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用于肺癌早中期快速診斷試劑盒及其檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種用于肺癌早中期快速診斷試劑盒，所述捕獲抗體包括半乳糖凝集素、細(xì)胞角質(zhì)素片段抗原21-1和人類天冬胺酰基β－羥化酶分別制得的單克隆抗體；所述試劑盒還包括檢測(cè)抗體，所述檢測(cè)抗體包括半乳糖凝集素、細(xì)胞角質(zhì)素片段抗原21-1和人類天冬胺?；拢u化酶分別制得的HRP標(biāo)記后的多克隆抗體。本發(fā)明的有益效果如下：具有靈敏度高準(zhǔn)確性強(qiáng)的特點(diǎn)，其靈敏度及準(zhǔn)確性均達(dá)到90%以上，另外可以有效降低檢測(cè)成本、減少操作步驟和降低檢測(cè)誤差。
【專利說(shuō)明】用于肺癌早中期快速診斷試劑盒及其檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】:
[0001]本發(fā)明涉及癌癥診斷檢測(cè)用的試劑盒領(lǐng)域，具體為一種用于肺癌早中期快速診斷試劑盒及其檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】:
[0002]肺癌是全球范圍內(nèi)死亡率最高的癌癥。這種癌癥治療困難，轉(zhuǎn)移的肺癌尤其難治。大約有75%的肺癌患者在確診時(shí)已經(jīng)為轉(zhuǎn)移性或晚期，其5年生存率僅為6%。過(guò)去數(shù)十年來(lái)，雖然化療、放療和手術(shù)等治療措施有了快速的發(fā)展，但肺癌的5年生存率仍然較低。主要是因?yàn)檫€沒(méi)有一種安全的方法可以對(duì)其進(jìn)行篩選，在疾病的早期——治療的最佳時(shí)機(jī)，就及時(shí)發(fā)現(xiàn)患者罹患肺癌的可能性微乎其微。
[0003]目前迫切需要一種有效的篩選策略。當(dāng)CT掃描不清楚，血液測(cè)試能幫助醫(yī)生做出更好的判斷。對(duì)無(wú)癥狀患者采用CT掃描進(jìn)行篩選，既昂貴又危險(xiǎn)。這種篩選有很高的假陽(yáng)性，其中一些患者將接受不必要的肺部活組織檢查。
[0004]腫瘤標(biāo)志物(tumor markers,TM)是指在腫瘤發(fā)生和增殖過(guò)程中，由腫瘤細(xì)胞本身合成、釋放，或由機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞反應(yīng)而產(chǎn)生的標(biāo)志腫瘤存在和生長(zhǎng)的一類物質(zhì)。這些物質(zhì)在正常成人中不存在或者是在癌癥患者中出現(xiàn)的水平顯著高于正常人。目前腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)技術(shù)被認(rèn)為是早期發(fā)現(xiàn)無(wú)癥狀微灶腫瘤的唯一途徑，這一檢測(cè)技術(shù)可先于X光片、超聲、CT、MRI或PET-CT等物理檢查發(fā)現(xiàn)腫瘤?？捎糜诟呶Ｈ巳簮盒阅[瘤的篩查，腫瘤診斷與鑒別診斷，評(píng)估治療的效果，預(yù)測(cè)或監(jiān)視腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移。目前，醫(yī)院出現(xiàn)的肺癌診斷試劑盒都是檢測(cè)一些常見(jiàn)的腫瘤標(biāo)記物，靈敏性及準(zhǔn)確性都偏低。因主要是選定的腫瘤標(biāo)記物單項(xiàng)檢測(cè)往往有很大的局限性，難以滿足早期快速診斷的要求。
[0005]目前，市場(chǎng)上還沒(méi)有針對(duì)肺癌的快速高效診斷試劑盒問(wèn)世，嚴(yán)重影響到肺癌早期發(fā)現(xiàn)及治療。

【發(fā)明內(nèi)容】
:
[0006]本發(fā)明的目的是針對(duì)以上述現(xiàn)有肺癌診斷存在的不足，提供一種靈敏度高、準(zhǔn)確性強(qiáng)且使用方便高效的用于肺癌早中期快速診斷試劑盒。
[0007]本發(fā)明另一目的是提供一種用于肺癌早中期快速診斷試劑盒的檢測(cè)方法。
[0008]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:用于肺癌早中期快速診斷試劑盒，包括捕獲抗體，所述捕獲抗體包括半乳糖凝集素和細(xì)胞角質(zhì)素片段抗原21-1(CYFRA21-1)分別制得的單克隆抗體。
