一種牛樟芝保健食品中腺甘含量測定的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種牛樟芝保健食品中腺甘含量測定的方法。所述的測定方法包括以下步驟:稱取腺苷標(biāo)準(zhǔn)品配制腺甘標(biāo)準(zhǔn)溶液,將其稀釋成不同濃度的校準(zhǔn)曲線溶液,取樣品適量并加溶劑進(jìn)行超聲波提取,制得樣品提取液,再將樣品提取液進(jìn)行超聲混勻并過濾制得待測樣品溶液,最后對不同濃度的校準(zhǔn)曲線溶液及待測樣品溶液分別采用HPLC進(jìn)行測定,并計(jì)算腺甘含量。本發(fā)明對標(biāo)準(zhǔn)品及待測樣品統(tǒng)一采用一種溶劑進(jìn)行配制,且將流動(dòng)相限定為乙腈-磷酸二氫鉀體系,在對待測樣品進(jìn)行腺甘提取時(shí)采用15%-20%的甲醇,均可使樣品中主成分分離效果好,色譜圖可呈現(xiàn)對稱峰形,雜質(zhì)峰影響小,可明顯提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度及靈敏度。
【專利說明】一種牛樟芝保健食品中腺甘含量測定的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物檢測領(lǐng)域,具體涉及一種牛樟芝保健食品中腺甘含量測定的方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 牛樟芝(Taiwanofungus camphorates),又名牛樟燕或樟芝,是一種原產(chǎn)于我 國臺灣省的珍稀藥用菌。牛樟芝主要存在于我國臺灣省的名貴樹木牛樟樹cinnamomum kanehirae hayata的樹干空洞內(nèi)?,F(xiàn)代研究表明樟芝含有多種生理活性物質(zhì),如維生素、 固醇類、麥角留醇、多糖、三萜類、超氧化物歧化酶S0D、腺苷、小分子蛋白質(zhì)等 。其中腺甘是一種嘌呤核苷,是核酸的基本結(jié)構(gòu)單位之一,由糖苷鍵連接腺嘌呤和核糖 而成,它是機(jī)體代謝的一種中間產(chǎn)物,具有多種生理功能,如擴(kuò)張血管、降低竇房結(jié)的自 律性、減慢房室傳導(dǎo)、抑制腎素分泌、降低體外循環(huán)后肺缺血一再灌注損傷,有效改善右心 功能,對再灌注心臟具有保護(hù)作等作用。因此,有許多廠商開始投注大量研究資源開發(fā)牛樟 芝相關(guān)醫(yī)藥品或保健品。為了進(jìn)一步嚴(yán)格控制市售牛樟芝保健品的質(zhì)量,確保其保健功效, 急需尋找一種可以對牛樟芝保健產(chǎn)品中腺甘進(jìn)行檢測的方法,以期為牛樟芝保健產(chǎn)品的質(zhì) 量控制提供保障,也能更好的保障消費(fèi)者的合法權(quán)益。目前,對于保健產(chǎn)品中腺甘的測定主 要依據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評價(jià)技術(shù)規(guī)范》2003年 版中規(guī)定的HPLC法,但采用該法測定牛樟芝保健品中的腺甘,靈敏度及準(zhǔn)確度較差。 為此,本發(fā)明對傳統(tǒng)的HPLC法進(jìn)行了改進(jìn),可明顯提高測定結(jié)果的準(zhǔn)確度與靈敏度。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0003] 針對上述現(xiàn)有技術(shù)的不足,本發(fā)明提供一種可對牛樟芝保健食品中腺甘含量進(jìn)行 準(zhǔn)確測定的方法。
[0004] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下: 一種牛樟芝保健食品中腺甘含量測定的方法,包括以下步驟: (1) 配制腺甘標(biāo)準(zhǔn)溶液:準(zhǔn)確稱取腺苷標(biāo)準(zhǔn)品10_30mg加至25ml試管中,向試管中加 溶劑,配制成濃度為0. 4-1. 2mg/ml的腺甘標(biāo)準(zhǔn)溶液; (2) 腺甘校準(zhǔn)曲線溶液配制:將步驟(1)中配制的腺甘標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)一步稀釋成不同濃 度的校準(zhǔn)曲線溶液; (3) 樣品提?。喝〈郎y樣品50-100mg進(jìn)行粉碎,準(zhǔn)確稱取粉碎后的樣品20-50mg置入 25ml試管中,加入溶劑進(jìn)行超聲提取,制得待測樣品提取液; (4) 配制待測樣品溶液:將步驟(3)中制得的樣品提取液5-10ml加入25ml的試管中, 加入溶劑定容至刻度,超聲混勻,離心,〇. 45um微孔濾膜過濾,制得待測樣品溶液; (5) HPLC測定:將步驟(2)中配制的不同濃度的校準(zhǔn)曲線溶液及步驟(4)中配的待測 樣品溶液分別采用HPLC進(jìn)行測定,并繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線,計(jì)算腺甘含量。
