久久一区二区免费播放,国产在线欧美日韩一区二区,国产综合色在线视频,精品伊人久久久香线蕉,精品视频麻豆网站,玖玖国产,国内精品久久久久影,在线观看精品视频一区二区三区,午夜久久影院,国产精品一区久久

貝類中大田軟海綿酸的電化學(xué)檢測(cè)方法
【專利摘要】一種貝類中大田軟海綿酸的電化學(xué)檢測(cè)方法，屬于電化學(xué)檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，首先是通過(guò)在裸金電極表面電聚合硫堇-亞甲基藍(lán)復(fù)合膜，再利用電極表面修飾技術(shù)，將納米金和抗體依次修飾至電極表面，制備一種電化學(xué)免疫傳感器；其次是將制備的免疫傳感器用于貝類中大田軟海綿酸的電化學(xué)檢測(cè)。本發(fā)明借助硫堇-亞甲基藍(lán)的復(fù)合聚合膜和納米金的協(xié)同作用使峰電流信號(hào)放大，提高傳感器的靈敏度；利用具有特殊分子結(jié)構(gòu)的大田軟海綿酸與其抗體特異性結(jié)合生成以陰離子形式存在的免疫產(chǎn)物，能阻礙電極表面電子傳遞的特性，實(shí)現(xiàn)非標(biāo)記電化學(xué)檢測(cè)。本發(fā)明方法用于貝類樣品中大田軟海綿酸的測(cè)定,檢測(cè)快速，靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。
【專利說(shuō)明】貝類中大田軟海綿酸的電化學(xué)檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于電化學(xué)檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地涉及一種貝類中大田軟海綿酸的電化學(xué)檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]大田軟海綿酸(Okadaic acid，0A)屬多環(huán)聚醚類脂溶性貝類毒素，是海洋腹瀉性貝類毒素的主要成分。OA可通過(guò)食物鏈富集于貝類等濾食性海洋生物體內(nèi)，導(dǎo)致消費(fèi)者胃腸功能紊亂，出現(xiàn)腹瀉、嘔吐和腹痛等中毒癥狀。研究證實(shí)，OA及其衍生物鰭藻毒素能夠抑制蛋白磷酸酶的活性，是一類潛在的腫瘤促進(jìn)因子，且呈現(xiàn)出發(fā)生頻率增加、分布區(qū)域擴(kuò)大、危害日益嚴(yán)重的發(fā)展趨勢(shì)，已成為國(guó)際社會(huì)共同關(guān)注的重大食品和生態(tài)安全問(wèn)題，也是發(fā)達(dá)國(guó)家制定監(jiān)控計(jì)劃和貿(mào)易壁壘的主要目標(biāo)。歐盟、德國(guó)和英國(guó)等多個(gè)國(guó)家規(guī)定雙殼貝類可食性組織中腹瀉性貝類毒素不大于160 μ g/kg(以O(shè)A計(jì))，不過(guò)近期歐盟對(duì)OA的毒性進(jìn)行了重新評(píng)估，認(rèn)為現(xiàn)行限量標(biāo)準(zhǔn)不足以保護(hù)消費(fèi)者安全，擬將該限量標(biāo)準(zhǔn)降低到45 μ g/kg0
[0003]目前，檢測(cè)大田軟海綿酸的方法有小鼠生物法、液相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法和免疫分析法等。小鼠生物法的毒素提取過(guò)程繁瑣，需時(shí)較長(zhǎng)(通常需24h)，且易出現(xiàn)假陽(yáng)性，檢出限偏高，重現(xiàn)性較差，而液相色譜和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法需要價(jià)格昂貴的儀器和專業(yè)的人員操作，過(guò)程復(fù)雜，不能實(shí)現(xiàn)快速和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。電化學(xué)檢測(cè)法具有靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、快速、經(jīng)濟(jì)、環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，尤其是電化學(xué)免疫傳感器分析技術(shù)因干擾少，檢出限低，樣品預(yù)處理及儀器設(shè)備簡(jiǎn)單而易實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，可提供實(shí)時(shí)快速、簡(jiǎn)單便攜和低成本的分析方法，但在貝類毒素的檢測(cè)上應(yīng)用較少，具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的貝類毒素電化學(xué)檢測(cè)技術(shù)有待突破。
