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用于混合樣品中手性化合物對映體過量值直接測定的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于混合樣品中手性化合物對映體過量值直接測定的方法，首先利用第一維色譜單元將待測對映體過量值的手性化合物與其他雜質(zhì)分離并收集至定量環(huán)中，再通過兩個十通閥的切換，將收集在定量環(huán)中的手性對映體轉(zhuǎn)移至配備有手性色譜柱的第二維色譜單元中，利用第二維色譜單元測定得到定量環(huán)中的手性化合物的對映體過量值。本發(fā)明能夠?qū)崿F(xiàn)混合樣品中手性化合物對映體過量值的直接測定，而不需要經(jīng)過前期復(fù)雜的樣品純化過程，從而大大降低了生產(chǎn)成本，縮短了分析時間，同時提高了色譜系統(tǒng)分離能力，應(yīng)用范圍廣，尤其適合于不對稱合成粗產(chǎn)物中手性藥物對映體過量值的測定。
【專利說明】用于混合樣品中手性化合物對映體過量值直接測定的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及高效液相色譜和手性化合物的分析，具體地說是一種實現(xiàn)混合樣品中手性藥物對映體過量值的直接測定的二維高效液相色譜方法。
【背景技術(shù)】
[0002]在人體中作為生命活動重要基礎(chǔ)的生物大分子，如蛋白質(zhì)、多糖、核酸和酶等，幾乎全是手性的，而手性藥物要在人體中發(fā)揮藥效，就必須與生物大分子作用。而含手性因素的化學(xué)藥物的對映體在人體內(nèi)的藥理活性、代謝過程及毒性存在顯著的差異:往往一個對映體能很好地與生物手性大分子相互作用從而發(fā)揮預(yù)期的藥理作用，另一個對映體則往往不能很好地相互作用，不但本身沒有藥效，還會部分抵消藥效，甚至還會產(chǎn)生有毒的代謝產(chǎn)物或引起嚴(yán)重的副作用。1992年美國食品與藥物監(jiān)管局(FDA)的藥物評價與研發(fā)中心(CDER)頒布了手性藥物指導(dǎo)原則，要求所有在美國上市的外消旋新藥，其生產(chǎn)者均需說明藥物中所含的對映體各自的藥理作用、毒性和臨床效果，并且當(dāng)兩種異構(gòu)體有明顯的藥效和毒理作用差異時，必須以單一異構(gòu)體的藥品形式上市。歐共體國家及日本、加拿大等國隨后也制訂了類似的法規(guī)。
[0003]因此，單一構(gòu)型的藥物對于醫(yī)藥研發(fā)極為重要，從而大大促進了不對稱合成的發(fā)展。而在不對稱合成中，最為重要的就是不對稱合成產(chǎn)物中目標(biāo)手性藥物的對映體過量值的測定，因此迫切需要尋找高通量快速測定對映體過量值的方法，以縮短不對稱合成中不對稱催化劑的篩選時間及不對稱藥物的研發(fā)周期，促進不對稱合成的發(fā)展?，F(xiàn)有的測定方法是將復(fù)雜混合樣品溶液預(yù)處理后，再進行一維高效液相色譜分析，步驟一般包括:首先通過傳統(tǒng)的柱層析色譜進行分離純化，去除反應(yīng)物、副產(chǎn)物、中間產(chǎn)物、溶劑、催化劑等雜質(zhì)，再將純化后的待測樣品進行高效液相色譜、氣相色譜等常規(guī)對映體過量值的測定。該測定對映體過量值的傳統(tǒng)方法步驟繁瑣耗時，且耗費的溶劑量大、對環(huán)境影響較大。
[0004]對比常規(guī)測定所采用的一維高效液相色譜，在線二維色譜技術(shù)具有高效、準(zhǔn)確、快速等優(yōu)點，在中草藥成分分析、復(fù)雜樣品的分析檢測等方面應(yīng)用廣泛。同時由于可以實現(xiàn)從混合溶液到色譜分析一步式對映體過量值的測定，在線二維色譜測定方法具有更高的準(zhǔn)確性。因此利用在線二維色譜技術(shù)用于混合樣品中手性藥物對映體過量值的測定能夠大大提高不對稱合成的效率，縮短手性新藥的研發(fā)周期。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種操作簡單、高通量快速測定的用于混合樣品中手性化合物對映體過量值直接測定的方法。