[0005] 步驟(2)中所述的不同濃度的校準(zhǔn)曲線溶液其濃度分別為0. 4yg/ml,2. Oyg/ ml, 4. Ο μ g/ml, 20. 0 μ g/ml, 80. 0 μ g/ml 〇
[0006] 步驟(1)、(2)、(4)中所加入的溶劑選自50%-100%的甲醇或去離子水中的一種 步驟(3)中中所述的樣品提取時(shí)加入的溶劑為15%_20%的甲醇。
[0007] 步驟(3)中所述的超聲提取時(shí)間為5-10min,步驟(4)中所述的超聲混勻時(shí)間為 5-10min〇
[0008] 步驟(4)中所述的離心時(shí)間為20_30min,離心速度為3000-5000r/min。
[0009] 步驟(5)中所述的HPLC的參數(shù)為:Diamonsil C18色譜柱,4· 6X 150) mm, 5um;柱 溫:25°C ;流速:l.Oml/min;進(jìn)樣量:10μ 1紫外檢測器:波長254nm;流動(dòng)相:10% 乙腈,90%磷酸二氫鉀水溶液。
[0010] 所述的磷酸二氫鉀水溶液的濃度為0. 005-0. 02 mol/L。
[0011] 步驟(5)中所述的腺甘含量計(jì)算具體公式為:X=(CXV)/mX1000; X:待測樣品中 腺甘含量(mg/g) ;C :從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線得到的待測樣品溶液中腺甘濃度(ug/ml) ;V :待測樣 品定容體積;m :待測樣品的質(zhì)量。
[0012] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比,有益效果體現(xiàn)在以下幾點(diǎn): 1.對于保健產(chǎn)品中腺甘的測定主要依據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評價(jià)技術(shù)規(guī)范》2003年版中 規(guī)定的HPLC法,但在《保健食品檢驗(yàn)與評價(jià)技術(shù)規(guī)范》中,規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)溶液以純水配制,樣品 提取溶劑為60%乙醇,二者進(jìn)樣溶劑不一致,導(dǎo)致檢測結(jié)果準(zhǔn)確度低。研究表明,50%以上的 甲醇做為溶劑,對腺甘的提取效果好,且在HPLC測定含量時(shí),其色譜峰為有尖峰的對稱波 形,因此,可提高方法靈敏度,有利于腺甘與樣品中其他成分的分離。
[0013] 2.本發(fā)明中將校準(zhǔn)曲線溶液濃度分別配制為0.4 μ g/ml,2.0 μ g/ml,4.0 μ g/ ml,20. 0 μ g/ml,80. 0 μ g/ml,適合牛樟芝保健品中腺甘的定量檢測,多次測定結(jié)果線性相 關(guān)系數(shù)達(dá)0.999。
[0014] 3. HPLC法測定腺甘含量多以甲醇-磷酸二氫鉀體系為流動(dòng)相,但分析時(shí)間較少, 本發(fā)明將流動(dòng)相限定為乙腈-磷酸二氫鉀體系,且將磷酸二氫鉀濃度限定為〇. 005-0. 02 mol/L,分離效果最好,分析時(shí)間也最短。
[0015] 4.本發(fā)明中在定容時(shí)選擇的溶劑為50%以上的甲醇,這樣使得形成的色譜峰有尖 峰且對稱,而在樣品提取時(shí),溶劑選擇的為15%-20%的甲醇,樣品中腺甘提取效果最好,色 譜圖中雜質(zhì)峰影響最小。
【具體實(shí)施方式】
[0016] 下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。
[0017] 實(shí)施例1 一種牛樟芝保健食品中腺甘含量測定的方法,包括以下步驟: (1)配制腺甘標(biāo)準(zhǔn)溶液:準(zhǔn)確稱取腺苷標(biāo)準(zhǔn)品10_30mg加至25ml試管中,向試管中加 入50%的甲醇,配制成濃度為0. 4mg/ml的腺甘標(biāo)準(zhǔn)溶液; (2 )腺甘校準(zhǔn)曲線溶液配制:將步驟(1)中配制的腺甘標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)一步稀釋成0. 4 μ g/ ml, 2· 0 μ g/ml, 4· 0 μ g/ml, 20. 0 μ g/ml, 80. 