓相抗衡的狀 態(tài)下，使所述包含離子液體的溶液干燥，由此使所述溶液中的離子液體的濃度上升的干燥 步驟； 向內(nèi)部含浸有所述包含離子液體的溶液的觀察對象照射所述帶電粒子線來取得所述 觀察對象的圖像的觀察步驟。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試樣觀察方法，其特征在于， 在所述浸漬步驟之前包括使所述觀察對象含浸水的步驟， 根據(jù)所述觀察對象的顏色的變化來判斷所述干燥步驟的結(jié)束。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試樣觀察方法，其特征在于， 所述離子液體為親水性。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的試樣觀察方法，其特征在于， 在所述干燥步驟之后包括使用滲入有水或親水性的溶液的構(gòu)件將所述包含離子液體 的溶液除去的步驟。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試樣觀察方法，其特征在于， 所述浸漬步驟中使用的所述包含離子液體的溶液中的離子液體的濃度為10%以下。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試樣觀察方法，其特征在于，包括： 利用密封劑對含浸有所述包含離子液體的溶液的觀察對象進(jìn)行密封而制成光學(xué)顯微 鏡用的標(biāo)本的步驟； 利用光學(xué)顯微鏡對所述光學(xué)顯微鏡用的標(biāo)本進(jìn)行觀察的步驟。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試樣觀察方法，其特征在于， 包括使用探針對含浸有所述包含離子液體的溶液的觀察對象進(jìn)行解體或解剖的步驟。
8. -種試樣前處理方法，其利用通過檢測向試樣照射帶電粒子線而得到的信號來取得 所述試樣的圖像的裝置進(jìn)行觀察， 所述試樣前處理方法的特征在于，包括： 將所述試樣浸漬于包含離子液體的溶液中的浸漬步驟； 在使所述包含離子液體的溶液的滲透壓與所述試樣的內(nèi)部的滲透壓相抗衡的狀態(tài)下， 使所述包含離子液體的溶液干燥，由此使所述溶液中的離子液體的濃度上升的干燥步驟。
9. 一種試樣制作裝置，其對觀察對象進(jìn)行前處理，使所述觀察對象成為適合于試樣觀 察裝置的觀察的狀態(tài)，該試樣觀察裝置檢測向所述觀察對象照射帶電粒子線而得到的信號 來取得所述觀察對象的圖像， 所述試樣制作裝置的特征在于，具備： 使所述觀察對象浸漬于包含離子液體的溶液中的浸漬機(jī)構(gòu)； 在使所述包含離子液體的溶液的滲透壓與所述觀察對象的內(nèi)部的滲透壓相抗衡的狀 態(tài)下，使所述包含離子液體的溶液干燥，由此使所述溶液中的離子液體的濃度上升的干燥 機(jī)構(gòu)。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的試樣制作裝置，其特征在于， 具備能夠?qū)τ伤龈稍餀C(jī)構(gòu)干燥中的所述觀察對象進(jìn)行觀察的光學(xué)顯微鏡。
11. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的試樣制作裝置，其特征在于， 具備將由所述干燥機(jī)構(gòu)干燥后殘留的包含離子液體的溶液除去的機(jī)構(gòu)。
12. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的試樣制作裝置，其特征在于， 具備根據(jù)所述觀察對象的重量變化來檢測所述包含離子液體的溶液的干燥的進(jìn)展?fàn)?況的機(jī)構(gòu)。
13. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的試樣制作裝置，其特征在于， 所述浸漬機(jī)構(gòu)是向所述觀察對象滴下所述包含離子液體的溶液的微型吸移管。
【文檔編號】G01N1/30GK104094096SQ201380007954
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2013年2月20日 優(yōu)先權(quán)日:2012年3月9日
【發(fā)明者】鹽野正道, 西村雅子, 許斐麻美 申請人:株式會社日立高新技術(shù)
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