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一種防治稻紋枯病藥物的藥效測定方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種防治稻紋枯病藥物的藥效測定方法，利用一組簡單便利的器具，在離體水稻葉片上測定藥物對稻紋枯病發(fā)病的防治效果，該方法的步驟如下：1）水稻葉片的培育準備；2）器具準備；3）病菌的培養(yǎng)準備；4）防治藥物的配備；5）測定用離體葉片的準備；6）藥物施用；7）接種病菌；8）施藥后或接種后的處置。本發(fā)明的優(yōu)點是：1）接種發(fā)病較為穩(wěn)定一致；藥效結(jié)果重現(xiàn)性好，且查錄容易量化；測試耗時短。2）可避免出現(xiàn)有效藥物的漏選。3）離體葉片采樣方便；室內(nèi)操作；便于跟蹤藥物在發(fā)病擴展過程中的作用；測定過程操作簡單易行，且局部條件控制方便；容易實現(xiàn)測定方法的標準化。
【專利說明】一種防治稻紋枯病藥物的藥效測定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)技術(shù)和生物技術(shù)。具體是一種防治稻紋枯病藥物的藥效測定方法。
【背景技術(shù)】
[0002]稻紋枯病是水稻的首要病害，每年可引起我國60億多公斤的稻糧損失，由于與該病害防病控害有關(guān)的許多基礎(chǔ)研究滯后，當前及相當一段時期內(nèi)，該病害的防治仍主要依賴農(nóng)藥防治；當前的防治藥劑主要是井岡霉素，由于用藥單一，且井岡霉素與人類醫(yī)學(xué)用抗菌素密切有關(guān)，因此生產(chǎn)上需要尋找替代藥物和更多的可用藥物；那么，加快加強防治藥物的篩選鑒定顯得非常必要；而高效便捷的測定方法對篩選鑒定工作無疑很有益。
[0003]根據(jù)藥效測定時，藥物作用對象病原菌所處的背景條件，藥效測定方法可有如下3類主要方法:培養(yǎng)基生物測定法、活體植株測定法、和組織測定法。培養(yǎng)基生物測定法在培養(yǎng)基上測定藥物對病原菌的抑制作用，該方法的嚴重不足是會漏選有效藥物；活體植株測定法是在活體植物上測定藥物對病害的作用效果，該方法的突出弊病是，費時耗力、及試驗條件難控等；組織測定法是在離體的植物器官組織上測定藥物對病害的作用效果，該方法可克服前面2類方法的弊病，因而成了近年備受重視的藥效測定方法。
[0004]在稻紋枯病的藥物篩選中，已有2種較為成熟的組織測定法，即離體蠶豆葉測定法和離體水稻葉鞘測定法，前者以離體蠶豆葉片為組織材料，測定藥物對稻紋枯病菌侵染離體蠶豆葉片的防治效果，后者以離體水稻葉鞘為組織材料，測定藥物對稻紋枯病菌侵染離體水稻葉鞘的防治效果。實際應(yīng)用中，兩者都存在某些弊病。
[0005]蠶豆葉測定法仍有可能漏選那些在蠶豆上無效、而在水稻上有效的藥物，而且蠶豆葉較小，不利于進行藥物的作用過程跟蹤。水稻葉鞘測定法中，由于水稻各葉鞘屬于外葉鞘包內(nèi)葉鞘并相互環(huán)抱式生長，試驗中取材葉鞘不夠方便；接種發(fā)病的均勻性和穩(wěn)定性欠佳等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種便捷的防治稻紋枯病藥物的藥效測定方法。
[0007]本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下:
[0008]一種防治稻紋枯病藥物的藥效測定方法，依據(jù)稻紋枯病菌也能侵染水稻離體葉片，且發(fā)病較為均勻和穩(wěn)定的特性，利用一組簡單便利的器具，進行離體葉片的接種發(fā)病和藥物處理，測定藥物對稻紋枯病發(fā)病的防治效果，測定方法的步驟如下:
[0009]1.水稻葉片的培育準備:按一般方法種植水稻植株，常規(guī)水肥管理，培育至6葉期后使用。
[0010]2.主要器具準備:主要器具包括大方盤、小方盤、玻璃罩、和玻璃板；用潔凈劑將這些器具洗滌干凈后備用。
[0011]3.病菌的培養(yǎng)準備:將測定用的病菌菌株移植到PSA平板培養(yǎng)基上，PSA培養(yǎng)基為:馬鈴薯200g、蔗糖20g、瓊脂20g和水1000ml。在溫度30°C條件下培養(yǎng)至菌落剛長滿平板，取直徑為6mm打孔器在平板菌落外周打取大小一致的菌絲瓊脂圓塊，以此菌絲塊作為接種測定用的接種體。
[0012]4.防治藥物的配備:用清水將防治藥物溶解或稀釋，并將有效成分調(diào)配成需要測定的濃度，并以空白清水作無藥處理對照(CK)。
[0013]5.測定用離體葉片的準備:用干凈剪刀采集步驟I準備的水稻植株上完全展開的正常葉片，置入盛裝清水的干凈容器中帶回室內(nèi)。取出步驟2備好的組件，將小方盤置于大方盤內(nèi)的中間，取2個干凈的普通橡皮筋分別套在玻璃板的上下兩頭，并將玻璃板置于小方盤內(nèi)架成穩(wěn)定的傾斜狀態(tài)，然后往小方盤內(nèi)注入清水。將采回的葉片基部朝下，平行插擺于玻璃板與橡皮筋之間，橡皮筋將葉片的兩端夾穩(wěn)，葉片基端插入小方盤內(nèi)的清水層內(nèi)，剪除超出玻璃板上緣的葉片尾部。
[0014]6.藥物施用:用噴霧器將步驟4配備的待測藥液噴到步驟5備好的葉片上，直至葉片上均勻布滿霧滴為止。
[0015]7.接種病菌:用干凈鑷子挑取步驟3準備的菌絲塊貼放于步驟5準備好的離體葉片上。
[0016]8.施藥后或接種后的處置:取玻璃罩將小方盤以及盤內(nèi)的離體葉片全部罩在大方盤上,并往大方盤內(nèi)注入清水,使玻璃罩內(nèi)部封閉并形成罩內(nèi)穩(wěn)定的高濕狀態(tài)；然后將整套裝置放于具備正常散射光的普通室內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度維持在在26°C ±1°C波動范圍。
[0017]9.變動實施步驟測定藥物防治效果的作用方式:通過改變步驟6與步驟7實施的先后次序，能實現(xiàn)測定藥物對病害的防治作用方式，如下:
[0018]A.先實施步驟6再到步驟7 ;或先操作步驟7，在菌絲生長侵染之前操作步驟6 ;結(jié)果能體現(xiàn)藥物防治的保護作用。
[0019]B.先實施步驟7，培養(yǎng)24小時發(fā)病后，再實施步驟6，結(jié)果能體現(xiàn)藥物防治的治療作用。
[0020]結(jié)果觀察調(diào)查:一般接種病菌24小時后，無藥物的對照處理出現(xiàn)清晰穩(wěn)定的發(fā)病反應(yīng)，有防治作用的藥物處理，與對照處理相比發(fā)病程度減輕或不發(fā)病；發(fā)病程度可用病斑高度(或稱病斑長度)的指標來衡量，病斑高度是指從接種點到病斑最前沿的距離；通過量化指標計算藥物的防治效果(藥效)。
[0021]防治效果(％)=(對照處理的病斑高度-藥物處理的病斑高度)X 100/對照處理的病斑高度
[0022]本發(fā)明的優(yōu)點是:
[0023]I)接種發(fā)病較為穩(wěn)定一致；藥效表現(xiàn)直觀清晰，結(jié)果重現(xiàn)性好，且查錄容易量化。