[0006]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供的用于混合樣品中手性化合物對映體過量值直接測定的方法，包括第一維色譜單元、第二維色譜單元和兩個十通閥，所述的第一維色譜單元包括第一維輸液泵、第一維色譜柱、自動進樣器及DAD檢測器；所述的第二維色譜單元包括第二維輸液泵、第二維色譜柱；定量環(huán)以及兩個十通閥作為第一維液相和第二維液相的轉(zhuǎn)換接口，其中:第一維色譜柱的進口端及出口端分別與自動進樣器及第一十通閥的I號接口相連，自動進樣器與第一維輸液泵連接；第二維色譜柱的進口端及出口端分別與第一十通閥的5號接口及9號接口相連；定量環(huán)的兩端接口分別與第二十通閥的9號和6號接口相連；DAD檢測器與第二十通閥的7號接口相連；第二維輸液泵與第一十通閥的4號接口相連；第一十通閥的2號接口與廢液缸相連；第一十通閥的10號接口與第二十通閥的8號接口相連；第一十通閥的3號接口與第二十通閥的10號接口相連；第一十通閥的6號接口與第二十通閥的5號接口相連；所述的第一十通閥和第二十通閥的其他接口無連接；在線測定步驟如下:
[0007](I)將第一維色譜柱及第二維色譜柱安裝于高效液相色譜儀上；
[0008](2)將需測定對映體過量值的混合溶液加入至色譜進樣瓶中；
[0009](3)通過自動進樣器進樣，此時第一十通閥位置為10-1即10號接口與I號接口連通，第二十通閥位置為1-2即I號接口與2號接口連通；
[0010](4)待極性較小的雜質(zhì)經(jīng)過DAD檢測器，而待檢測的手性對映體即將從第一維色譜柱上洗脫下來時，第一十通閥位置保持為10-1，第二十通閥位置切換至10-1，此時待檢測的手性對映體被收集至定量環(huán)中；
[0011](5)當(dāng)待檢測的手性對映體已完全從第一維色譜柱上洗脫下來并進入定量環(huán)后，第一十通閥位置保持為10-1，第二十通閥位置切換至1-2，繼續(xù)第一維分離，將極性較大的雜質(zhì)從第一維色譜柱上洗脫下來；
[0012](6)待第一維色譜柱中極性較大的雜質(zhì)被洗脫完全后，第一十通閥位置切換至1-2，第二十通閥位置保持為1-2，以進行第二維色譜的分離；在第二維色譜的分離中，待檢測手性化合物的(R)，(S)構(gòu)型的在第二維色譜柱上被分離，并依次經(jīng)過DAD檢測器、獲得色譜圖，通過計算色譜圖中(R)，(S)構(gòu)型的峰面積得到對映體過量值。
[0013]所述的第一維色譜柱為正相氨基柱。
[0014]所述的第二維色譜柱為正相手性柱。
[0015]所用的高效液相色譜儀為Dionex Ultimate3000系統(tǒng)。
[0016]上述步驟(2)中將需測定對映體過量值的混合溶液經(jīng)過液相過膜處理后直接加入至色譜進樣瓶中，膜的濾孔為0.45 μ m。
[0017]采用上述技術(shù)方案的用于混合樣品中手性化合物對映體過量值直接測定的方法，選擇使用在線二維高效液相色譜代替?zhèn)鹘y(tǒng)的一維高效液相色譜，該在線二維高效液相色譜系統(tǒng)包含了第一維色譜單元、第二維色譜單元、定量環(huán)和兩個十通閥。該第一維高效液相色譜等效于傳統(tǒng)對映體過量值測定方法中手性藥物的層析柱分離純化過程，即利用無手性分離能力的氨基柱將反應(yīng)物、副產(chǎn)物、催化劑、溶劑等雜質(zhì)與目標(biāo)手性藥物分離，并通過兩個十通閥的切換實現(xiàn)目標(biāo)手性藥物的收集(收集于定量環(huán)中)。該第二維高效液相色譜等效于傳統(tǒng)測定方法中利用一維手性色譜測定對映體過量值的步驟，即采用合適的手性柱對目標(biāo)手性藥物進行手性分離分析，通過色譜圖上的(R)，(S)構(gòu)型對應(yīng)的色譜峰計算得到對映體過量值。
