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一種定量測定植物中生長素與脫落酸含量的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種定量測定植物中生長素和脫落酸含量的方法，步驟如下：將樣品研磨后用甲醇進(jìn)行浸提，加入內(nèi)標(biāo)D5-IAA和D6-ABA，用凈化-定量-濃縮多聯(lián)機(jī)系統(tǒng)的EVA功能濃縮溶液，用乙酸乙酯等體積萃取激素，用氮?dú)獯蹈桑儆肏Ac溶解，用凈化-定量-濃縮多聯(lián)機(jī)系統(tǒng)中的SPE功能過固相萃取柱純化，收集洗脫樣品；將洗脫樣品干燥后，用甲醇溶解得到待測樣品，將待測樣品采用液質(zhì)聯(lián)用方法測定生長素和脫落酸的含量。本發(fā)明建立了一個省時、高效的分析方法，分離效果理想。大大減少了分析樣品的用量，有利于操作步驟的簡化，雜質(zhì)少。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)前處理的自動化，縮短了操作時間，減少系統(tǒng)誤差，使前處理過程更加精準(zhǔn)。
【專利說明】一種定量測定植物中生長素與脫落酸含量的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種定量測定植物中生長素與脫落酸含量的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]植物體內(nèi)具有多種內(nèi)源激素，其含量及存在形式不斷變化，并產(chǎn)生一系列生理生化反應(yīng)，在一定程度上影響和控制植物的生長、發(fā)育、成熟和衰老等過程。生長素參與根和莖的發(fā)育和生長、器官的衰老、維管束組織的形成和分化發(fā)育，以及植物的向地和向光反應(yīng)等。ABA能促進(jìn)果實(shí)與葉片脫落、器官衰老和氣孔關(guān)閉、影響植物開花、調(diào)節(jié)種子和胚的發(fā)育等生理功能。果實(shí)中激素的種類及含量的多少直接影響果實(shí)的發(fā)育，因此建立合理實(shí)用的激素含量分析方法，對研究植物的生長發(fā)育有重要意義。
[0003]植物組織中生長素(吲哚-3-乙酸，IAA)和脫落酸(ABA)含量甚微，測定困難，目前植物內(nèi)源激素的分析方法主要有酶聯(lián)免疫法(ELISA)、放射免疫法(RIA)、高效液相色譜法(HPLC)、氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)和液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)等。液相色譜選擇性和特異性差，氣質(zhì)聯(lián)用衍生過程繁瑣。液質(zhì)聯(lián)用不需目標(biāo)物衍生處理，操作簡便，而且靈敏度高、選擇性和特異性好，然而目前所報(bào)道的液質(zhì)方法，前處理凈化只采用傳統(tǒng)的固相萃取凈化，操作繁瑣、耗時費(fèi)力，無法實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化、自動化，人為誤差較大，無法保證定量結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明提供了一種定量測定植物中生長素與脫落酸含量的方法。本發(fā)明在多種分析方法的基礎(chǔ)上，通過改進(jìn)液質(zhì)聯(lián)用分析方法中的前處理方法，采用在線SPE/凝膠凈化/定量濃縮多聯(lián)機(jī)系統(tǒng)的固相萃取(SPE)和定量濃縮(EVA)功能，該儀器可以自動完成SPE凈化過程，且EVA由真空、加熱、氮吹三位一體構(gòu)成，三道紅外傳感器可精確定容，具有多種溶劑轉(zhuǎn)換、蒸發(fā)至干、自動稀釋、定量轉(zhuǎn)移等功能，該系統(tǒng)常見于果蔬中農(nóng)藥的殘留、土壤及動物血液中有毒物質(zhì)及食品中塑化劑的前處理過程，在植物激素測定的方法中未見報(bào)道。對待測樣品中IAA和ABA進(jìn)行液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(high-performance liquid chromatography-tandem massspectrometric, LC-MS/MS)石開究，采用添加同位素(D5-1AA, D6-ABA)到樣品中作為定量測定的手段，保證了定性、定量結(jié)果的可靠性，為植物體內(nèi)源激素的研究提供了關(guān)鍵技術(shù)方法。