[0009]所述捕獲抗體還包括人類天冬胺?；?—羥化酶(HAAH)制得的單克隆抗體。
[0010]所述試劑盒還包括檢測(cè)抗體，所述檢測(cè)抗體包括半乳糖凝集素、細(xì)胞角質(zhì)素片段抗原21-1(CYFRA21-1)和人類天冬胺?；?—羥化酶(HAAH)分別制得的HRP標(biāo)記后的多克隆抗體。
[0011]所述捕獲抗體為將半乳糖凝集素、細(xì)胞角質(zhì)素片段抗原21-1(CYFRA21-1)和人類天冬胺酰基β —羥化酶(HAAH)克隆到真核表達(dá)載體，并在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)蛋白的表達(dá)，純化后得到相應(yīng)的抗原，將所述抗原免疫哺乳動(dòng)物得到的相應(yīng)單克隆抗體。
[0012]所述捕獲抗體的制備方法包括的步驟如下:
[0013](I)抗原的制備:把半乳糖凝集素、細(xì)胞角質(zhì)素片段抗原21-1及人類天冬胺?；?—羥化酶的基因克隆到真核表達(dá)載體，并在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)蛋白的表達(dá)，純化后得到抗原，此抗原也可作為標(biāo)準(zhǔn)品用；
[0014](2)捕獲抗體的制備:將上述抗原免疫哺乳動(dòng)物，得到相應(yīng)的單克隆抗體為捕獲抗體。
[0015]所述檢測(cè)抗體為將半乳糖凝集素、細(xì)胞角質(zhì)素片段抗原21-1 (CYFRA21-1)和人類天冬胺?；?—羥化酶(HAAH)克隆到真核表達(dá)載體，并在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)蛋白的表達(dá)，純化后得到相應(yīng)的抗原，將所述抗原免疫哺乳動(dòng)物得到的相應(yīng)多克隆抗體，對(duì)所述多克隆抗體進(jìn)行HRP標(biāo)記。
[0016]所述檢測(cè)抗體的制備方法包括的步驟如下:
[0017](I)抗原的制備:把半乳糖凝集素、細(xì)胞角質(zhì)素片段抗原21-1及人類天冬胺?；?—羥化酶的基因克隆到真核表達(dá)載體，并在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)蛋白的表達(dá)，純化后得到抗原，此抗原也可作為標(biāo)準(zhǔn)品用；
[0018](2)檢測(cè)抗體的制備:將上述抗原免疫哺乳動(dòng)物，得到相應(yīng)的多克隆抗體為檢測(cè)抗體；
[0019](3) HRP標(biāo)記:對(duì)所述多克隆抗體進(jìn)行HRP標(biāo)記。
[0020]所述半乳糖凝集素優(yōu)選半乳糖凝集素-3和半乳糖凝集素_8。
[0021]所述捕獲抗體預(yù)先包被于微量滴定板的孔內(nèi)，可以簡(jiǎn)化步驟，提高檢測(cè)效率。
[0022]用于肺癌早中期快速診斷試劑盒的制備方法，其包括以下步驟:
[0023](I)抗原的制備:將半乳糖凝集素、細(xì)胞角質(zhì)素片段抗原21-1及人類天冬胺?；?—羥化酶的基因克隆到真核表達(dá)載體，并在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)蛋白的表達(dá)，純化后得到所需的抗原，其中，所述抗原也可作為標(biāo)準(zhǔn)品用。
[0024](2)捕獲抗體的制備:將上述抗原免疫哺乳動(dòng)物得到相應(yīng)的單克隆抗體，所述單克隆抗體作為本試劑盒的捕獲抗體。
[0025](3)檢測(cè)抗體的制備:將上述抗原免疫哺乳動(dòng)物得到相應(yīng)的多克隆抗體，對(duì)所述多克隆抗體進(jìn)行HRP標(biāo)記。本發(fā)明檢測(cè)抗體具有標(biāo)記功能，可以省去標(biāo)記抗體以及添加標(biāo)記抗體的操作步驟，有效的節(jié)約成本，減少操作步驟，降低檢測(cè)誤差。
[0026](4)捕獲抗體包被:
[0027]①.用碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液(ρΗ9.6)將濃度為I μ g/ml的捕獲抗體包被微量滴定板的孔；②.封蓋微量滴定板并在4°C下孵育過(guò)夜；③.棄去包被液(碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液稀釋的捕獲抗體)，并用洗滌液洗滌微量滴定板兩次，每次在微孔中加入200 μ IPBST (磷酸鹽吐溫緩沖液)，在水槽上方輕輕甩動(dòng)微量滴定板，除去洗滌液，在紙巾上輕拍微量滴定板，除去剩余的液滴，晾干放于4°C環(huán)境中備用。