[0024]2)可避免出現(xiàn)有效藥物的漏選。
[0025]3)采用較長的葉片，便于跟蹤藥物在發(fā)病擴展過程中的作用。
[0026]4)測試耗時短，一般比葉鞘測定法提前I?2天。
[0027]6)離體葉片采樣方便，測定過程操作簡單易行。
[0028]7)室內(nèi)操作，占空間少，局部條件控制方便，容易實現(xiàn)測定方法的標準化。
【專利附圖】

【附圖說明】[0029]圖1是本發(fā)明藥效測定用的配套器具。
[0030]圖中，大方盤a，小方盤b，玻璃板C，玻璃罩d。
[0031]A圖是用小金屬片把玻璃板c臨時架成穩(wěn)定的傾斜狀態(tài)出圖是不用金屬片而直接用玻璃膠和一小塊玻璃將玻璃板c粘接成固定的傾斜狀態(tài)；C圖是用玻璃罩d將小方盤b以及盤上的玻璃板c罩在大方盤a上的側(cè)面觀；D圖是在C圖的玻璃板c上放置水稻葉片后的正面觀。
[0032]圖2是本發(fā)明在配套器具中的玻璃板上放置離體葉片及接種病菌后的正面觀。
[0033]圖3是本發(fā)明藥效測定結(jié)果示意圖。
[0034]圖中，A圖是無藥物處理的對照發(fā)病表現(xiàn)；B圖是無藥物處理和未接種病菌的空白對照；C圖是施藥處理的葉片發(fā)病輕的表現(xiàn)；D圖是施藥處理的葉片不發(fā)病的表現(xiàn)。
【具體實施方式】
[0035]下面結(jié)合附圖與實施例對本發(fā)明作進一步描述。
[0036]本發(fā)明利用稻紋枯病菌可侵染離體水稻葉片發(fā)病的特性，使用一組便利的配套器具，在離體稻葉上測試防治藥物對病菌侵染致病的防治作用。所用的配套器具如圖1所示，主要組件為大方盤、小方盤，傾斜放置的玻璃板、和玻璃罩；2個方盤為貯水用，玻璃板為承載葉片用，玻璃罩起封閉保濕用。使用時，由于葉片在玻璃板上被固定并整齊展開，如圖2所示，對葉片實施接種和施藥操作非常方便；而且玻璃罩的打開與罩回均未觸及罩內(nèi)的試驗材料，因而可以根據(jù)需要反復(fù)開閉玻璃罩實施接種或施藥操作。本發(fā)明用的離體葉片在溫度為26°C 土1°C條件下，一般可維持7天以上的正常綠葉，試驗無需額外添加保鮮劑處理。
[0037]如圖2所示的葉片經(jīng)接種稻紋枯病菌后，在26°C ±1°C溫度范圍內(nèi)培養(yǎng)，無藥處理的對照葉片，一般接種24小時后開始發(fā)病，病斑沿著菌絲生長的方向不斷擴展，并形成較為清晰一致的壞死病斑，如圖3的A圖所示；而未接種病菌的葉片保持正常的綠葉，如圖3的B圖所示；經(jīng)過接種病菌并施藥處理的葉片表現(xiàn)為發(fā)病輕或不發(fā)病，如圖3的C圖和D圖所示。
[0038]發(fā)病程度可用病斑高度(或稱病斑長度)的量化指標來衡量，病斑高度是指從接種點到病斑最前沿的距離；藥物的防治效果(藥效)可按如下公式計算:
[0039]防治效果(％)=(對照處理的病斑高度-藥物處理的病斑高度)X 100/對照處理的病斑高度
[0040]實施例1
[0041]應(yīng)用本發(fā)明一種防治稻紋枯病藥物的藥效測定方法，以水稻品種中優(yōu)679和稻紋枯病菌菌株Rs-1為材料，測定藥物井R霉素以不同有效濃度防治稻紋枯病的防治效果，按如下步驟實施操作:
[0042]1.水稻葉片的培育準備:按一般方法栽培水稻品種中優(yōu)679，常規(guī)水肥管理，生長至6葉期后使用。
