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一種基于乳酸脫氫酶測(cè)定的電子煙煙液細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)方法
【專(zhuān)利摘要】一種基于乳酸脫氫酶測(cè)定的電子煙煙液細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)方法，包括以下步驟：1）配制實(shí)驗(yàn)試劑，2）細(xì)胞接種，3）電子煙煙液染毒，4）LDH測(cè)定，5）結(jié)果與分析。本發(fā)明針對(duì)大多數(shù)電子煙煙液樣本密度大的特點(diǎn)，確立了采用質(zhì)量稱(chēng)重配制電子煙染毒溶液的方法。本發(fā)明的評(píng)價(jià)方法通過(guò)細(xì)胞接種密度的優(yōu)化、細(xì)胞裂解液的選擇、LDH基質(zhì)液反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化提高檢測(cè)靈敏度，并通過(guò)電子煙煙液染毒濃度的優(yōu)化，確定了最佳染毒濃度，以獲得最佳劑量效應(yīng)曲線。通過(guò)LDH的測(cè)定，可反映電子煙煙液對(duì)細(xì)胞膜的損傷程度，揭示電子煙的細(xì)胞毒性機(jī)理。此外，本測(cè)定方法還具有操作快速簡(jiǎn)便、靈敏性高、結(jié)果穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種基于乳酸脫氫酶測(cè)定的電子煙煙液細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)方法【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及電子煙煙液體外毒理學(xué)評(píng)價(jià)研究領(lǐng)域，具體說(shuō)是一種基于乳酸脫氫酶測(cè)定的電子煙煙液細(xì)胞毒性的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著人們對(duì)“吸煙有害健康”的了解，各國(guó)政府均在現(xiàn)行法律規(guī)定范圍內(nèi)積極采取和實(shí)行有效的立法、行政或其他措施，禁止在公共場(chǎng)所吸煙。2005年，中國(guó)簽署了世界衛(wèi)生組織《煙草控制框架公約》。2012年，中國(guó)政府發(fā)布《中國(guó)煙草控制規(guī)劃(2012-2015年)》，提出創(chuàng)造無(wú)煙環(huán)境，實(shí)施公共場(chǎng)所全面禁煙。室內(nèi)禁煙措施導(dǎo)致電子煙等新型產(chǎn)品在各國(guó)市場(chǎng)上得到迅速增長(zhǎng)，消費(fèi)群體不斷擴(kuò)大。電子煙又名電子尼古丁傳送系統(tǒng)。世界衛(wèi)生組織對(duì)電子尼古丁傳送系統(tǒng)的官方定義為:電子尼古丁傳送系統(tǒng)是一種消費(fèi)產(chǎn)品，能夠向肺傳輸尼古丁。電子煙一般都由三部分構(gòu)成:煙桿、霧化器、煙液。近年來(lái)，電子煙以“保健”，“戒煙”，“清肺”等為宣傳口號(hào)，以網(wǎng)絡(luò)為主要營(yíng)銷(xiāo)途徑，在中國(guó)地區(qū)銷(xiāo)量大增。某些電子煙產(chǎn)品還宣稱(chēng)其比傳統(tǒng)卷煙的危害性更小。然而目前對(duì)電子煙的毒性評(píng)價(jià)研究較少，相關(guān)研究?jī)H使用3-(4，5- 二甲基噻唑-2)-2，5- 二苯基四氮唑溴鹽法(MTT法)對(duì)電子煙煙液或煙霧的細(xì)胞毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果表明不同電子煙煙液的細(xì)胞毒性相差很大。
[0003]檢測(cè)化合物細(xì)胞毒性可通過(guò)多種生物學(xué)終點(diǎn)進(jìn)行，例如通過(guò)測(cè)定酸性磷酸酶或其他蛋白活性來(lái)計(jì)算細(xì)胞數(shù)量、測(cè)定細(xì)胞代謝活性(例如MTT法)以及檢測(cè)細(xì)胞膜的完整性等生物學(xué)終點(diǎn)進(jìn)行評(píng)價(jià)。根據(jù)不同檢測(cè)原理開(kāi)展細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)，可從不同角度揭示化合物細(xì)胞毒性的作用機(jī)理。
