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專利名稱：一種Micro RNA表達檢測方法及其定量檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種Micro RNA表達檢測方法及其定量檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
Micro RNA是近年來在多種真核細胞及病毒中發(fā)現(xiàn)的一類來源內(nèi)源性染色體上的非編碼單鏈RNA，長度為21 25nt的短序列，在進化上具有高度的保守性，能夠通過與靶mRNA特異性的堿基互補配對，引起靶mRNA降解或者抑制其翻譯，從而對基因進行轉(zhuǎn)錄后的表達調(diào)控(O'Donnell KA, Wentzel EA, Zeller KI, et al.e-Myc-regulated microRNAsmodulate E2F1 expression [J].Nature, 2005, 4 (7043): 839.) 由于 Micro RNA 序列在不同的生物中具有一定的保守性，目前普遍認為Micro RNA的功能是參與生命的一些基本過程，如發(fā)育過程中的細胞增殖、細胞死亡、應(yīng)激反應(yīng)和脂肪代謝等，越來越多的證據(jù)表明Micro RNA在細胞中起著調(diào)控基因表達的重要作用。最近的研究發(fā)現(xiàn)Micro RNA與細胞的癌變有著極為密切的關(guān)系，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Micro RNA與肺癌、結(jié)直腸腫瘤、伯基特淋巴瘤和慢性淋巴細胞白血病等腫瘤疾病有關(guān)(M eltzer PS.Cancer genemics:Small RNAs with bigimpacts[J].Nature, 2005, 435(7043):745.)。由于Micro RNA分子只有20_25nt左右大小，檢測較為困難。以前主要采用的方法是Northern blot等雜交的方法進行檢測,方法繁瑣,不易成功,且Micro RNA極易降解，對于結(jié)果影響也較大。為了克服之前檢測方法的缺陷，Allawi等建立了 Invader Assay的方法(AllawiHT, Deahlberg JE, OlsonS, et al.Quantitation of Micro RNAs using a modifiedInvader assay.RNA, 2004, 10:1153-1161), Liu 等建立了寡核苷酸芯片方法(Liu C, CalmnGA, et al.An oligo nucleotide microchipfor genome-wide micro RNA profiling inhuman and mouse tissues.PNAS, 2004,101 (26):9740-9744),這種方法提高了檢測的敏感性及實用性，但這種方法需要熒光標記和熒光儀或芯片檢測儀，而且由于micro RNA分子太小，應(yīng)用也受到一定的限制。如今,對Micro RNA前體的檢測主要是采用RT-PCR的方法(Schmittgen TD, JiangJ, Liu Q, et al.A high-throughput method to monitor the expression of Micro RNAprecursors.Nucleic Acids Research.2004,32(4):e43),米用隨機引物或與 Micro RNA前體互補的引物直接進行反轉(zhuǎn)錄，但是這僅僅只能針對特異的Micro RNA，而且半定量的方法不能準確地表現(xiàn)出Micro RNA的表達量，所以該方法已經(jīng)漸漸退出了 Micro RNA分子的檢測的行列。上述方法在反轉(zhuǎn)錄Micro RNA時都顯得過于繁瑣且效率不高，于是出現(xiàn)了一種“加尾法”，即在Micro RNA的3’末端進行延長并采用real-time PCR的方法對Micro RNA進行檢測。常見的加尾法有兩種:一種是通過末端轉(zhuǎn)移酶在Micro RNA分子的3'末端加上Poly-A尾巴(Shi R, Chiang V L.Facile means for quantifying Micro RNA expressionby real-time PCR[J].BioTechniques, 2005，39 (4): 519-525.)