[0004]硫堇屬于吩噻嗪類，具有優(yōu)良的電化學(xué)活性，聚硫堇相對(duì)于單體而言有強(qiáng)大的附著力，不易流失，比表面積大，反應(yīng)活性高，催化效果好；亞甲基藍(lán)作為一種生物染料也是一種比較活潑的電子轉(zhuǎn)移體，在導(dǎo)電基質(zhì)上具有良好電化學(xué)行為，其導(dǎo)電聚合膜具有良好的電化學(xué)活性和電催化性能。目前，聚硫堇和聚亞甲基藍(lán)作為高性能的電子交換聚合物已被廣泛用作直接電化學(xué)電極的功能基質(zhì)膜和電子媒介體，但鮮有聚硫堇-亞甲基藍(lán)復(fù)合電聚合膜用于非標(biāo)記型電化學(xué)免疫傳感器的構(gòu)建。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種貝類中大田軟海綿酸的電化學(xué)檢測(cè)方法，以克服現(xiàn)有檢測(cè)貝類毒素大田軟海綿酸技術(shù)上的不足，如儀器復(fù)雜、昂貴、步驟繁瑣等缺點(diǎn)。本發(fā)明在金電極表面通過(guò)循環(huán)伏安法電聚合一層聚硫堇-亞甲基藍(lán)復(fù)合膜，并借助納米金的導(dǎo)電性、生物相容性與高比表面的特性實(shí)現(xiàn)抗體的有效固定，利用具有特殊分子結(jié)構(gòu)的OA與其抗體特異性結(jié)合生成以陰離子形式存在的免疫產(chǎn)物，能阻礙電極表面電子傳遞的特性，構(gòu)建了一種非標(biāo)記型電化學(xué)免疫傳感器，結(jié)合電化學(xué)工作站，實(shí)現(xiàn)了對(duì)貝類中大田軟海綿酸的電化學(xué)檢測(cè)。
[0006]本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
[0007]—種貝類中大田軟海綿酸的電化學(xué)檢測(cè)方法，包括以下步驟:
[0008](I)金電極的預(yù)處理:金電極打磨、清洗，再用piranha溶液浸泡,在稀H2SO4溶液中于-1.0?1.55V電位下循環(huán)掃描，取出后用水沖洗，吹干；
[0009](2)傳感器的制備:將步驟(2)處理后的金電極置于含有終濃度為lmmol/L硫堇、4mmol/L亞甲基藍(lán)、0.lmol/L氯化鉀和pH6.010mmol/L PBS緩沖液的混合溶液中，于+1.5V恒電位下靜置，然后用循環(huán)伏安法掃描，形成硫堇-亞甲基藍(lán)復(fù)合聚合膜；用水充分淋洗金電極后，將其浸于納米金溶液中，以在金電極上獲得納米金層；取大田軟海綿酸單克隆抗體涂覆在金電極表面，室溫下反應(yīng)；滴加牛血清白蛋白(BSA)溶液以覆蓋多余的非特異性位點(diǎn)，即完成傳感器的制備；
[0010](3)大田軟海綿酸的測(cè)定:將不同濃度梯度的OA標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品溶液滴加到步驟
(2)所制備的傳感器表面，反應(yīng)后，使用電化學(xué)工作站進(jìn)行差示脈沖伏安測(cè)量，記錄免疫反應(yīng)前后峰電流值。
[0011]進(jìn)一步，步驟(2)所述的納米金溶液的合成方法為:取HAuCl4溶液加熱煮沸，在攪拌回流狀態(tài)下迅速加入檸檬酸三鈉水溶液，繼續(xù)煮沸，待溶液顏色變?yōu)樯罹萍t時(shí)，即完成納米金的合成，其中HAuCl4與檸檬酸三鈉的質(zhì)量比為1:3。
[0012]進(jìn)一步，所述的HAuCl4溶液和檸檬酸三鈉的濃度分別為0.01% (重量比)、1% (重量比)。
[0013]進(jìn)一步，步驟(3)所述的樣品溶液的獲取方法:稱取貝樣，加入甲醇水溶液均質(zhì)提取，離心后定容；取提取液用氮?dú)獯蹈?，用PBS緩沖溶液定容，超聲波震使蕩殘留物充分溶解，溶解液過(guò)濾膜后待測(cè)。
[0014]進(jìn)一步，所述的PBS緩沖溶液具體是指pH7.4的Na2HPO4-KH2PO4緩沖體系，濃度為10mmol /I, η
[0015]進(jìn)一步,所述的濾膜為0.45 μ m。
[0016]進(jìn)一步,步驟(I)所述的金電極用0.05μηι招粉打磨,對(duì)打磨后的金電極清洗是依次用超純水、無(wú)水乙醇和超純水超聲清洗。