[0028](5)封閉:每孔添加200 μ I封閉緩沖液(1.2% BSA/PBS)，封閉包被孔中剩余的蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)。
[0029]用于肺癌早中期快速診斷試劑盒的檢測(cè)方法，其包括以下步驟:[0030](I)抗原的制備:將Galectin-3，HAAH及CYFRA21-1基因克隆到真核表達(dá)載體，并在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)蛋白的表達(dá)，純化后得到所需的抗原；
[0031](2)捕獲抗體的制備:將上述抗原免疫哺乳動(dòng)物得到相應(yīng)的單克隆抗體，所述單克隆抗體作為本試劑盒的捕獲抗體；
[0032](3)檢測(cè)抗體的制備:將上述抗原免疫哺乳動(dòng)物得到相應(yīng)的多克隆抗體，對(duì)所述多克隆抗體進(jìn)行HRP標(biāo)記；
[0033](4)捕獲抗體包被:
[0034]①.用碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液(pH9.6)將濃度為I μ g/ml的捕獲抗體包被微量滴定板的孔；
[0035]②.封蓋微量滴定板并在4°C下孵育過(guò)夜；
[0036]③.棄去包被液(碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液稀釋的捕獲抗體)，并用洗滌液洗滌微量滴定板兩次，每次在微孔中加入200 μ I PBST (磷酸鹽吐溫緩沖液)，在水槽上方輕輕甩動(dòng)微量滴定板，除去洗滌液，在紙巾上輕拍微量滴定板，除去剩余的液滴，晾干放于4°C環(huán)境中備用。
[0037](5)封閉
[0038]①.在微量滴定板的每個(gè)孔添加200 μ I封閉緩沖液(1.2% BSA/PBS)，封閉包被孔中剩余的蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)；
[0039]②.封蓋微量滴定板并在37°C孵育I小時(shí)；
[0040](6)加樣
[0041]①.將100μ I的樣品添加到微量滴定板的每個(gè)孔，在37°C下孵育60分鐘；要得到準(zhǔn)確的定量結(jié)果，通常做法是比較未知樣品與標(biāo)準(zhǔn)曲線的信號(hào)。每個(gè)酶標(biāo)板都必須測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品(兩重測(cè)定或三重測(cè)定)和空白樣，以確保準(zhǔn)確性；
[0042]②.棄去樣品，并洗滌微量滴定板三次，每次在微孔中加入200 μ I PBST (磷酸鹽吐溫緩沖液);
[0043]③.將100 μ I濃度為0.5 μ g/ml的檢測(cè)抗體添加到每個(gè)孔；
[0044]④.封蓋微量滴定板并在37°C下孵育I小時(shí)；
[0045]⑤.用PBST洗滌微量滴定板四次；
[0046](7)檢測(cè)
[0047]①.將TMB (3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺)溶液添加到每個(gè)孔，孵育15-30分鐘，添加等體積的終止液，然后在450nm處讀取光密度。
[0048]②.由系列稀釋液得到的數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，濃度標(biāo)在X軸(對(duì)數(shù)標(biāo)度)上，而吸光度標(biāo)在Y軸(線性標(biāo)度)上。通過(guò)內(nèi)插法在此標(biāo)準(zhǔn)曲線上得出樣品濃度。
[0049]本發(fā)明從眾多的腫瘤標(biāo)記物中，通過(guò)各種不同的排列組合，篩選出3個(gè)腫瘤標(biāo)記物(半乳糖凝集素-3，人類天冬胺?；?羥化酶(HAAH)，細(xì)胞角質(zhì)素片段抗原21-KCYFRA21-1)組成肺癌快速診斷試劑盒。其中，人類天冬胺?；?—羥化酶(HumanAsparty 1/AsparaginyI β -hydroxylase, ΗΑΑΗ)是胚胎期即存在于細(xì)胞內(nèi)的一種酶，屬于依賴α-酮戊二酸雙加氧酶家族，可催化特定蛋白中表皮生長(zhǎng)因子(EGF)受體樣結(jié)構(gòu)域的天冬氨酸或天冬酰胺殘基上的β —碳原子羥基化。