[0043]2.主要器具準備:測試用的主要器具包括:如圖1所示的大方盤a、小方盤b、玻璃板C、玻璃罩d等組件。本實施例器具的用材與大小:大方盤a為長X寬X高=40X30X3cm的普通方盤；小方盤b為長X寬X高=29 X 22 X 3cm的普通方盤；玻璃板c為24 X 24cm的普通玻璃板；玻璃罩d為長X寬X高=31 X 25X 20cm的有機玻璃罩；圖1的A圖中的薄金屬片，折鉤后長度為15cm。用潔凈劑將這些組件洗滌干凈后備用；
[0044]3.病菌的培養(yǎng)準備:將菌株Rs-1移植到PSA平板培養(yǎng)基上，PSA培養(yǎng)基為:馬鈴薯200g、蔗糖20g、瓊脂20g和水1000ml。在溫度30°C條件下培養(yǎng)至菌落剛長滿平板，取直徑為6mm打孔器在平板菌落外周打取大小一致的菌絲瓊脂圓塊，以此菌絲塊作為接種測定用的接種體。
[0045]4.防治藥物的配備:用清水將防治藥物20 %的井R霉素水溶粉劑(浙江錢江生物化學(xué)股份有限公司的產(chǎn)品)溶解，并將施用藥液的有效成分濃度調(diào)配為3個施用濃度:104.2 μ g/ml,6.1 μ g/ml, 1.2 μ g/ml ;其中104.2 μ g/ml為一般田間應(yīng)用濃度；而另2個濃度6.1 μ g/ml和1.2 μ g/ml是處于防治效果易變的濃度范圍；以空白清水處理作無藥處理對照(CK)。
[0046]5.測定用離體葉片的準備:用干凈剪刀采集步驟I準備的水稻植株上完全展開的正常葉片，置入盛裝清水的大燒杯中帶回室內(nèi)。取出步驟2備好的組件，將小方盤置于大方盤內(nèi)的中間，取2個干凈的普通橡皮筋分別套在玻璃板的上下兩頭，并將玻璃板以傾斜狀態(tài)置于小方盤內(nèi)，如圖1的B圖所示，或者按圖1的A圖方式用金屬片臨時架成穩(wěn)定的傾斜狀態(tài)，然后往小方盤內(nèi)注入深厚清水(約占小方盤深度的75%)。將采回的葉片基部朝下，平行插擺于玻璃板與橡皮筋之間，橡皮筋將葉片的兩端夾穩(wěn)，葉片基端插入小方盤內(nèi)的清水層內(nèi)，然后將超出玻璃板上緣的尾部葉片剪除，如圖2所示。
[0047]6.藥物施用:用手持噴霧器將步驟4配備的測試藥液噴到步驟5備好的葉片上，直至葉片上均勻布滿霧滴為止。
[0048]7.接種病菌:用干凈鑷子挑取步驟3準備的菌絲塊貼放于步驟6操作完備的離體葉片上，如圖2所示。
[0049]8.施藥后和接種后的處置:取玻璃罩將小方盤以及盤內(nèi)的離體葉片全部罩在大方盤上,并往大方盤內(nèi)注入薄層清水,使玻璃罩內(nèi)部封閉并形成罩內(nèi)穩(wěn)定的高濕狀態(tài)；然后將整套裝置放于具備正常散射光的普通室內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度維持在26°C ±1°C波動范圍。
[0050]結(jié)果:接種培養(yǎng)3天后，無藥處理對照葉片發(fā)病病斑高度達11.13cm,而施用井岡霉素藥液處理的葉片發(fā)病減輕，表現(xiàn)出有防治效果，在生產(chǎn)使用濃度下(104.2 μ g/ml),顯示出高效的防治作用(93.80%);當藥液有效濃度減少，防治效果跟著下降(見表1)。本實施例的防治藥物井網(wǎng)霉素是在病菌侵染之前施用，因而結(jié)果體現(xiàn)的是井網(wǎng)霉素的保護作用。
[0051]表1用本發(fā)明的方法測定藥物井R霉素在不同濃度下的防治效果
【權(quán)利要求】