[0017]進(jìn)一步，步驟(I)所述的稀H2SO4溶液的濃度為0.lmol/L。
[0018]進(jìn)一步,步驟(I)所述的piranha溶液的成分為濃H2SO4:30%H202=7:3,所述的比例為體積比。
[0019]進(jìn)一步，步驟(2)所述的循環(huán)伏安法掃描的條件是-0.45?0.15V電位、50mV/s速率下掃描25圈。
[0020]進(jìn)一步,步驟(2)所述的大田軟海綿酸單克隆抗體溶液濃度為0.lmg/mL,所用的體積為20 μ L ;所述的BSA溶液濃度為0.5% (重量比)，體積為20 μ L。
[0021]進(jìn)一步，步驟(3)中電化學(xué)工作站為三電極工作模式，其中傳感器作為工作電極，鉬電極為對(duì)電極，飽和甘汞電極為參比電極。
[0022]進(jìn)一步，步驟(3)中所述的差示脈沖伏安法測(cè)量的脈沖范圍是-0.6?0.6V。進(jìn)一步，步驟(3)中所述的OA標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度分別為:0.2、2、10、20和100 μ g/L ;滴加大田軟海綿酸標(biāo)準(zhǔn)溶液所測(cè)電流差值與大田軟海綿酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系，并繪制工作曲線；滴加樣品溶液后記錄其電流的變化值，根據(jù)所得到的工作曲線，計(jì)算貝類樣品中大田軟海綿酸的含量。
[0023]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比的有益效果:
[0024](I)硫堇聚合膜致密穩(wěn)定，富含構(gòu)建傳感界面所用的氨基；亞甲基藍(lán)加速電極表面的電子傳遞；納米金可提高抗體分子的組裝量，本發(fā)明利用硫堇-亞甲基藍(lán)的復(fù)合聚合膜和納米金的協(xié)同作用使峰電流信號(hào)放大，提高傳感器的檢測(cè)靈敏度。
[0025](2)本發(fā)明利用分子結(jié)構(gòu)中含有羧基和酚基的大田軟海綿酸與其抗體結(jié)合后可以提供額外的負(fù)電荷，生成以陰離子形式存在的免疫產(chǎn)物能阻礙電子傳遞的特性，依據(jù)免疫反應(yīng)前后傳感器界面的電流變化與免疫產(chǎn)物的量成正比關(guān)系實(shí)現(xiàn)了對(duì)大田軟海綿酸的非標(biāo)記電化學(xué)檢測(cè)，與標(biāo)記型電化學(xué)免疫傳感器檢測(cè)技術(shù)相比，簡(jiǎn)化了制備和測(cè)試過(guò)程。
[0026](3)本發(fā)明中制備的非標(biāo)記型電化學(xué)免疫傳感器，特異性好，靈敏度高，響應(yīng)快速，且便攜、小巧，適合現(xiàn)場(chǎng)快速篩選。
[0027](4)本發(fā)明的電化學(xué)檢測(cè)方法，簡(jiǎn)化了樣品前處理步驟，經(jīng)濟(jì)、環(huán)保且重現(xiàn)性好，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0028]圖1為免疫傳感器修飾過(guò)程的電化學(xué)交流阻抗表征圖。
[0029]圖2為大田軟海綿酸電化學(xué)檢測(cè)的電流響應(yīng)圖。
【具體實(shí)施方式】`
[0030]下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步解釋，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不受實(shí)施例任何形式上的限制。
[0031]一種貝類中大田軟海綿酸的電化學(xué)檢測(cè)方法，包括以下步驟:
[0032](I)樣品前處理:稱取Ig貝樣于50mL離心管中，加入8mL80%甲醇水溶液，1000Or/min均質(zhì)提取2min，再以8000r/min離心5min，轉(zhuǎn)移上清液至IOmL比色管中，并用甲醇定容至10mL。移取ImL提取液氮吹至近干，用10mmol/L PBS (pH7.4)定容至lmL，超聲30s充分溶解殘留物，溶解液過(guò)0.45 μ m濾膜后待測(cè)。
[0033](2)納米金的合成:取50mL HAuCl4 (0.01%)加熱煮沸，在攪拌回流狀態(tài)下迅速加入1.5mLl%檸檬酸三鈉水溶液，繼續(xù)煮沸l(wèi)Omin，待溶液顏色變?yōu)樯罹萍t時(shí)，即完成納米金的合成。