，用 30 40 個核苷酸的Oligo-dT作為引物進行反轉(zhuǎn)錄得到被延長的cDNA，可以使用SYBR Green進行實時定量PCR檢測；另一種是直接使用與Micro RNA末端配對的加長引物反轉(zhuǎn)錄成cDNA，而后使用LNA修飾的引物通過Real-time PCR法對Micro RNA的表達情況進行檢測(RaymondC K, Roberts B S, Garrett—engele P.et al, Simple quantitative primer—extensionPCR for direct monitoring of Micro RNA and short-1nterfering RNAs[J].RNA, 2005.11(11):1737-1744.)。然而這兩種方法中，隨機加尾法合成出來的cDNA對于PCR而言相對過短，只適合使用探針的taq man法檢測,而加特異性micro RNA末端配對尾部的方法，只能合成Micro RNA特異性的cDNA,無法與內(nèi)參同時反轉(zhuǎn),可能造成較大的誤差。為了更高效地檢測Micro RNA的表達量，并提高準確性，Chen等(Chen C，RidzonD A, Broomer A J, et al.Realtime quantification of micro RNAs by stem-loopRT-PCR[J].Nucleic Acids Res, 2005，33(20): 179.)在特異性 micro RNA 末端配對的加長引物反轉(zhuǎn)錄的基礎(chǔ)上，將r eal time PCR技術(shù)引入到micro RNA的檢測當中，建立了名為莖環(huán)的反轉(zhuǎn)錄定量PCR技術(shù)(stem-loop RT-PCR)0他首先設(shè)計了一個具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的反轉(zhuǎn)錄的探針，然后采用Taq man的探針技術(shù)，對Micro RNA進行檢測，據(jù)報道這種結(jié)構(gòu)大大提高了 Micro RNA反轉(zhuǎn)錄的效率和特異性。但是這樣高特異性的同時也導(dǎo)致了一次反轉(zhuǎn)只能反轉(zhuǎn)錄出特異的一條Micro RNA，對于檢測整體的Micro RNA及其他小片段RNA的表達狀況來說是一種極大的制約，同時使用Taqman探針的方法也大大提高了 Micro RNA的檢測成本。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題就是針對Micro RNA分子表達檢測較為困難，現(xiàn)有的檢測方法步驟繁瑣、不易成功，并且所得Micro RNA極易降解，對結(jié)果有較大影響的缺陷，提供一種Micro RNA表達檢測方法以及一種Micro RNA定量檢測試劑盒。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采取的技術(shù)方案之一是:一種Micro RNA表達檢測方法，其中所述方法包括:(I)提取樣品的Micro RNA,將所得Micro RNA連接PolyA尾巴；(2)將三條具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的引物混合后進行退火處理，所述具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的引物的序列分別如序列表中SEQ ID NO: 1、SEQ ID N0:2和SEQ IDN0:3所示;(3)將步驟(I)所得連有Poly A尾巴的Micro RNA與步驟(2)所得具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的引物退火連接；(4)以步驟(3)所得Micro RNA為模板反轉(zhuǎn)錄得到cDNA ；(5)以步驟(4)所得cDNA為模板，加入擴增目標Micro RNA的引物，通過熒光定量PCR方法檢測目標Micro RNA的表達。其中步驟(I)所述提取樣品Micro RNA的方法為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。所述樣品Micro RNA的提取可以利用各種市售試劑盒進行。所述Micro RNA連接PolyA尾巴的方法為本領(lǐng)域常規(guī)使用的加尾方法，本發(fā)明所述加Poly A尾巴的方法較佳地包括:加入Poly A聚合酶，加入ATP溶液，將該混合液35 37°C反應(yīng)10 15min即得。其中步驟(2)所述的三條具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的引物為本領(lǐng)域常規(guī)引物。