[0004]細(xì)胞凋亡或化合 物染毒而造成的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的破壞會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞漿內(nèi)的酶釋放到培養(yǎng)液里，其中包括酶活性較為穩(wěn)定的乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)。通過(guò)檢測(cè)釋放的乳酸脫氫酶的活性，可表征細(xì)胞膜的完整性，實(shí)現(xiàn)對(duì)化合物細(xì)胞毒性的定量分析。
[0005]目前，電子煙煙液染毒對(duì)細(xì)胞膜的完整性影響還未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道，亟需建立基于LDH測(cè)定的電子煙煙液細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)方法，考察電子煙煙液細(xì)胞毒性的作用機(jī)理，定量準(zhǔn)確評(píng)價(jià)市售電子煙產(chǎn)品煙液的細(xì)胞毒性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是建立的一種LDH測(cè)定的電子煙煙液細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)方法，為電子煙產(chǎn)品的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)提供方法學(xué)支持。LDH法的測(cè)定原理是基于在乳酸脫氫酶的作用下，氧化型輔酶I (NAD+)被反應(yīng)生成的還原型輔酶I (NADH)，再與氧化型2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-苯四唑(INT)在硫辛酰胺脫氫酶(diaphorase)的催化下反應(yīng)生成強(qiáng)生色物甲臜(formazan )，在490nm波長(zhǎng)下產(chǎn)生吸收峰，從而確定釋放的乳酸脫氫酶的活性，作為細(xì)胞膜完整性的標(biāo)志，實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞毒性的定量分析。
[0007]本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的: 一種基于乳酸脫氫酶測(cè)定的電子煙煙液細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)方法，包括以下步驟:
I)配制實(shí)驗(yàn)試劑:有以下幾種:
(1)LDH基質(zhì)液的配制:用0.2 mol/L的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽-鹽酸(TriS-HCl)緩沖液(PH8.2)配制LDH基質(zhì)液，其中各成分及其終濃度分別為:乳酸鋰5X IO-2 mol/L、硝基氯化四氮唑(INT) 6.6X10—4 mol/L、吩嗪二甲酯硫酸鹽(PMS) 2.8X10—4 mol/L、氧化型輔酶I (NAD) 1.3X 10_3 mol/L, LDH基質(zhì)液應(yīng)在臨用前配制；
(2)細(xì)胞裂解液:20%的曲拉通100(Triton-100)；
(3)終止液:4M的鹽酸(HCl)溶液；
(4)細(xì)胞培養(yǎng)基:溶劑為RPM1-1640培養(yǎng)基，其中胎牛血清的體積百分比為10%，L-谷氨酰胺的濃度為2 mM,青霉素的濃度為100 IU/ml，鏈霉素的濃度為100 μ g/ml ；
(5)電子煙煙液染毒溶液:由于電子煙煙液的主要組成成分包括丙二醇、丙三醇等保潤(rùn)齊U，導(dǎo)致電子煙煙液溶液密度較大，無(wú)法準(zhǔn)確移取體積進(jìn)行染毒溶液的配制。因此，本發(fā)明中使用精度不小于萬(wàn)分之一的分析天平對(duì)電子煙煙彈液進(jìn)行準(zhǔn)確稱(chēng)量，然后使用細(xì)胞培養(yǎng)基溶液配制。電子煙煙液染毒濃度范圍應(yīng)覆蓋為10mg/ml-120 mg/ml,應(yīng)設(shè)置不少于7個(gè)非零染毒濃度。