[0034](3)金電極的預(yù)處理:將金電極用0.05 μ m鋁粉打磨后，置于超純水、無(wú)水乙醇和超純水中分別超聲清洗5min，再用piranha溶液(濃H2SO4:30%H202=7: 3)浸泡20min，在
0.lmol/L H2SO4溶液中于-1.0~1.55V電位下循環(huán)掃描lOmin，取出后用水沖洗，氮?dú)獯蹈伞?br> [0035](4)傳感器的制備:將步驟(3)處理的金電極首先置于含有終濃度分別為lmmol/L硫堇、4mmol/L亞甲基藍(lán)、0.lmol/L氯化鉀和10mmol/L PBS (pH6.0)緩沖溶液的混合溶液中，于+1.5V恒電位下靜置IOmin,然后于-0.45~0.15V電位、50mV/s速率下用循環(huán)伏安法掃描25圈，形成硫堇-亞甲基藍(lán)復(fù)合聚合膜；用超純水充分淋洗電極后，將其浸于步驟(2)合成的納米金溶液中4h，以獲得納米金層；取2(^1^大田軟海綿酸單克隆抗體(&社1-(^，0.lmg/mL)涂覆在電極表面，室溫下反應(yīng)Ih ;最后，滴加20 μ L0.5%牛血清白蛋白溶液(BSA)以覆蓋多余的非特異性位點(diǎn)，置于4°C下保存待用。
[0036]圖1為免疫傳感器修飾過(guò)程的電化學(xué)交流阻抗表征圖。圖中譜線a為裸金電極的阻抗圖，電阻較小，表明電極表面的電子傳遞只受擴(kuò)散控制；譜線b為形成聚硫堇-亞甲基藍(lán)聚合膜后的電極阻抗圖，界面電子轉(zhuǎn)移阻力增大，而譜線c為納米金顆粒自組裝到電極界面的阻抗圖，納米金加快了電極表面的電子傳遞，電阻略有減?。划?dāng)ant1-OA進(jìn)一步組裝在電極表面后，阻抗值劇增(譜線d)，說(shuō)明電極表面已形成自組裝抗體層，傳感界面即構(gòu)建完畢。
[0037](5 )大田軟海綿酸的測(cè)定:將20 μ L不同濃度的OA標(biāo)準(zhǔn)溶液(分別為0.2、2、10、20和100 μ g/L)滴加到步驟(4)制備的傳感器表面，反應(yīng)lh。電極經(jīng)超純水充分淋洗后，進(jìn)行差示脈沖伏安(DPV)測(cè)量，脈沖范圍為-0.2~0.6V，記錄免疫反應(yīng)前后峰電流變化。
[0038](6)根據(jù)步驟(5)所測(cè)電流差值與大田軟海綿酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系，繪制工作曲線。
[0039]將按步驟(1)處理好的樣品溶液按照步驟(5)的方法進(jìn)行測(cè)試，根據(jù)其電流的變化值與步驟(6)得到的OA工作曲線，計(jì)算貝類樣品中OA的含量。
[0040]圖2為免疫傳感器對(duì)大田軟海綿酸的電流響應(yīng)圖，內(nèi)插圖為測(cè)定OA含量的校準(zhǔn)曲線。不同濃度的OA溶液與電極上的抗體結(jié)合，反應(yīng)前后電流發(fā)生變化，用差示脈沖伏安法記錄電流變化大小(反應(yīng)前電流記為1(1，反應(yīng)后記為I，電流變化為Δ I=Itl-1),免疫反應(yīng)前后峰電流的變化值(Λ I)隨著OA濃度的增加而增大，且Λ I與OA濃度的對(duì)數(shù)線性相關(guān)，得出OA的線性范圍為0.2~100 μ g/L，相關(guān)系數(shù)為0.9920。根據(jù)空白信號(hào)3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差所計(jì)算得到OA的檢出限為0.1 μ g/L。
[0041](7)選取四份貝類樣品做加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，并與液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)比，結(jié)果見(jiàn)表1。
[0042]表1貝類中大田軟海綿酸的對(duì)比測(cè)定結(jié)果
[0043]
【權(quán)利要求】