所述的三條具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的引物的序列較佳地分別如序列表中SEQ ID NO: 1、SEQ ID N0:2和SEQ IDNO:3所示。其中所述具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的引物的制備方法為本領(lǐng)域常規(guī)的制備方法，本發(fā)明所述具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的弓I物較佳地為通過人工全序列合成即得。其中步驟(2)所述退火處理為本領(lǐng)域常規(guī)的退火處理技術(shù)。本發(fā)明所述退火處理的程序較佳地為:(1)95°C反應(yīng)2min，(2)每5 10秒下降0.1°C，降至35°C 15°C，(3)4°C保存，更佳地為(1)95°C反應(yīng)2min，(2)每8秒下降0.1°C，降至25°C，(3)4°C保存。其中步驟(3)所述退火連接的程序較佳地為:60 70°C，反應(yīng)5 lOmin，即得。其中步驟(4)所述反轉(zhuǎn)錄為本領(lǐng)域常規(guī)反轉(zhuǎn)錄技術(shù)，本發(fā)明所述反轉(zhuǎn)錄的程序較佳地為:(1) 30°C反應(yīng)10 15分鐘；(2) 42 V反應(yīng)50 60分鐘；(3) 50°C反應(yīng)10 15分鐘；
(4)95°C反應(yīng)10 15分鐘；(5)將所得cDNA樣品于4°C保存。其中步驟(5)所述擴增目標Micro RNA的引物為:Micro RNA通用反向引物和Micro RNA檢測正向引物。其中所述Micro RNA通用反向引物為本領(lǐng)域常規(guī)的Micro RNA通用反向引物，本發(fā)明所述Micro RNA通用反向引物序列較佳地為:5’ -CTGCAGTGGCGGACCA-3’，如序列表中SEQ ID NO:4 所示。其中所述Micro RNA檢測正向引物為本領(lǐng)域常規(guī)的Micro RNA檢測正向引物，本發(fā)明所述Micro RNA檢測正向引物較佳地為:Has-MiR_365a檢測正向引物:5’-TAATGCCCCTAAAAATCCTTAT-3’，該引物序列如序列表中SEQ ID NO: 5所示。所述擴增目標Micro RNA的引物的制備方法為本領(lǐng)域常規(guī)制備方法，較佳地為人工全序列合成即得。其中步驟(5)所述熒光定量PCR為本領(lǐng)域常規(guī)使用的熒光定量PCR技術(shù)(或稱為real time PCR技術(shù)，簡稱為 qPCR或者qRT-PCR)。針對不同的目標Micro RNA可采用不同的熒光定量PCR程序進行檢測。本發(fā)明所述熒光定量PCR的程序較佳地為:(I)預(yù)變性95。。，I分鐘;(2)變性95°C，5S ;(3)退火延伸60°C,20S ;步驟(2) (3)共進行40個循環(huán)，每次在延伸階段讀取吸光值。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采取的技術(shù)方案之二是:一種具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的引物，所述具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的引物的序列如序列表中SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 3所
/Jn ο其中所述具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的引物為本領(lǐng)域常規(guī)的具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的引物，本發(fā)明所述具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的引物較佳地為:Oligol:5’ -GTCGGAGAGACTGCAGTGGCGGACCAATTCGCACTCTCTCCGACTTTTTTTTA-3’(如序列表中 SEQID NO:1 所示)；01igo2:5，-GTCGGAGAGACTGCAGTGGCGGACCAATTCGCACTCTCTCCGACTTTTTTTTC-3’(如序列表中 SEQID NO:2 所示)；01igo3:5’ -GTCGGAGAGACTGCAGTGGCGGACCAATTCGCACTCTCTCCGACTTTTTTTTG-3’(如序列表中 SEQID NO:3 所示)。