[0018]本發(fā)明能夠?qū)Π惺中运幬飳τ丑w的混合溶液直接進行高效液相色譜分析，無需測定手性藥物對映體過量值常規(guī)方法中所必須的樣品預(yù)分離、純化步驟，可以直接獲得混合溶液中手性藥物的對映體過量值。對比常規(guī)測定方法，本發(fā)明能節(jié)省溶劑，無需樣品進樣前的純化分離，大大節(jié)約分析時間。同時，本發(fā)明操作簡單，易于實現(xiàn)自動化，進樣過程中十通閥均可自動切換，設(shè)定好條件后即可大批量、連續(xù)地進行混合溶液中手性化合物對映體過量值的測定。
[0019]綜上所述，本發(fā)明是一種操作簡單、高通量快速測定的用于混合樣品中手性化合物對映體過量值直接測定的方法。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1為本發(fā)明第一維色譜單元、第二維色譜單元、定量環(huán)以及兩個十通閥的連接示意圖。
[0021]圖2為本發(fā)明測定混合樣品中手性化合物對映體過量值的在線二維色譜方法的一般分析步驟，以及不同分析步驟過程中閥的切換與管路的連接。
[0022]圖3為實施例中不對稱合成反應(yīng)方程式。
[0023]圖4為實施例中在線二維色譜分析的一般色譜圖及三維色譜圖。
【具體實施方式】
[0024]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的描述，以使本發(fā)明的優(yōu)點和特征能更易于被本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，從而對本發(fā)明的保護范圍做出更為清楚明確的界定。
[0025]實施例1:
[0026]液相的部件連接請參照圖1，用于測定的在線二維色譜系統(tǒng)包括第一維色譜單元、第二維色譜單元和兩個十通閥，其連接如下:第一維色譜單元包括第一維輸液泵11、第一維色譜柱13、自動進樣器12及D`AD檢測器20 ;第二維色譜單元包括第二維輸液泵16、第二維色譜柱14 ;定量環(huán)18以及兩個十通閥作為第一維液相和第二維液相的轉(zhuǎn)換接口，其中:第一維色譜柱13的進口端及出口端分別與自動進樣器12及第一十通閥15的I號接口相連，自動進樣器12與第一維輸液泵11連接；第二維色譜柱14的進口端及出口端分別與第一^h通閥15的5號接口及9號接口相連；定量環(huán)18的兩端接口分別與第二十通閥19的9號和6號接口相連；DAD檢測器20與第二十通閥19的7號接口相連；第二維輸液泵16與第一十通閥15的4號接口相連；第一十通閥15的2號接口與廢液缸17相連；第一十通閥15的10號接口與第二十通閥19的8號接口相連；第一^h通閥15的3號接口與第二十通閥19的10號接口相連；第一^h通閥15的6號接口與第二十通閥19的5號接口相連；所述的第一^h通閥15和第二十通閥19的其他接口無連接；
[0027]本實施例中，用于測試的混合樣品來自于不對稱合成的粗產(chǎn)物，其合成反應(yīng)步驟如下:將1.0mmol2_氨基苯乙酮、1.5mmol苯甲醒及0.1mmol手性催化劑Hua Cat加入到
1.0mL甲醇中，常溫下磁力攪拌48h，反應(yīng)生成具有手性碳原子的2-苯基-2，3- 二氫喹諾酮(反應(yīng)方程式如圖3所示)，反應(yīng)溶液即為本實施例中所需測定(R，S)-2-苯基-2，3-二氫喹諾酮對映體過量值的混合溶液。
[0028]本實施例中，第一維色譜柱13為正相氨基柱(150mmX4.6mm, 5 μ m),第二維色譜柱14為大賽貓正相手性Chiralpak 0D-H柱(250_X4.6mm, 5 μ m)。定量環(huán)的體積為5.0mL。第一維色譜和第二維色譜均使用色譜純的正己烷和色譜純的異丙醇作為流動相，第一維液相使用梯度洗脫(0_7min:正己烷與異丙醇的體積比為98:2 ;7_7.9min:正己烷與異丙醇的體積比從98:2到70:30 ；7.9_12min:正己烷與異丙醇的體積比為70:30)，第二維液相使用等度洗脫(正己烷與異丙醇的體積比為70:30)，流速為1.0mL/min，檢測波長為365nm，紫外掃描范圍為200-400nm。
[0029]本實施例中，混合溶液中(R，S)-2-苯基-2，3-二氫喹諾酮的對映體過量值在線二維色譜測定的操作步驟如下:
[0030](I)將作為第一維色譜柱13的氨基柱及第二維色譜手性Chiralpak OD-H柱分別安裝于高效液相色譜系統(tǒng)上。直接從不對稱合成反應(yīng)溶液中取樣，將含(R，S)-2-苯基-2，3- 二氫喹諾酮的混合溶液經(jīng)過膜(濾孔為0.45 μ m的膜)處理后加入至色譜進樣瓶中。
[0031](2)將第一^h通閥15位置設(shè)定為10-1,第二十通閥19位置為1_2，并開啟第一維輸液泵11(1.0mL/min)、DAD檢測器20 (365nm)、柱溫箱(恒溫25°C )。待檢測器的基線平穩(wěn)后，將準(zhǔn)備好的樣品通過自動進樣器進樣。
[0032](3)由于第一維色譜柱13為正相氨基柱，因此極性小的物質(zhì)保留能力差，首先被洗脫下來，待極性較小的雜質(zhì)經(jīng)過DAD檢測器20，而待檢測的(R，S) -2-苯基-2，3- 二氫喹諾酮即將從第一維正相氨基柱上洗脫下來時(保留時間為7.9min時)，第一十通閥15位置保持為10-1，第二十通閥19位置切換至10-1，此時，(R, S)-2-苯基-2，3-二氫喹諾酮被收集至5.0mL的定量環(huán)18中。
[0033](4)待(R，S)-2-苯基-2，3-二氫喹諾酮已完全從第一維正相氨基柱上洗脫下來并進入定量環(huán)18后(保留時間為10.0min時)，第一十通閥15位置保持為10_1，第二十通閥19位置切換至1-2，繼續(xù)第一維分離，此時將極性較大的雜質(zhì)從第一維色譜柱13上洗脫下來。
[0034](5)待第一維色譜柱13中極性較大的雜質(zhì)被洗脫完全后(保留時間為12.0min時)，第一十通閥15位置切換至1-2，第二十通閥19位置保持為1-2，并開啟第二維輸液泵16 (1.0mL/min)，關(guān)閉第一維輸液泵11，以進行第二維色譜的分離。在第二維色譜的分離中，(R) -2-苯基-2，3- 二氫喹諾酮與(S) -2-苯基-2，3- 二氫喹諾酮在ChiralpakOD-H柱上被分離，并依次經(jīng)過DAD檢測器20，通過計算色譜圖中(R) -2-苯基-2，3- 二氫喹諾酮與
(S)-2-苯基-2，3- 二氫喹諾酮的色譜峰面積得到對映體過量值為35.83%。
[0035]其365nm檢測波長下的色譜圖及200_400nm掃描的三維色譜圖如圖3所示，從圖中可以看出7.9-10.0min時的洗脫液被收集至定量環(huán)中，因此檢測器的響應(yīng)為0，而當(dāng)進行二維分析時(保留時間為12.0-35.0min)，之前被收集在定量環(huán)中的(R)_2_苯基-2，3-二氫喹諾酮與(S) -2-苯基-2，3- 二氫喹諾酮被Chiralpak OD-H柱分離并依次經(jīng)過檢測器,并呈現(xiàn)良好的分離度，本實施例很好地說明了本測定方法的可行性。
[0036]與傳統(tǒng)測定不對稱合成粗產(chǎn)物中對映體過量值的方法相比，本發(fā)明不需要進樣前復(fù)雜費時的柱層析純化步驟，可以實現(xiàn)包含有反應(yīng)物底液在內(nèi)的混合溶液中手性化合物對映體過量值的直接測定。同時由于可以直接從反應(yīng)溶液中取樣進行測定，因此可以實現(xiàn)不對稱合成反應(yīng)中對映體過量值及產(chǎn)率的實時監(jiān)測。
[0037]以上所述僅為本發(fā)明的實施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā)明說明書及附圖內(nèi)容所作的等效結(jié)構(gòu)或等效流程變換，或直接或間接運用在其他相關(guān)的【技術(shù)領(lǐng)域】，均同理包括在本發(fā)明的專利保護范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種用于混合樣品中手性化合物對映體過量值直接測定的方法，包括第一維色譜單元、第二維色譜單元和兩個十通閥，所述的第一維色譜單元包括第一維輸液泵(11)、第一維色譜柱