研究表明HAAH在腫瘤細(xì)胞表面的高表達(dá)，是一種新型惡性腫瘤高特異性的分子標(biāo)記物。最近的研究也證實(shí)HAAH是肺癌的理想標(biāo)記物。半乳糖凝集素_3(Galectin-3)是一種半乳糖結(jié)合蛋白，是Glectin家族中唯一具有嵌合結(jié)構(gòu)的成員。半乳糖凝集素-3 (Galectin-3)廣泛分布于腫瘤組織中，半乳凝素_3的表達(dá)同其腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Galectin-3可與細(xì)胞表面糖基化的CD98結(jié)合促使整合素在細(xì)胞表面聚集成簇，間接增強(qiáng)整合素與其配體的親和力；也能直接結(jié)合整合素α?β?和⑶Ilb / 18，正性或負(fù)性調(diào)節(jié)整合素的活性，影響整合素與細(xì)胞外配體的結(jié)合。Galectin-3還可以增加整合素在細(xì)胞表面的表達(dá)，并促進(jìn)膠原在細(xì)胞間隔的分泌。由于半乳糖凝集素-3對(duì)多聚糖有親和力，它也可以直接結(jié)合糖基化的細(xì)胞外基質(zhì)成分，介導(dǎo)細(xì)胞與基質(zhì)的黏附。研究顯示肺癌患者血清中Galectin-3水平明顯超過(guò)健康人群。細(xì)胞角質(zhì)素片段抗原21-1(CYFRA21-1)是細(xì)胞角蛋白19 (CYK-19)的可溶性片段，CYK-19廣泛分布在正常組織表面，如層狀或鱗狀上皮中。在惡性上皮細(xì)胞中，激活的蛋白酶加速了細(xì)胞的降解，使得大量細(xì)胞角蛋白片段CYFRA21-1釋放入血，在惡性肺癌組織中，CYFRA21-1含量豐富，尤其是在肺鱗癌中有高表達(dá)。
[0050]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果如下:具有靈敏度高準(zhǔn)確性強(qiáng)的特點(diǎn)，其靈敏度及準(zhǔn)確性均達(dá)到90%以上，另外可以有效降低檢測(cè)成本、減少操作步驟和降低檢測(cè)誤差。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0051]圖1是本發(fā)明用于肺癌早中期快速診斷試劑盒的原理圖；
[0052]圖2是本發(fā)明用于肺癌早中期快速診斷試劑盒的檢測(cè)抗體最佳工作濃度的選擇對(duì)比圖；
[0053]圖3是本發(fā)明用于肺癌早中期快速診斷試劑盒在肺癌治療前后血中檢測(cè)到Galectin-3的變化對(duì) 比圖；
[0054]圖4是本發(fā)明用于肺癌早中期快速診斷試劑盒在肺癌治療前后血中檢測(cè)到CYFRA21-1的變化對(duì)比圖；
[0055]圖5是本發(fā)明用于肺癌早中期快速診斷試劑盒在肺癌治療前后血中檢測(cè)到HAAH的變化對(duì)比圖。
【具體實(shí)施方式】
[0056]以下結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明用于肺癌早中期快速診斷試劑盒進(jìn)行詳細(xì)的描述說(shuō)明。
[0057]用于肺癌早中期快速診斷試劑盒，包括捕獲抗體，捕獲抗體封閉緩沖液，標(biāo)準(zhǔn)品，標(biāo)記HRP的檢測(cè)抗體，洗滌液及顯色液等。所述捕獲抗體包括半乳糖凝集素和細(xì)胞角質(zhì)素片段抗原21-1(CYFRA21-1)分別制得的單克隆抗體；通過(guò)對(duì)半乳糖凝集素和細(xì)胞角質(zhì)素片段抗原21-1(CYFRA21-1)的共同快速檢測(cè)，可以有效的提高檢測(cè)準(zhǔn)確率和靈敏度，有效的克服單憑檢測(cè)CYFRA21-1導(dǎo)致的不足。
[0058]所述捕獲抗體還包括人類天冬胺?；?—羥化酶(HAAH)制得的單克隆抗體，通過(guò)檢測(cè)半乳糖凝集素、細(xì)胞角質(zhì)素片段抗原21-1(CYFRA21-1)以及人類天冬胺酰基β —羥化酶(HAAH)，使其靈敏度及準(zhǔn)確性均達(dá)到90%以上。
[0059]所述捕獲抗體為將半乳糖凝集素、細(xì)胞角質(zhì)素片段抗原21-1 (CYFRA21-1)和人類天冬胺酰基β —羥化酶(HAAH)克隆到真核表達(dá)載體，并在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)蛋白的表達(dá)，純化后得到相應(yīng)的抗原，將所述抗原免疫哺乳動(dòng)物得到的相應(yīng)單克隆抗體。
[0060]所述捕獲抗體的制備方法包括的步驟如下:
[0061](I)抗原的制備:通過(guò)分子克隆的方法把Galectin-3，HAAH及CYFRA21-1基因克隆到真核表達(dá)載體，并在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)蛋白的表達(dá)，純化后得到抗原，此抗原也可作為標(biāo)準(zhǔn)品用；所述抗原的制備也可以使用現(xiàn)有常規(guī)方法制備，在此不再累贅。
[0062](2)捕獲抗體的制備:將上述抗原免疫哺乳動(dòng)物，得到相應(yīng)的單克隆抗體為捕獲抗體。所述哺乳動(dòng)物是小鼠及兔子，優(yōu)選小鼠。所述捕獲抗體的制備也可以使用現(xiàn)有常規(guī)方法制備，在此不再累贅。
[0063]所述檢測(cè)抗體包括半乳糖凝集素、細(xì)胞角質(zhì)素片段抗原21-1 (CYFRA21-1)和人類天冬胺酰基β —羥化酶(HAAH)分別制得的HRP標(biāo)記后的多克隆抗體。
[0064]所述檢測(cè)抗體為將半乳糖凝集素、細(xì)胞角質(zhì)素片段抗原21-1 (CYFRA21-1)和人類天冬胺?；?—羥化酶(HAAH)克隆到真核表達(dá)載體，并在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)蛋白的表達(dá)，純化后得到相應(yīng)的抗原，將所述抗原免疫哺乳動(dòng)物得到的進(jìn)行HRP標(biāo)記后的多克隆抗體。所述檢測(cè)抗體的制備方法包括的步驟如下:
[0065](I)抗原的制備:通過(guò)分子克隆的方法把半乳糖凝集素、細(xì)胞角質(zhì)素片段抗原21-1及人類天冬胺酰基β —羥化酶的基因克隆到真核表達(dá)載體，并在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)蛋白的表達(dá)，純化后得到抗原，此抗原也可作為標(biāo)準(zhǔn)品用；
[0066](2)檢測(cè)抗體的制備:將上述抗原免疫哺乳動(dòng)物，得到相應(yīng)多克隆抗體；
[0067](3) HRP標(biāo)記:對(duì)所述多克隆抗體進(jìn)行HRP標(biāo)記。
[0068]所述哺乳動(dòng)物是小鼠及兔子，優(yōu)選兔子。對(duì)所述多克隆抗體進(jìn)行HRP標(biāo)記可以使用目前常規(guī)的現(xiàn)有方法。
[0069]其中，所述半乳糖凝集素優(yōu)選半乳糖凝集素-3或者半乳糖凝集素-8 ;所述細(xì)胞角質(zhì)素片段抗原21_1優(yōu)選血清細(xì)胞角質(zhì)素片段抗原21_1。
[0070]其中，所述捕獲抗體可以預(yù)先包被于PVC材質(zhì)的微量滴定板的孔內(nèi)，可以簡(jiǎn)化步驟，提高檢測(cè)效率。
[0071]用于肺癌早中期快速診斷試劑盒的制備方法，其包括以下步驟:
[0072](I)抗原的制備:通過(guò)分子克隆的方法將Galectin-3，HAAH及CYFRA21-1基因克隆到真核表達(dá)載體，并在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)蛋白的表達(dá)，純化后得到所需的抗原，其中，所述抗原也可作為標(biāo)準(zhǔn)品用；
[0073](2)捕獲抗體的制備:將上述抗原免疫哺乳動(dòng)物得到相應(yīng)的單克隆抗體，所述單克隆抗體作為本試劑盒的捕獲抗體；
[0074](3)檢測(cè)抗體的制備:將上述抗原免疫哺乳動(dòng)物得到相應(yīng)的多克隆抗體，對(duì)所述多克隆抗體進(jìn)行HRP標(biāo)記；所述檢測(cè)抗體具有標(biāo)記功能,可以省去標(biāo)記抗體以及添加標(biāo)記抗體的操作步驟，有效的節(jié)約成本，減少操作步驟，降低檢測(cè)誤差。
[0075](4)捕獲抗體包被:
[0076]①.用碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液(pH9.6)將濃度為I μ g/ml的捕獲抗體包被于微量滴定板的孔；
[0077]②.用粘合塑料制品封蓋微量滴定板并在4°C下孵育過(guò)夜；
[0078]③.棄去包被液(碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液稀釋的捕獲抗體)，并用洗滌液洗滌微量滴定板兩次，每次在微孔中加入200 μ I PBST (磷酸鹽吐溫緩沖液)，在水槽上方輕輕甩動(dòng)微量滴定板，除去洗滌液，在紙巾上輕拍微量滴定板，除去剩余的液滴，晾干放于4°C環(huán)境中備用；所述洗滌液為PBS (磷酸鹽緩沖液)中加入一定量的TWeen20，所述Tween20的質(zhì)量百分比濃度為0.05% ；