1.一種貝類中大田軟海綿酸的電化學(xué)檢測(cè)方法，其特征是包括以下步驟: (1)金電極的預(yù)處理:金電極打磨、清洗，再用piranha溶液浸泡,在稀H2SO4溶液中于-1.0?1.55V電位下循環(huán)掃描，取出后用水沖洗，吹干； (2)傳感器的制備:將步驟(I)處理后的金電極置于含有終濃度分別為lmmol/L硫堇、4mmol/L亞甲基藍(lán)、0.lmol/L氯化鉀和pH6.010mmol/L PBS緩沖液的混合溶液中，于+1.5V恒電位下靜置，然后用循環(huán)伏安法掃描，形成硫堇-亞甲基藍(lán)復(fù)合聚合膜；用水充分淋洗金電極后，將其浸于納米金溶液中，以在金電極上獲得納米金層；取大田軟海綿酸單克隆抗體涂覆在金電極表面，室溫下反應(yīng)；滴加牛血清白蛋白溶液以覆蓋多余的非特異性位點(diǎn)，即完成傳感器的制備； (3)大田軟海綿酸的測(cè)定:將不同濃度梯度的大田軟海綿酸標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品溶液滴加到步驟(2)所制備的傳感器表面，反應(yīng)后，使用電化學(xué)工作站進(jìn)行差示脈沖伏安測(cè)量，記錄免疫反應(yīng)前后峰電流值。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的電化學(xué)檢測(cè)方法，其特征在于步驟(2)所述納米金溶液的合成方法為取HAuCl4溶液加熱煮沸，在攪拌回流狀態(tài)下迅速加入檸檬酸三鈉水溶液，繼續(xù)煮沸，待溶液變?yōu)樯罹萍t色時(shí)，即完成納米金溶液的合成，其中HAuCl4與檸檬酸三鈉的質(zhì)量比為 1:3。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的電化學(xué)檢測(cè)方法，其特征在于所述的HAuCl4和檸檬酸三鈉的濃度分別為0.01% (重量比)、1% (重量比)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的電化學(xué)檢測(cè)方法，其特征在于步驟(I)所述的金電極用0.05 μ m鋁粉打磨，對(duì)打磨后的金電極清洗是依次用超純水、無(wú)水乙醇和超純水超聲清洗。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的電化學(xué)檢測(cè)方法，其特征在于步驟(2)所述的循環(huán)伏安法掃描的條件是-0.45?0.15V電位、50mV/s速率下掃描25圈。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的電化學(xué)檢測(cè)方法，其特征在于步驟(2)所述的大田軟海綿酸單克隆抗體溶液濃度為0.lmg/mL,所用的體積為20 μ L，所述滴加的BSA溶液濃度為0.5%(重量比),體積為20 μ L。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的電化學(xué)檢測(cè)方法，其特征在于步驟(3)中所述樣品溶液的制備為稱取貝樣，加入甲醇水溶液均質(zhì)提取，離心后定容；取提取液用氮?dú)獯蹈?，用PBS緩沖溶液定容，超聲波震蕩使殘留物充分溶解，溶解液過(guò)濾膜后待測(cè)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的電化學(xué)檢測(cè)方法，其特征在于步驟(3)中電化學(xué)工作站為三電極工作模式，其中所述步驟(2)制備的傳感器作為工作電極，鉬電極為對(duì)電極，飽和甘汞電極為參比電極。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的電化學(xué)檢測(cè)方法，其特征在于步驟(3)中所述的差示脈沖伏安法測(cè)量的脈沖范圍是-0.6?0.6V。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的電化學(xué)檢測(cè)方法，其特征在于步驟(3)中所述的大田軟海綿酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度分別為:0.2、2、10、20和100 μ g/L，滴加大田軟海綿酸標(biāo)準(zhǔn)溶液所測(cè)電流差值與大田軟海綿酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系，并繪制工作曲線；滴加樣品溶液后記錄其電流的變化值，根據(jù)所得到的工作曲線，計(jì)算貝類樣品中大田軟海綿酸的含量。
【文檔編號(hào)】G01N27/48GK103713035SQ201410009128
【公開(kāi)日】2014年4月9日 申請(qǐng)日期:2014年1月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月9日
【發(fā)明者】郭萌萌, 譚志軍, 吳海燕, 李兆新, 王聯(lián)珠, 翟毓秀 申請(qǐng)人:中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所