[0008]2)細(xì)胞接種:本方法所用細(xì)胞系為中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞CHO細(xì)胞。在考察電子煙煙液對(duì)CHO細(xì)胞系的細(xì)胞毒性時(shí)，需開(kāi)展預(yù)實(shí)驗(yàn)，對(duì)細(xì)胞接種密度進(jìn)行優(yōu)化。向96孔板的每孔中加入100 μ L細(xì)胞懸液，按照優(yōu)化好的細(xì)胞接種密度進(jìn)行細(xì)胞接種，96孔板的最外周36個(gè)孔中每孔加入100 μ I生長(zhǎng)培養(yǎng)液作為空白對(duì)照，其余每孔加入100 μ I細(xì)胞懸液，于37 0C >5% C02條件下培養(yǎng)24 h ；
3)電子煙煙液染毒:細(xì)胞培養(yǎng)至指數(shù)增長(zhǎng)期后，吸去培養(yǎng)液，96孔板(除最外周36孔)每6孔為一組，分別設(shè)置正常對(duì)照組、7個(gè)不同劑量的電子煙煙液染毒組和LDH最大釋放組(細(xì)胞中能釋放出來(lái)的LDH最大量)，正常對(duì)照組和LDH最大釋放組均每孔加入100 μ I的細(xì)胞培養(yǎng)基，電子煙煙液染毒組每孔加入100 μ I不同濃度的電子煙煙液染毒溶液，96孔板的最外周36個(gè)孔中選擇其中6個(gè)孔作為培養(yǎng)基背景對(duì)照，再選擇6個(gè)孔加入最高電子煙煙液染毒溶液作為染毒溶液背景對(duì)照，于37 °C、5% C02條件下培養(yǎng)24 h。
[0009]4)LDH測(cè)定:電子煙煙液對(duì)細(xì)胞染毒24h，染毒結(jié)束前15分鐘，在最大釋放量孔中加入5 μ I裂解液。染毒結(jié)束后使用250g離心力對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)板離心5分鐘，每孔移取50 μ I上清至透明96孔板，加入100 μ ILDH基質(zhì)液，反應(yīng)一段時(shí)間后，加入50 μ I終止液，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)每孔在490 nm波長(zhǎng)處的吸光值。
[0010]6)結(jié)果與分析
原始吸光值A(chǔ):A = A490 nm A (染毒孔吸光度值)=6個(gè)平行孔的吸光度平均值 A (染毒溶液背景)=6個(gè)平行孔的吸光度平均值 A (培養(yǎng)基背景)=6個(gè)平行孔的吸光度平均值 A(空白對(duì)照組)=6個(gè)平行孔的吸光度平均值 A (最大釋放組)=6個(gè)平行孔的吸光度平均值
【權(quán)利要求】
1.一種基于乳酸脫氫酶測(cè)定的電子煙煙液細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)方法，其特征在于:包括以下步驟: 1)配制實(shí)驗(yàn)試劑: (1)LDH基質(zhì)液的配制:用0.2mol/L的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽-鹽酸(Tris-HCl)緩沖液(PH8.2)配制LDH基質(zhì)液，其中各成分及其終濃度分別為:乳酸鋰5 X IO-2 mol/L、硝基氯化四氮唑(INT) 6.6X10—4 mol/L、吩嗪二甲酯硫酸鹽(PMS) 2.8X10—4 mol/L、氧化型輔酶I (NAD) 1.3X 10_3 mol/L, LDH基質(zhì)液應(yīng)在臨用前配制； (2)細(xì)胞裂解液:20%的曲拉通100(Triton-100)； (3)終止液:4M的鹽酸(HCl)溶液； (4)細(xì)胞培養(yǎng)基:溶劑為RPM1-1640培養(yǎng)基，其中胎牛血清的體積百分比為10%，L-谷氨酰胺的濃度為2 mM,青霉素的濃度為100 IU/ml，鏈霉素的濃度為100 μ g/ml ； (5)電子煙煙液染毒溶液:用分析天平對(duì)電子煙煙液進(jìn)行準(zhǔn)確稱(chēng)量，然后使用細(xì)胞培養(yǎng)基溶液配制，電子煙煙液染毒濃度范圍10mg/mfl20 mg/ml，設(shè)置不少于7個(gè)非零染毒濃度； 2)細(xì)胞接種:所用細(xì)胞系為中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞CHO細(xì)胞，向96孔板的每孔中加入100μ L細(xì)胞懸液，按照優(yōu)化好的細(xì)胞接種密度進(jìn)行細(xì)胞接種，96孔板的最外周36個(gè)孔中每孔加入100 μ I生長(zhǎng)培養(yǎng)液作為空白對(duì)照，其余每孔加入100 μ I細(xì)胞懸液，于37 °C、5%C02條件下培養(yǎng)24 h ； 3)電子煙煙液染毒:細(xì)胞培養(yǎng)至指數(shù)增長(zhǎng)期后，吸去培養(yǎng)液，96孔板(除最外周36孔)每6孔為一組，分別設(shè)置正常對(duì)照組、7個(gè)不同劑量的電子煙煙液染毒組和LDH最大釋放組，正常對(duì)照組和LDH最大釋放組均每孔加入100 μ I的細(xì)胞培養(yǎng)基，電子煙煙液染毒組每孔加入100 μ I不同濃度的電子煙煙液染毒溶液，96孔板的最外周36個(gè)孔中選擇其中6個(gè)孔作為培養(yǎng)基背景對(duì)照，再選擇6個(gè)孔加入7個(gè)劑量中的最高劑量電子煙煙液染毒溶液作為染毒溶液背景對(duì)照，于37 °C、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h； 4)LDH測(cè)定:染毒結(jié)束前15分鐘，在LDH最大釋放量孔中加入5 μ I裂解液，染毒結(jié)束后使用250g離心力對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)板離心5分鐘，每孔移取50 μ I上清至透明96孔板，加入100 μ ILDH基質(zhì)液，反應(yīng)一段時(shí)間后，加入50 μ I終止液，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)每孔在490 nm波長(zhǎng)處的吸光值； 5)結(jié)果與分析 原始吸光值A(chǔ):A = A490 nm A (染毒孔吸光度值)=6個(gè)平行孔的吸光度平均值 A (染毒溶液背景)=6個(gè)平行孔的吸光度平均值 A (培養(yǎng)基背景)=6個(gè)平行孔的吸光度平均值 A(空白對(duì)照組)=6個(gè)平行孔的吸光度平均值 A (最大釋放組)=6個(gè)平行孔的吸光度平均值
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于乳酸脫氫酶測(cè)定的電子煙煙液細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)方法，其特征在于:在開(kāi)展細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)前，需對(duì)染毒所用細(xì)胞株的細(xì)胞接種密度進(jìn)行優(yōu)化，選擇LDH最大釋放量與空白對(duì)照組吸光度值相差最大，且細(xì)胞處于指數(shù)增長(zhǎng)期的細(xì)胞個(gè)數(shù)作為最優(yōu)細(xì)胞接種密度，本發(fā)明中CHO細(xì)胞的最佳接種密度為10000個(gè)/孔。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于乳酸脫氫酶測(cè)定的電子煙煙液細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)方法，其特征在于:細(xì)胞裂解液使用時(shí)其終濃度為1%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于乳酸脫氫酶測(cè)定的電子煙煙液細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)方法，其特征在于:LDH基質(zhì)液的反 應(yīng)時(shí)間為15min。
【文檔編號(hào)】G01N33/00GK103808906SQ201410094851
【公開(kāi)日】2014年5月21日 申請(qǐng)日期:2014年3月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月16日
【發(fā)明者】陳歡, 楊進(jìn), 劉洋, 劉彤, 韓書(shū)磊, 吳帥賓, 付立偉, 侯宏衛(wèi), 胡清源 申請(qǐng)人:國(guó)家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心