[0005]為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
本發(fā)明提供了一種定量測定植物中生長素和脫落酸含量的方法，步驟如下:將樣品研磨后用甲醇進(jìn)行浸提，加入內(nèi)標(biāo)D5-1AA和D6-ABA，用凈化-定量-濃縮多聯(lián)機(jī)系統(tǒng)的EVA功能濃縮溶液，用乙酸乙酯等體積萃取激素，用氮?dú)獯蹈?，再用HAc溶解，用凈化-定量-濃縮多聯(lián)機(jī)系統(tǒng)中的SPE功能過固相萃取柱純化，收集洗脫樣品；將洗脫樣品干燥后，用甲醇溶解得到待測樣品，將待測樣品采用液質(zhì)聯(lián)用方法測定并計(jì)算生長素和脫落酸的含量。
[0006]優(yōu)選地,所述樣品的質(zhì)量為0.5g-2.0g。
[0007]進(jìn)一步地,所述樣品的質(zhì)量為0.5g。
[0008]優(yōu)選地，所述甲醇的體積百分比濃度為70-90%。
[0009]進(jìn)一步地，所述甲醇的體積百分比濃度為80%。
[0010]優(yōu)選地，所述濃縮溶液時的濃縮溫度為35_45°C。
[0011]進(jìn)一步地，所述濃縮溶液時的濃縮溫度為35°C。
[0012]優(yōu)選地，所述固相萃取柱為C18柱。
[0013]本發(fā)明建立了凈化-定量-濃縮多聯(lián)機(jī)系統(tǒng)一液相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用儀(GPC-HPLC-MS/MS)，內(nèi)標(biāo)法定量測定植物組織中吲哚_3_乙酸(IAA)和脫落酸(ABA)的方法。實(shí)驗(yàn)以板栗為材料，通過正交試驗(yàn)篩選出最適的提取與純化方法，結(jié)果表明:經(jīng)檢測，取材料0.5g,80%甲醇(預(yù)冷)4°C冰箱中浸提過夜，并加入500ngD6-ABA，100ngD5_IAA35°C濃縮至水相，用乙酸乙酯等體積萃取激素，氮吹至干，用HAc溶解，經(jīng)C18小柱純化，ABA與IAA的含量相對較高。
[0014]本發(fā)明通過優(yōu)化板栗IAA、ABA兩種內(nèi)源激素的提取純化條件，建立了一個省時、高效的LC-MS/MS分析方法，分離效果理想。僅0.50g的樣品用量，大大減少了分析樣品的用量，并有利于操作步驟的簡化，雜質(zhì)少。實(shí)驗(yàn)中采用GPC純化系統(tǒng)完成多個步驟，實(shí)現(xiàn)前處理的自動化，縮短了操作時間，減少系統(tǒng)誤差，使前處理過程更加精準(zhǔn)。內(nèi)源激素與所用內(nèi)標(biāo)的結(jié)構(gòu)式非常相近，因而在提取、純化過程中內(nèi)源激素與內(nèi)標(biāo)均同步進(jìn)行，兩者同時進(jìn)入色譜柱，幾乎有相同的保留時間。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]附圖用來提供對本發(fā)明的進(jìn)一步理解，并且構(gòu)成說明書的一部分，與本發(fā)明的實(shí)施例一起用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。在附圖中:
圖1為板栗果實(shí)樣品及激素標(biāo)準(zhǔn)樣的色譜圖；其中，Al為IAA和ABA標(biāo)樣及內(nèi)標(biāo)的總峰圖；A2為D5-1AA的子離子峰圖；A3為IAA的子離子峰圖；A4為D6-ABA的子離子峰圖；A5為ABA的子離子峰圖。BI為樣品中IAA和ABA的總峰圖；B2為樣品中D5-1AA的子離子峰圖；B3為樣品中IAA的子離子峰圖；B4為樣品中D6-ABA的子離子峰圖；B5為樣品中ABA的子離子峰圖。此處將“B3為樣品中d5-1AA的子離子峰圖；”修改為“B3為樣品中IAA的子離子峰圖；”
圖2為使用不同重量的樣品應(yīng)用本發(fā)明的方法檢測到的IAA和ABA含量。