其中所述具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的引物的制備方法為常規(guī)制備方法，本發(fā)明所述具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的引物較佳地為全序列人工合成即得。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采取的技術(shù)方案之三是:一種Micro RNA定量檢測試劑盒，該Micro RNA定量檢測試劑盒包括:SYBR Green I熒光染料、PCR緩沖液、dNTPs溶液、DNA聚合酶、無菌雙蒸水、具有頸環(huán)結(jié)構(gòu)的引物、通用反向引物和Micro RNA檢測正向引物，其中所述具有頸環(huán)結(jié)構(gòu)的引物的序列分別如序列表中SEQ ID NO: K SEQ ID N0:2和SEQID NO:3 所示。
其中所述SYBR Green I熒光染料、PCR緩沖液、dNTPs溶液、DNA聚合酶、無菌雙蒸水均為本領(lǐng)域常規(guī)的市售實驗試劑。其中所述通用反向引物為本領(lǐng)域常規(guī)的通用反向引物。本發(fā)明所述Micro RNA通用反向引物序列較佳地為:5’ -CTGCAGTGGCGGACCA-3’，如序列表中SEQ ID N0:4所示。其中所述Micro RNA檢測正向引物為本領(lǐng)域常規(guī)的Micro RNA檢測正向引物，本發(fā)明所述Micro RNA檢測正向引物較佳地為Has_MiR-365a檢測正向引物:5’ -TAATGCCCCTAAAAATCCTTAT-3’，其序列如序列表中 SEQ IDNO:5 所示。其中所述具有頸環(huán)結(jié)構(gòu)的引物的序列較佳地分別如序列表中SEQ IDNO: USEQ IDN0:2和SEQ ID N0:3所示。其中所述引物的制備方法為本領(lǐng)域常規(guī)制備方法，較佳地為人工合成制備即得。其中所述Micro RNA定量檢測試劑盒，較佳地還包括RNA提取試劑和/或反轉(zhuǎn)錄試劑。其中所述的RNA提取試劑較佳地為:Trizol試劑、RNA酶抑制劑。其中所述的反轉(zhuǎn)錄試劑較佳地為:逆轉(zhuǎn)錄酶(AMV)、AMV緩沖液。其中所述AMV緩沖液較佳地包括:dNTPs、隨機引物、RNA酶抑制劑。所述試劑的制備方法為本領(lǐng)域常規(guī)制備方法，較佳地為市售所得。其中所述Micro RNA定量檢測試劑盒較佳地還包括內(nèi)參引物。本發(fā)明所述內(nèi)參引物為本領(lǐng)域常規(guī)的內(nèi)參引物，本發(fā)明所述內(nèi)參引物較佳地為U6-F和U6-R引物，所述內(nèi)參引物的序列如下所示:U6-F:5’ -CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，如序列表中 SEQ ID NO: 6 所示；U6-R:5’ -AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’，如序列表中 SEQ ID N0:7 所示。所述內(nèi)參引物制備方法為本領(lǐng)域常規(guī)制備方法，較佳地為人工合成序列。本發(fā)明所用的原料或試劑除特別說明之外，均市售可得。相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果如下:1、本發(fā)明提供的Micro RNA表達檢測方法利用所述具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的引物，通過一次反轉(zhuǎn)錄幾乎可以得到待測樣品中所有的Micro RNA樣本，以及內(nèi)參基因(U6基因，該基因為IOObp左右的mRNA)，大大提高了 Micro RNA的檢測效率。2、本發(fā)明提供的具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的引物，經(jīng)過退火處理后，能夠大幅降低引物二聚體及復(fù)雜發(fā)卡結(jié)構(gòu)的生成，從而最大幅度地提高了該引物對于Micro RNA的反轉(zhuǎn)效率。本發(fā)明所述Micro RNA定量檢測試劑盒利用所述具有頸環(huán)結(jié)構(gòu)的引物，可以通過一次反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，完成包括內(nèi)參以及待檢Micro RNA在內(nèi)的反轉(zhuǎn)錄,大大降低了分步反轉(zhuǎn)Micro RNA及內(nèi)參的小片段mRNA所產(chǎn)生的系統(tǒng)誤差，該方法簡單高效，從而大幅節(jié)省了時間和成本。