[0079](5)封閉
[0080]①.在微量滴定板的每孔添加200 μ I封閉緩沖液(為含1.2% BSA (牛血清白蛋白)的PBS (磷酸鹽緩沖液))，用于封閉包被孔中剩余的蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)；
[0081]②.封蓋微量滴定板并在37°C孵育I小時(shí)。
[0082]用于肺癌早中期快速診斷試劑盒的檢測(cè)方法，其包括以下步驟:
[0083](I)抗原的制備:通過(guò)分子克隆的方法將Galectin-3，HAAH及CYFRA21-1基因克隆到真核表達(dá)載體，并在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)蛋白的表達(dá)，純化后得到所需的抗原，其中，所述抗原也可作為標(biāo)準(zhǔn)品用；
[0084](2)捕獲抗體的制備:將上述抗原免疫哺乳動(dòng)物得到相應(yīng)的單克隆抗體，所述單克隆抗體作為本試劑盒的捕獲抗體；
[0085](3)檢測(cè)抗體的制備:將上述抗原免疫哺乳動(dòng)物得到相應(yīng)的多克隆抗體，對(duì)所述多克隆抗體進(jìn)行HRP標(biāo)記；
[0086](4)捕獲抗體包被:
[0087]①.用碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液(pH9.6)將濃度為I μ g/ml的捕獲抗體包被微量滴定板的孔；
[0088]②.用粘合塑料制品封蓋微量滴定板并在4°C下孵育過(guò)夜；
[0089]③.棄去包被液(碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液稀釋的捕獲抗體)，并用洗滌液洗滌微量滴定板兩次，每次在微孔中加入200 μ I PBST (磷酸鹽吐溫緩沖液，可以是含0.05%吐溫-20的ρΗ7.4的磷酸鹽緩沖液)，在水槽上方輕輕甩動(dòng)微量滴定板，除去洗滌液，在紙巾上輕拍微量滴定板，除去剩余的液滴，晾干放于4°C環(huán)境中備用；所述洗滌液為PBS (磷酸鹽緩沖液)中加入一定量的Tween20，所述Tween20的質(zhì)量百分比濃度為0.05% ；
[0090](5)封閉
[0091]①.在微量滴定板的每個(gè)孔添加200μ I封閉緩沖液(1.2% BSA/PBS)，封閉包被孔中剩余的蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)；
[0092]②.用粘合塑料制品封蓋微量滴定板并在37°C孵育I小時(shí)；
[0093](6)加樣
[0094]①.將100 μ I適當(dāng)稀釋(稀釋20倍)的樣品添加到微量滴定板的每個(gè)孔，在37°C下孵育60分鐘；要得到準(zhǔn)確的定量結(jié)果，通常做法是比較未知樣品與標(biāo)準(zhǔn)曲線的信號(hào)。每個(gè)酶標(biāo)板都必須測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品(兩重測(cè)定或三重測(cè)定)和空白樣，以確保準(zhǔn)確性；
[0095]②.棄去樣品，并洗滌微量滴定板三次，每次在微孔中加入200 μ I PBST (磷酸鹽吐溫緩沖液);
[0096]③.將100 μ I濃度為0.5 μ g/ml的檢測(cè)抗體添加到每個(gè)孔；
[0097]④.用粘合塑料制品封蓋微量滴定板并在37°C下孵育I小時(shí)；
[0098]⑤.用PBST洗滌微量滴定板四次；
[0099](7)檢測(cè)[0100]①.將TMB(3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺)溶液添加到每個(gè)孔，孵育15_30分鐘，添加等體積的終止液(2M H2SO4),然后用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在450nm處讀取光密度。
[0101]②.由系列稀釋液得到的數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，濃度標(biāo)在X軸(對(duì)數(shù)標(biāo)度)上，而吸光度標(biāo)在Y軸(線性標(biāo)度)上。通過(guò)內(nèi)插法在此標(biāo)準(zhǔn)曲線上得出樣品濃度。