1.一種防治稻紋枯病藥物的藥效測定方法，其特征在于，利用一組簡單便利的器具，在離體水稻葉片上進行接種發(fā)病和藥物處理，測定藥物對稻紋枯病的防治效果，方法的步驟如下: 1)水稻葉片的培育準備:按一般方法種植水稻植株，常規(guī)水肥管理，培育至6葉期后使用； 2)器具準備:器具包括大方盤、小方盤、玻璃罩、和玻璃板；用潔凈劑將這些器具洗滌干凈后備用； 3)病菌的培養(yǎng)準備:將測定用的病菌菌株移植到PSA平板培養(yǎng)基上，PSA培養(yǎng)基為:馬鈴薯200g、蔗糖20g、瓊脂20g和水1000ml，在溫度30°C條件下培養(yǎng)至菌落剛長滿平板，取直徑為6mm打孔器在平板菌落外周打取大小一致的菌絲瓊脂圓塊，以此菌絲塊作為接種測定用的接種體； 4)防治藥物的配備:用清水將防治藥物溶解或稀釋，并將有效成分調(diào)配成需要測定的濃度，并以空白清水作無藥處理對照(CK); 5)測定用離體葉片的準備:用干凈剪刀采集步驟I)準備的水稻植株上完全展開的正常葉片，置入盛裝清水的干凈容器中帶回室內(nèi)；取出步驟2)備好的組件，將小方盤置于大方盤內(nèi)的中間，取2個干凈的普通橡皮筋分別套在玻璃板的上下兩頭，并將玻璃板置于小方盤內(nèi)架成穩(wěn)定的傾斜狀態(tài)，然后往小方盤內(nèi)注入清水；將采回的葉片基部朝下，平行插擺于玻璃板與橡皮筋之間，橡皮筋將葉片的兩端夾穩(wěn)，葉片基端插入小方盤內(nèi)的清水層內(nèi)，剪除超出玻璃板上緣的葉片尾部； 6)藥物施用:用噴霧器將步驟4)配備的待測藥液噴到步驟5)備好的葉片上，直至葉片上均勻布滿霧滴為止； 7)接種病菌:用干凈鑷子挑取步驟3)準備的菌絲塊貼放于步驟5)準備好的離體葉片上； 8)施藥后或接種后的處置:取玻璃罩將小方盤以及盤內(nèi)的離體葉片全部罩在大方盤上,并往大方盤內(nèi)注入清水,使玻璃罩內(nèi)部封閉并形成罩內(nèi)穩(wěn)定的高濕狀態(tài)；然后將整套裝置放于具備正常散射光的普通室內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度維持在26°C ±1°C波動范圍； 9)變動實施步驟測定藥物防治效果的作用方式:通過改變步驟6)與步驟7)實施的先后次序，能實現(xiàn)測定藥物對病害的防治作用方式，如下: A.先實施步驟6)再到步驟7);或先操作步驟7)，在菌絲生長侵染之前操作步驟6);結(jié)果能體現(xiàn)藥物防治的保護作用； B.先實施步驟7)，培養(yǎng)24小時發(fā)病后，再實施步驟6)，結(jié)果能體現(xiàn)藥物防治的治療作用； 結(jié)果觀察調(diào)查:一般接種病菌24小時后，無藥物的對照處理出現(xiàn)清晰穩(wěn)定的發(fā)病反應(yīng)，有防治作用的藥物處理，與對照處理相比發(fā)病程度減輕或不發(fā)??；發(fā)病程度可用病斑高度(或稱病斑長度)的量化指標來衡量，病斑高度是指從接種點到病斑最前沿的距離；通過量化指標計算藥物的防治效果(藥效); 防治效果(％)=(對照處理的病斑高度-藥物處理的病斑高度)X 100/對照處理的病斑高度。
【文檔編號】G01N33/15GK103884825SQ201410133494
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年3月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月29日
【發(fā)明者】張君成, 郭地, 時婷婷 申請人:廣西大學(xué)