0 μ g/ml 不同濃度的校準(zhǔn)曲線溶液; (3)樣品提?。喝〈郎y樣品50mg進(jìn)行粉碎,準(zhǔn)確稱取粉碎后的樣品20mg置入25ml試 管中,加入15%的甲醇進(jìn)行超聲提取5min,制得待測樣品提取液; (4) 配制待測樣品溶液:將步驟(3)中制得的樣品提取液5-10ml加入25ml的試管中, 加入50%的甲醇定容至刻度,超聲混勻5min,以3000r/min的離心速度離心20min,,0. 45um 微孔濾膜過濾,制得待測樣品溶液; (5) 冊1^:測定:冊^:的參數(shù)為:0丨3111〇118丨1(:18色譜柱,4.6\150)_,511111 ;柱 溫:25°C ;流速:l.Oml/min;進(jìn)樣量:10μ 1紫外檢測器:波長254nm;流動(dòng)相:10% 乙腈,90%濃度為0. 005mol/L的磷酸二氫鉀水溶液;將步驟(2)中配制的不同濃度的校準(zhǔn)曲 線溶液及步驟(4)中配的待測樣品溶液分別采用HPLC進(jìn)行測定,并繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線,計(jì) 算腺甘含量。
[0018] 實(shí)施例1 一種牛樟芝保健食品中腺甘含量測定的方法,包括以下步驟: (1) 配制腺甘標(biāo)準(zhǔn)溶液:準(zhǔn)確稱取腺苷標(biāo)準(zhǔn)品30mg加至25ml試管中,向試管中加入 100%的甲醇,配制成濃度為1. 2mg/ml的腺甘標(biāo)準(zhǔn)溶液; (2) 腺甘校準(zhǔn)曲線溶液配制:將步驟(1)中配制的腺甘標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)一步稀釋成0.4yg/ ml, 2· Ο μ g/ml, 4· Ο μ g/ml, 20. Ο μ g/ml, 80. Ο μ g/ml 不同濃度的校準(zhǔn)曲線溶液; (3) 樣品提?。喝〈郎y樣品lOOmg進(jìn)行粉碎,準(zhǔn)確稱取粉碎后的樣品50mg置入25ml試 管中,加入20%的甲醇進(jìn)行超聲提取lOmin,制得待測樣品提取液; (4) 配制待測樣品溶液:將步驟(3)中制得的樣品提取液5-10ml加入25ml的試管中, 加入100%的甲醇定容至刻度,超聲混勻lOmin,以3000-5000r/min的離心速度離心30min, 0. 45um微孔濾膜過濾,制得待測樣品溶液; (5) 冊1^:測定:冊^:的參數(shù)為:0丨3111〇118丨1(:18色譜柱,4.6\150)_,511111 ;柱 溫:25°C ;流速:l.Oml/min;進(jìn)樣量:10μ 1紫外檢測器:波長254nm;流動(dòng)相:10% 乙腈,90%濃度為0.02 mol/L的磷酸二氫鉀水溶液;將步驟(2)中配制的不同濃度的校準(zhǔn)曲 線溶液及步驟(4)中配的待測樣品溶液分別采用HPLC進(jìn)行測定,并繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線,計(jì) 算腺甘含量。
[0019] 實(shí)施例3 一種牛樟芝保健食品中腺甘含量測定的方法,包括以下步驟: (1)配制腺甘標(biāo)準(zhǔn)溶液:準(zhǔn)確稱取腺苷標(biāo)準(zhǔn)品20mg加至25ml試管中,向試管中加入去 離子水,配制成濃度為0. 8mg/ml的腺甘標(biāo)準(zhǔn)溶液; (2 )腺甘校準(zhǔn)曲線溶液配制:將步驟(1)中配制的腺甘標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)一步稀釋成0. 4 μ g/ ml, 2· 0 μ g/ml, 4· 0 μ g/ml, 20. 0 μ g/ml, 80. 0 μ g/ml 不同濃度的校準(zhǔn)曲線溶液; (3) 樣品提?。喝〈郎y樣品80mg進(jìn)行粉碎,準(zhǔn)確稱取粉碎后的樣品40mg置入25ml試 管中,加入18%的甲醇進(jìn)行超聲提取8min,制得待測樣品提取液; (4) 配制待測樣品溶液:將步驟(3)中制得的樣品提取液5-10ml加入25ml的試管 中,加入去離子水定容至刻度,超聲混勻5-10min,以4000r/min的離心速度離心25min,, 0. 45um微孔濾膜過濾,制得待測樣品溶液; (5) 冊1^:測定:冊^:的參數(shù)為:0丨3111〇118丨1(:18色譜柱,4.6\150)_,511111 ;柱 溫:25°C ;流速:l.Oml/min;進(jìn)樣量:10μ 1紫外檢測器:波長254nm;流動(dòng)相:10% 乙腈,90%濃度為0.01 mol/L的磷酸二氫鉀水溶液;將步驟(2)中配制的不同濃度的校準(zhǔn)曲 線溶液及步驟(4)中配的待測樣品溶液分別采用HPLC進(jìn)行測定,并繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線,計(jì)
【權(quán)利要求】
1. 一種牛樟芝保健食品中腺甘含量測定的方法,其特征在于,包括以下步驟: (1) 配制腺甘標(biāo)準(zhǔn)溶液:準(zhǔn)確稱取腺苷標(biāo)準(zhǔn)品10-30mg加至25ml試管中,向試管中加 溶劑,配制成濃度為0. 4-1. 2mg/ml的腺甘標(biāo)準(zhǔn)溶液; (2) 腺甘校準(zhǔn)曲線溶液配制:將步驟(1)中配制的腺甘標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)一步稀釋成不同濃 度的校準(zhǔn)曲線溶液; (3) 樣品提?。喝〈郎y樣品50-100mg進(jìn)行粉碎,準(zhǔn)確稱取粉碎后的樣品20-50mg置入 25ml試管中,加入溶劑進(jìn)行超聲提取,制得待測樣品提取液; (4) 配制待測樣品溶液:將步驟(3)中制得的樣品提取液5-10ml加入25ml的試管中, 加入溶劑定容至刻度,超聲混勻,離心,〇. 45um微孔濾膜過濾,制得待測樣品溶液; (5) HPLC測定:將步驟(2)中配制的不同濃度的校準(zhǔn)曲線溶液及步驟(4)中配的待測 樣品溶液分別采用HPLC進(jìn)行測定,并繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線,計(jì)算腺甘含量。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛樟芝保健食品中腺甘含量測定的方法,其特征在于,步 驟(2)中所述的不同濃度的校準(zhǔn)曲線溶液其濃度分別為0. 4μ g/ml,2. 0μ g/ml,4. 0μ g/ ml, 20. 0 μ g/ml, 80. 0 μ g/ml 〇
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛樟芝保健食品中腺甘含量測定的方法,步驟(1)、(2)、(4) 中所加入的溶劑選自50%-100%的甲醇或去離子水中的一種。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛樟芝保健食品中腺甘含量測定的方法,其特征在于,步驟 (3)中中所述的樣品提取時(shí)加入的溶劑為15%-20%的甲醇。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛樟芝保健食品中腺甘含量測定的方法,其特征在于,步驟 (3) 中所述的超聲提取時(shí)間為5-10min,步驟(4)中所述的超聲混勻時(shí)間為5-10min。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛樟芝保健食品中腺甘含量測定的方法,其特征在于,步驟 (4) 中所述的離心時(shí)間為20-30min,離心速度為3000-5000r/min。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛樟芝保健食品中腺甘含量測定的方法,其特征在于,步驟 (5) 中所述的HPLC的參數(shù)為:Diamonsil C18色譜柱,4.6X150) mm,5um;柱溫:25°C;流 速:l.Oml/min;進(jìn)樣量:10μ1紫外檢測器:波長254nm;流動(dòng)相:10%乙腈,90%磷酸 二氫鉀水溶液。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛樟芝保健食品中腺甘含量測定的方法,其特征在于,所述 的磷酸二氫鉀水溶液的濃度為〇. 005-0. 02 mol/L。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛樟芝保健食品中腺甘含量測定的方法,其特征在于,步驟 (5)中所述的腺甘含量計(jì)算具體公式為:X=(CXV)/mX1000; X:待測樣品中腺甘含量(mg/ g) ;C :從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線得到的待測樣品溶液中腺甘濃度(ug/ml) ;V :待測樣品定容體積;m : 待測樣品的質(zhì)量。
【文檔編號】G01N30/88GK104111302SQ201410396715
【公開日】2014年10月22日 申請日期:2014年8月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月13日
【發(fā)明者】劉巴寧, 鄭安喬 申請人:中山安蕎生物科技有限公司