[0102]本發(fā)明用于肺癌早中期快速診斷試劑盒包括半乳糖凝集素-3(Galectin-3)，人類天冬胺?；u化酶(HAAH)，CYFRA21-1三項(xiàng)指標(biāo)中的兩項(xiàng)同時(shí)升高作為診斷早中期乳腺癌的標(biāo)準(zhǔn)，檢測(cè)原理如圖1所示；半乳糖凝集素-3(Galectin-3)，人類天冬胺?；?羥化酶(HAAH)，CYFRA21-1三項(xiàng)指標(biāo)中的兩項(xiàng)同時(shí)下降作為肺癌治療效果評(píng)估的標(biāo)準(zhǔn)?？梢杂糜谂R床上通過(guò)檢測(cè)血中3個(gè)腫瘤標(biāo)記物水平的高低對(duì)肺癌的治療效果進(jìn)行動(dòng)態(tài)評(píng)估；另外還可以用于臨床上對(duì)肺癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及預(yù)后判斷的應(yīng)用。
[0103]試驗(yàn)效果說(shuō)明
[0104]雙抗體夾心ELISA最佳實(shí)驗(yàn)條件的選擇
[0105]包被鼠抗人Galectin-3，HAAH及CYFRA21-1單抗最佳工作濃度的選擇:根據(jù)方陣法確定包被濃度為lug/mL時(shí),單克隆抗體的OD值為1.03,所以其最佳包被濃度為lug/mL。如圖2所示，兔抗人Galectin-3，HAAH及CYFRA21-1多抗最佳工作濃度的選擇:隨著檢測(cè)抗體稀釋倍數(shù)的增加，待測(cè)肺癌病例血清和正常人血清OD值有遞減的趨勢(shì)，當(dāng)抗體濃度為1:200時(shí)，陽(yáng)性對(duì)照(陽(yáng)性對(duì)照OD值減去空白對(duì)照OD值)與正常對(duì)照(正常對(duì)照OD值減去空白對(duì)照OD值)A450nm之比(簡(jiǎn)稱P / N值)較高，故選擇兔抗人抗體最佳工作濃度為1:200。血清摸索的最佳工作濃度為1:25。封閉液摸索最佳工作溶度為1.2% BSA。
[0106]臨床血清標(biāo)本檢測(cè)
[0107]共檢測(cè)了 400份血`清標(biāo)本，以醫(yī)院經(jīng)確診為肺癌1-1I期患者血清為陽(yáng)性對(duì)照組(110例)，其他良性病患者和正常人群血清為陰性對(duì)照組(290例(正常170例，良性病120例))，PBST為空白對(duì)照，通過(guò)上述雙抗夾心ELISA法進(jìn)行定性及定量檢測(cè)臨床血清標(biāo)本。如下表所示:
【權(quán)利要求】
1.用于肺癌早中期快速診斷試劑盒，包括捕獲抗體，其特征在于，所述捕獲抗體包括半乳糖凝集素和細(xì)胞角質(zhì)素片段抗原21-1分別制得的單克隆抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于肺癌早中期快速診斷試劑盒，其特征在于，所述捕獲抗體還包括人類天冬胺?；?—羥化酶制得的單克隆抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于肺癌早中期快速診斷試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括檢測(cè)抗體，所述檢測(cè)抗體包括半乳糖凝集素、細(xì)胞角質(zhì)素片段抗原21-1和人類天冬胺?；?—羥化酶分別制得的HRP標(biāo)記后的多克隆抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于肺癌早中期快速診斷試劑盒，其特征在于，所述捕獲抗體的制備方法包括的步驟如下: (1)抗原的制備:把半乳糖凝集素、細(xì)胞角質(zhì)素片段抗原21-1及人類天冬胺?；?羥化酶的基因克隆到真核表達(dá)載體，并在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)蛋白的表達(dá)，純化后得到抗原； (2)捕獲抗體的制備:將上述抗原免疫哺乳動(dòng)物，得到相應(yīng)的單克隆抗體為捕獲抗體。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于肺癌早中期快速診斷試劑盒，其特征在于，所述檢測(cè)抗體的制備方法包括的步驟如下: (1)抗原的制備:把半乳糖凝集素、細(xì)胞角質(zhì)素片段抗原21-1及人類天冬胺?；?