(13)、自動進樣器(12)及DAD檢測器(20);所述的第二維色譜單元包括第二維輸液泵(16)、第二維色譜柱(14);定量環(huán)(18)以及兩個十通閥作為第一維液相和第二維液相的轉(zhuǎn)換接口，其中:第一維色譜柱(13)的進口端及出口端分別與自動進樣器(12)及第一十通閥(15)的I號接口相連，自動進樣器(12)與第一維輸液泵(11)連接；第二維色譜柱(14)的進口端及出口端分別與第一^h通閥(15)的5號接口及9號接口相連；定量環(huán)(18)的兩端接口分別與第二十通閥(19)的9號和6號接口相連；DAD檢測器(20)與第二十通閥(19)的7號接口相連；第二維輸液泵(16)與第一十通閥(15)的4號接口相連；第一十通閥(15)的2號接口與廢液缸(17)相連；第一^h通閥(15)的10號接口與第二十通閥(19)的8號接口相連；第一十通閥(15)的3號接口與第二十通閥(19)的10號接口相連；第一十通閥(15)的6號接口與第二十通閥(19)的5號接口相連；所述的第一十通閥(15)和第二十通閥(19)的其他接口無連接；其特征在于:在線測定步驟如下: (1)將第一維色譜柱(13)及第二維色譜柱(14)安裝于高效液相色譜儀上； (2)將需測定對映體過量值的混合溶液加入至色譜進樣瓶中； (3)通過自動進樣器(12)進樣，此時第一十通閥(15)位置為10-1即10號接口與I號接口連通，第二十通閥(19)位置為1-2即I號接口與2號接口連通； (4)待極性較小的雜質(zhì)經(jīng)過DAD檢測器(20)，而待檢測的手性對映體即將從第一維色譜柱(13)上洗脫下來時，第一十通閥(15)位置保持為10-1，第二十通閥(19)位置切換至10-1，此時待檢測的手性對映體被收集至定量環(huán)(18)中； (5)當(dāng)待檢測的手性對映體已完全從第一維色譜柱(13)上洗脫下來并進入定量環(huán)(18)后，第一十通閥(15)位置保持為10-1，第二十通閥(19)位置切換至1-2，繼續(xù)第一維分離，將極性較大的雜質(zhì)從第一維色譜柱(13)上洗脫下來； (6)待第一維色譜柱(13)中極性較大的雜質(zhì)被洗脫完全后，第一十通閥(15)位置切換至1-2，第二十通閥(19)位置保持為1-2，以進行第二維色譜的分離；在第二維色譜的分離中，待檢測手性化合物的(R)，(S)構(gòu)型的在第二維色譜柱(14)上被分離，并依次經(jīng)過DAD檢測器(20)、獲得色譜圖，通過計算色譜圖中(R)，(S)構(gòu)型的峰面積得到對映體過量值。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于混合樣品中手性化合物對映體過量值直接測定的方法，其特征在于:所述的第一維色譜柱(13)為正相氨基柱。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用于混合樣品中手性化合物對映體過量值直接測定的方法，其特征在于:所述的第二維色譜柱(14)為正相手性柱。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用于混合樣品中手性化合物對映體過量值直接測定的方法，其特征在于:所用的高效液相色譜儀為Dionex Ultimate3000系統(tǒng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用于混合樣品中手性化合物對映體過量值直接測定的方法，其特征在于:上述步驟(2)中將需測定對映體過量值的混合溶液經(jīng)過液相過膜處理后直接加入至色譜進樣瓶中，膜的濾孔為0.45 μ m。
【文檔編號】G01N30/88GK103558325SQ201310532913
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年10月31日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月31日
【發(fā)明者】陳曉青, 劉琦, 陽華, 蔣新宇 申請人:中南大學(xué)