【具體實(shí)施方式】
[0016]以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0017]材料與方法 1.1材料
試材選自懷柔板栗試驗(yàn)站種質(zhì)的燕紅板栗(Castanea mollissima)果實(shí),放入液氮中冷凍，然后置于-80 V冰箱保存，用于激素測定。
[0018]1.2 儀器
高效液相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用儀(Agilentl200型液相色譜儀一Agilent 6410型串聯(lián)四極桿質(zhì)譜);GPC (凈化-定量-濃縮多聯(lián)機(jī)系統(tǒng))；離心機(jī)(SIGMA，3K15)。
[0019]1.3 試劑
IAA 內(nèi)標(biāo)(Toronto Research Chemicals Inc, D5-1AA) ；ABA 內(nèi)標(biāo)(Toronto ResearchChemicals Inc, D6-ABA) ；C18 柱(Cleanert S C18-SPE,500mg/3mL);陰離子交換柱(Cleanert SAX-SPE, 500mg/3mL);纖維素柱(Agilent Bond Elut-Cellulose, 500mg/3mL)；二乙基二硫代氨基甲酸鈉(抗氧化劑);交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮(PVPP);甲醇(色譜純);超純水為實(shí)驗(yàn)室提供；其他有機(jī)試劑均為分析純，來自北京化工廠。
[0020]1.4樣品的制備
準(zhǔn)確稱取1.1中保存的板栗果實(shí)樣品，研磨，加入抗氧化劑聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和掩蔽劑二乙基二硫代氨基甲酸鈉(BHJ)各0.1?0.15g，加入體積百分比濃度為80%甲醇(預(yù)冷)，約20倍體積，4°C靜置過夜；取出樣品，8000rpm，4°C離心15min，取上清；用1ml體積百分比濃度為80%甲醇(預(yù)冷)洗沉淀3次，混合上清；加入10ngD5-1AA和500ngD6_ABA，加入兩滴氨水，搖勻；用凈化-定量-濃縮多聯(lián)機(jī)系統(tǒng)的EVA功能，在一定溫度下將溶液濃縮至5ml ;濃縮后的液體，3500rpm,4°C離心25min ;用2mol/L HCl調(diào)pH至2.5 ;加入少量PVPP，用等體積的乙酸乙酯萃取3次，收集乙酸乙酯相；加入兩滴氨水，混勻^EVA中將乙酸乙酯用N2吹干；用0.lmol/LHAc定容至3mL ;用凈化-定量-濃縮多聯(lián)機(jī)系統(tǒng)中的SPE功能過固相萃取柱，收集洗脫樣品；加兩滴氨水，真空冷凍干燥至干；用ImL甲醇溶解，得到待測樣品。將待測樣品采用液質(zhì)聯(lián)用方法測定并計(jì)算IAA和ABA的含量。
[0021]采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對前處理過程進(jìn)行優(yōu)化，將樣品量設(shè)為2g、lg、0.5g ;甲醇抽提體積百分比濃度設(shè)為90%、80%、70% ;GPC濃縮溫度設(shè)為45°C、40°C、35°C;固相萃取柱為C18、陰離子交換色譜、纖維素柱。
[0022]1.5色譜條件
色譜柱:ZORBAXSB-Aq 柱:5 μ m,4.6 mmX 150 mm ;流速:0.3mL/min ;柱溫:30°C ;進(jìn)樣量:5 μ L ;流動相Α，含體積百分比0.1%的乙酸水溶液；流動相B，甲醇。
[0023]1.6質(zhì)譜條件
ESI離子源，正負(fù)離子檢測方式，MRM模式。離子源條件為干燥氣溫度350°C，干燥氣流量12L/min，霧化器壓力35psi，毛細(xì)管電壓，4000V，最優(yōu)碎裂電壓(frag)均為155V，最優(yōu)碰撞能量(CE)為30V。
[0024]1.7凈化-定量_濃縮多聯(lián)機(jī)系統(tǒng)條件 1.7.1濃縮條件
水加熱溫度(Temperature water heating):35 °C ;濃縮槍底部溫度(Temperaturebottom cone):35°C ;吸液速度(Suct1n speed):20ml/min ;定容溶液(Constant volumesolut1n):超純水。
[0025]1.7.2固相萃取條件
吸液速度(Suct1n speed):20ml/min ;加樣速度(Dispending speed):20ml/min ;甲醇和0.lmol/L醋酸對SPE柱進(jìn)行活化、洗柱和洗脫。
[0026]2.結(jié)果與分析
2.1標(biāo)樣與樣品的全譜圖(參見圖1)。
[0027]如圖1所示，在以上色譜條件下，IAA和ABA能與其他成分得到很好地分離。從圖中可以看出，標(biāo)樣從六、05-^^48六和06-六8六保留時間分別為:9.089min,9.123min,9.514min,9.539min。樣品中IAA、D5-1AA, ABA和D6-ABA的保留時間與標(biāo)樣一致。IAA和ABA的特征離子，如表I所示。
[0028]表I ABA、IAA及相應(yīng)內(nèi)標(biāo)產(chǎn)物的選擇特征離子激素種類 ^ΙΠ/Ζ.......................................................................................1AA.....................................................................................^..........................................................................................176........................................................................................;D5-1AA.1Sl
ABA263
ID6-ABA269丨
2.2板栗果實(shí)中IAA與ABA的含量
從圖1中得到內(nèi)源激素與內(nèi)標(biāo)物的峰面積，按照以下公式計(jì)算內(nèi)源激素ABA、IAA的濃度，結(jié)果如表2所不。