羥化酶的基因克隆到真核表達(dá)載體，并在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)蛋白的表達(dá)，純化后得到抗原； (2)檢測(cè)抗體的制備:將上述抗原免疫哺乳動(dòng)物，得到相應(yīng)的多克隆抗體為檢測(cè)抗體；` (3)HRP標(biāo)記:對(duì)所述多克隆抗體進(jìn)行HRP標(biāo)記。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一所述的用于肺癌早中期快速診斷試劑盒，其特征在于，所述半乳糖凝集素是半乳糖凝集素_3。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用于肺癌早中期快速診斷試劑盒，其特征在于，所述捕獲抗體預(yù)先包被于微量滴定板的孔內(nèi)。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用于肺癌早中期快速診斷試劑盒的制備方法，其特征于，其包括以下步驟: (1)抗原的制備:將半乳糖凝集素、細(xì)胞角質(zhì)素片段抗原21-1及人類天冬胺?；?羥化酶的基因克隆到真核表達(dá)載體，并在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)蛋白的表達(dá)，純化后得到所需的抗原； (2)捕獲抗體的制備:將上述抗原免疫哺乳動(dòng)物得到相應(yīng)的單克隆抗體； (3)檢測(cè)抗體的制備:將上述抗原免疫哺乳動(dòng)物得到相應(yīng)的多克隆抗體，對(duì)所述多克隆抗體進(jìn)行HRP標(biāo)記； (4)捕獲抗體包被: ①.用碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液將濃度為I μ g/ml的捕獲抗體包被微量滴定板的孔；②.封蓋微量滴定板并在4°C下孵育過(guò)夜；③.棄去包被液，并用洗滌液洗滌微量滴定板兩次，每次在微孔中加入200 μ I PBST，除去洗滌液和剩余的液滴，晾干放于4°C環(huán)境中； (5)封閉:每孔添加200μ I封閉緩沖液，封閉包被孔中剩余的蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用于肺癌早中期快速診斷試劑盒的檢測(cè)方法，其特征于，包括以下步驟:(1)抗原的制備:將半乳糖凝集素、細(xì)胞角質(zhì)素片段抗原21-1及人類天冬胺?；?羥化酶的基因克隆到真核表達(dá)載體，并在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)蛋白的表達(dá)，純化后得到所需的抗原； (2)捕獲抗體的制備:將上述抗原免疫哺乳動(dòng)物得到相應(yīng)的單克隆抗體； (3)檢測(cè)抗體的制備:將上述抗原免疫哺乳動(dòng)物得到相應(yīng)的多克隆抗體，對(duì)所述多克隆抗體進(jìn)行HRP標(biāo)記； (4)捕獲抗體包被: ①.用碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液將濃度為Iμ g/ml的捕獲抗體包被微量滴定板的孔； ②.封蓋微量滴定板并在4°C下孵育過(guò)夜； ③.棄去包被液，并用洗滌液洗滌微量滴定板兩次，每次在微孔中加入200μ I PBST,除去洗滌液和剩余的液滴，晾干放于4°C環(huán)境中； (5 )封閉 ①.在微量滴定板的每個(gè)孔添加200μI封閉緩沖液，封閉包被孔中剩余的蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)； ②.封蓋微量滴定板并在37°C孵育I小時(shí)； (6)加樣 ①.將100μ I的樣品添加到微量滴定板的每個(gè)孔，在37°C下孵育60分鐘； ②.棄去樣品，并洗滌微量滴定板`三次，每次在微孔中加入200μ I PBST ； ③.將100μ I濃度為0.5 μ g/ml的檢測(cè)抗體添加到每個(gè)孔； ④.封蓋微量滴定板并在37°C下孵育I小時(shí)； ⑤.用PBST洗滌微量滴定板四次； (7)檢測(cè) ①.將TMB溶液添加到每個(gè)孔，孵育15-30分鐘，添加等體積的終止液，然后在450nm處讀取光密度。
【文檔編號(hào)】G01N33/577GK103823066SQ201410093875
【公開(kāi)日】2014年5月28日 申請(qǐng)日期:2014年3月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月13日
【發(fā)明者】余躍飛 申請(qǐng)人:廣州恒泰生物科技有限公司