圖1 (A)為Cal-27細胞qPCR內(nèi)參基因(U6)擴增曲線；圖1 (B)為Cal_27細胞qPCR內(nèi)參基因(U6)熔解曲線圖；圖1 (C)為Cal-27細胞qPCR待檢基因(MiR_365a)擴增曲線；圖1 (D)為Cal-27細胞qPCR待檢基因(MiR_365a)熔解曲線圖。其中a為Cal_27細胞樣本重復(fù)1，b為Cal-27細胞樣本重復(fù)2，c為Cal-27細胞樣本重復(fù)3。圖2 (A)為H印-2細胞qPCR內(nèi)參基因(U6)擴增曲線；圖2 (B)為H印_2細胞qPCR內(nèi)參基因(U6)熔解曲線圖；圖2 (C)為H印-2細胞qPCR待檢基因(MiR_365a)擴增曲線；圖2 (D)為H印-2細胞qPCR待檢基因(MiR_365a)熔解曲線圖。其中d為!fep-2細胞樣本重復(fù)1，e為!fep-2細胞樣本重復(fù)2，f為!fep-2細胞樣本重復(fù)3。圖3 (A)為LOVO細胞qPCR內(nèi)參基因(U6)擴增曲線；圖3 (B)為LOVO細胞qPCR內(nèi)參基因(U6)熔解曲線圖；圖3 (C)為LOVO細胞qPCR待檢基因(MiR_365a)擴增曲線；圖3 (D)為LOVO細胞qPCR待檢基因(MiR_365a)熔解曲線圖。其中g(shù)為LOVO細胞樣本重復(fù)1，h為LOVO細胞樣本重復(fù)2，i為LOVO細胞樣本重復(fù)3。圖4 (A)為MCF-7細胞qPCR內(nèi)參基因(U6)擴增曲線；圖4 (B)為MCF-7細胞qPCR內(nèi)參基因(U6)熔解曲線圖；圖4 (C)為MCF-7細胞qPCR待檢基因(MiR_365a)擴增曲線；圖4 (D)為MCF-7細胞qPCR待檢基因(MiR-365a)熔解曲線圖。其中j為MCF-7細胞樣本重復(fù)1，k為MCF-7細胞樣本重復(fù)2，I為MCF-7細胞樣本重復(fù)3。圖5為Cal-27、Hep-2, LOVO, MCF-7細胞系中Micro RNA365a基礎(chǔ)表達檢測結(jié)果圖。圖6為對比實施例1中四種細胞系(Cal-27、H印-2、L0V0、MCF-7)的Micro RNA365a表達量檢測結(jié)果圖。
具體實施例方式主要儀器為:5417R臺式冷凍高速離心機，thermo公司，商品號cat#5417R ；PCR 儀，cat#2500 ;`ThermoForma310 系列直熱式 CO2 培養(yǎng)箱，thermo 公司，cat#3111 ；酶標儀Biotek 公司，VE-186 ；主要試劑為:PrimerScript反轉(zhuǎn)錄酶，Takara公司，商品號:cat#U1240 ；E.coli Poly(A)聚合酶，NEB 公司，商品號:#M0276S ；5 X退火緩沖液,碧云天公司，商品號:D0251 ；GXD kit iqSYBR Green, Bio-Rad 公司，商品號:1708882AP ；Cal-27 細胞株，購自 ATCC，商品號:CRL_2095 ；H印2細胞株，購自中科院細胞庫，商品號:TCHu21 ；L0V0細胞株，購自中科院細胞庫，商品號:TCHu82 ；MCF-7細胞株，購自中科院細胞庫，目錄號:TCHu74 ；改良RPM1-1640 培養(yǎng)基，購自 Hyclone，貨號:SH30809.0lB ；FBS，胎牛血清，購自普飛生物，貨號:1101-500 ；Penicillin-Streptomycin solution SP 雙抗，購自 Hyclone,貨號:J121071 ;Micro RNA抽提試劑盒:Micro RNApure Mini kit,購自康為世紀公司，貨號:CW0627。實施例1Micro RNA反轉(zhuǎn)錄檢測引物
本發(fā)明針對Micro RNA提供3條具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的引物，所述莖環(huán)引物名稱和序列分別如下所示:Oligol:5’ -GTCGGAGAGACTGCAGTGGCGGACCAATTCGCACTCTCTCCGACTITITITTA-3’(如序列表中 SEQ ID NO:1 所示)；01igo2:5’ -GTCGGAGAGACTGCAGTGGCGGACCAATTCGCACTCTCTCCGACTTTTTTTTC-3’(如序列表中 SEQ ID NO:2 所示)；01igo3:
5’ -GTCGGAGAGACTGCAGTGGCGGACCAATTCGCACTCTCTCCGACTTTTTTTTG-3’(如序列表中 SEQ ID NO:3 所示)。上述引物由捷瑞生物合成制備。本發(fā)明還利用了 Micro RNA通用反向引物和Has_MiR-365a檢測正向引物，所述引物分別如下所示:Micro RNA 通用反向引物序列:5’-CTGCAGTGGCGGACCA-3’(如序列表中 SEQ IDN0:4所示)；Has-MiR-365a 檢測正向引物:5’ -TAATGCCCCTAAAAATCCTTAT-3’(如序列表中 SEQID NO:5 所示)。本發(fā)明使用的內(nèi)參引物為U6-F和U6-R引物，所述引物如下所示:U6-F:5’ -CTCGCTTCGGCAGCACA-3’(如序列表中 SEQ ID NO:6 所示)；U6-R:5’ -AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’(如序列表中 SEQ ID NO:7 所示)。上述引物均由捷瑞生物合成制備，所述引物的濃度均為lOOnmol/μ I。實施例2實驗用各細胞系的制備無菌37°C，5%C02條件下，使用1640+10%FBS+1%SP培養(yǎng)基進行細胞貼壁培養(yǎng)，分別培養(yǎng)Cal-27、Hep2, LOVO, MCF-7細胞，于6cm培養(yǎng)皿中，待細胞生長至80%左右后，即可進行抽提Micro RNA實驗。實施例3Micro RNA樣品的制備1.單層培養(yǎng)細胞:吸去培養(yǎng)液，加入Buffer RLM (Micro RNA抽提緩沖液，Lot:04911C ;購自康為世紀，包含于Micro RNA提取試劑盒內(nèi)，Cat:CW0627)，每IOcm2加入Iml Buffer RLM02.樣品中加入Buffer RLM后反復(fù)吹打幾次，使其充分裂解。室溫放置5分鐘，使蛋白核酸復(fù)合物完全分離。3.以每Iml Buffer RLM加入200 μ I氯仿的比例加入氯仿，蓋好管蓋，劇烈振蕩15秒，室溫放置5分鐘。4.40C 12，OOOrpm離心15分鐘，樣品分為三層:紅色有機相，中間層和無色水相，將上層無色水相移到一個新的離心管中。5.向步驟4得到的溶液中加入1/3倍體積的無水乙醇，混勻，將得到的溶液和沉淀一起轉(zhuǎn)入已裝入收集管(Collection Tube2ml)的吸附柱RM (Spin Column RM)中。若一次不能將全部溶液加入吸附柱，請分多次轉(zhuǎn)入。12，OOOrpm離心30秒，離心后棄掉吸附柱RM，保留流出液。6.向步驟5得到的溶液中加入2/3倍體積的無水乙醇，混勻。7.將上步所得溶液和沉淀一起轉(zhuǎn)入已裝入收集管(Collection Tube2ml)的吸附柱RS(Spin Column RS)中。若一次不能將全部溶液加入吸附柱，請分多次轉(zhuǎn)入。12，OOOrpm離心30秒，倒掉收集管中廢液，將吸附柱RS重新放回收集管中。8.向吸附柱RS中加入700 μ I Buffer RffT (使用前檢查是否加入無水乙醇)，室溫12，OOOrpm離心30秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱RS重新放回收集管中。9.向吸附柱RS中加入500 μ I Buffer RW2 (使用前檢查是否加入無水乙醇)，室溫12，OOOrpm離心30秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱RS重新放回收集管中。10.重復(fù)步驟9。11.12，OOOrpm離心I分鐘，倒掉收集管中的廢液。將吸附柱RS置于室溫數(shù)分鐘，以徹底晾干。注意:此步驟的目的是將吸附柱RS中殘留的乙醇去除，乙醇的殘留會影響后續(xù)的酶促反應(yīng)(酶切、PCR等)。12.將吸附柱RS置于一個新的無RNA酶(RNase-free)離心管(CollectionTubel.5ml)中，向吸附柱中間部位加入30 μ I的不含RNA酶的水(RNase-Free Water)，室溫放置I分鐘，12，OOOrpm離心I分鐘，收集RNA溶液，得到的RNA溶液保存在_70°C，防止降解。13.使用酶標儀檢測所得RNA濃度，檢測所得Micro RNA濃度如表I所示:表IMicro RNA 濃度
權(quán)利要求