IflllX加入內(nèi)■ X氘代率
__麵』變歷.......￥,γ5-

徉品重:1

ΣΑ176
—--，D5-1AA的加入量為

IAiSi
10ng,氣代率為98% ；
一 1C-1 A263
ABA內(nèi)源峰面積/內(nèi)標(biāo)峰面積=\ ___，D6-ABA的加入量為500ng,氘代率

Ζ.*ΣΑ2_
為 100%O
[0030]通過以上公式計(jì)算得到IAA和ABA的含量,如表2所示。
[0031]通常測定激素需要大量的樣品，有時候很難滿足，在提取液用量一定的情況下，適當(dāng)減少樣品的用量，使得提取液提取的更加充分，得到更好的效果。本 申請人:將樣品量設(shè)為三個梯度，分為0.5、1和2g。本 申請人:發(fā)現(xiàn)甲醇的提取率高、雜質(zhì)較少，采用甲醇為提取溶齊U，設(shè)置三個濃度梯度70%、80%和90%。在體外的條件下，植物激素很容易降解或轉(zhuǎn)化為其它形式，控制溫度很重要，在甲醇濃縮過程中要既要將甲醇去除又要保持激素不被破壞，因此在濃縮的過程中采用了 35°C、40°C和45°C三個溫度。在純化過程中，為了達(dá)到更好的分離效果，選取了三種類型的純化小柱，分別為C18、陰離子交換柱和纖維素柱。綜合以上的結(jié)果，發(fā)現(xiàn):取0.5g樣品在80%甲醇中浸泡抽提，35°C下濃縮，經(jīng)C18柱純化達(dá)到的效果最好，如表2所示，使用組8提取純化方法，IAA和ABA的含量都較高，這個方法適合用于這兩種激素的提取。
[0032]表2不同處理?xiàng)l件板栗果實(shí)中IAA、ABA含量

【權(quán)利要求】
1.一種定量測定植物中生長素和脫落酸含量的方法，其特征在于:步驟如下:將樣品研磨后用甲醇進(jìn)行浸提，加入內(nèi)標(biāo)D5-1AA和D6-ABA,用凈化-定量-濃縮多聯(lián)機(jī)系統(tǒng)的EVA功能濃縮溶液，用乙酸乙酯等體積萃取激素，用氮?dú)獯蹈?，再用HAc溶解，用凈化-定量-濃縮多聯(lián)機(jī)系統(tǒng)中的SPE功能過固相萃取柱純化，收集洗脫樣品；將洗脫樣品干燥后，用甲醇溶解得到待測樣品，將待測樣品采用液質(zhì)聯(lián)用方法測定并計(jì)算生長素和脫落酸的含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述樣品的質(zhì)量為0.5g-2.0g。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于:所述樣品的質(zhì)量為0.5g。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述甲醇的體積百分比濃度為70-90%。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于:所述甲醇的體積百分比濃度為80%。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述濃縮溶液時的濃縮溫度為35-45°C。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于:所述濃縮溶液時的濃縮溫度為35°C。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述固相萃取柱為C18柱。
【文檔編號】G01N30/06GK104165947SQ201410413383
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2014年8月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月21日
【發(fā)明者】楊柳, 秦嶺, 王建立, 劉帥, 曹慶琴, 邢宇, 張卿 申請人:北京農(nóng)學(xué)院