1.一種Micro RNA表達檢測方法,其特征在于,所述Micro RNA表達檢測方法包括以下步驟: (1)提取樣品的MicroRNA，將所得Micro RNA連接PolyA尾巴； (2)將三條具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的引物混合后進行退火處理，所述具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的引物的序列分別如序列表中SEQ ID NO: 1、SEQ ID N0:2和SEQ IDN0:3所示; (3)將步驟(I)所得連有PolyA尾巴的Micro RNA與步驟(2)所得具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的引物退火連接； (4)以步驟(3)所得MicroRNA為模板反轉(zhuǎn)錄得到cDNA ； (5)以步驟(4)所得cDNA為模板，加入擴增目標MicroRNA的引物，通過熒光定量PCR方法檢測目標Micro RNA的表達。
2.如權(quán)利要求1所述的MicroRNA表達檢測方法，其特征在于，步驟(2)所述退火處理的程序為:(1)95°C反應(yīng)2min，(2)每5 10秒下降0.1°C，降至35°C 15°C，(3) 4°C保存。
3.如權(quán)利要求1所述的MicroRNA表達檢測方法,其特征在于,步驟(3)所述退火連接的程序為:60 70°C，反應(yīng)5 lOmin。
4.如權(quán)利要求1所述的MicroRNA表達檢測方法,其特征在于,步驟(4)所述反轉(zhuǎn)錄的程序為:(1) 30°C反應(yīng)10 15分鐘；(2) 42°C反應(yīng)50 60分鐘；(3) 50°C反應(yīng)10 15分鐘；(4) 95°C反應(yīng)10 15分鐘；(5)將所得cDNA樣品于4°C保存。
5.如權(quán)利要求1所述的MicroRNA表達檢測方法，其特征在于，步驟(5)所述擴增目標Micro RNA的引物為:Micro RNA通用反向引物和MicroRNA檢測正向引物，所述Micro RNA檢測正向引物的序列如序列表中SEQID N0:5所示。
6.一種具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的引物，其特征在于，所述具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的引物的序列如序列表中 SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2 或 SEQ ID NO:3 所示。
7.一種Micro RNA定量檢測試劑盒，其特征在于，該Micro RNA定量檢測試劑盒包括:SYBR Green I熒光染料、PCR緩沖液、dNTPs溶液、DNA聚合酶、無菌雙蒸水、具有頸環(huán)結(jié)構(gòu)的引物、通用反向引物和Micro RNA檢測正向引物，其中所述具有頸環(huán)結(jié)構(gòu)的引物的序列分別如序列表中 SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2 和 SEQ ID NO:3 所示。
8.如權(quán)利要求7所述的MicroRNA定量檢測試劑盒，其特征在于，所述Micro RNA檢測正向引物的序列如序列表中SEQ ID N0:5所示。
9.權(quán)利要求7 8任一項所述MicroRNA定量檢測試劑盒在檢測Micro RNA表達中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種MicroRNA表達檢測方法及其定量檢測試劑盒。該方法包括(1)提取樣品的MicroRNA，將該MicroRNA連接PolyA尾巴；(2)將三條具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的引物混合后退火處理，(3)將連有PolyA尾巴的MicroRNA與具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的引物退火連接，(4)以該MicroRNA為模板反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，(5)以該cDNA為模板，加入擴增目標MicroRNA的引物，通過熒光定量PCR方法檢測目標MicroRNA表達。所述方法通過一次反轉(zhuǎn)錄可得到待測對象所有的MicroRNA及內(nèi)參基因，大大降低了引物二聚體以及復(fù)雜發(fā)卡結(jié)構(gòu)的生成，大幅度提高了對MicroRNA的檢測效率。
文檔編號G01N21/64GK103205489SQ201310036690
公開日2013年7月17日 申請日期2013年1月30日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月30日
發(fā)明者姚遠颋, 王海峰, 費倩嵐, 談竹君, 勞昕元 申請人:上海黃離生物科技有限公司