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特異性結(jié)合前列腺癌的短肽及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一系列利用噬菌體展示肽庫技術(shù)篩選得到的具有靶向前列腺癌特性的多肽。本發(fā)明的結(jié)合多肽特異性高，可用于前列腺癌高危人群的普查及前列腺癌的早期臨床診斷、以及治療效果的評(píng)估。
【專利說明】特異性結(jié)合前列腺癌的短肽及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)多肽【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一系列可特異性結(jié)合前列腺癌的短肽。
【背景技術(shù)】
[0002]前列腺癌是嚴(yán)重威脅中老年男性健康的惡性腫瘤之一，而且發(fā)病率逐年上升，死亡率高，僅次于肺癌，位居第二。50多年以來，雄激素阻斷治療一直是前列腺癌的標(biāo)準(zhǔn)療法，然而，大多數(shù)患者最終會(huì)發(fā)展為激素抵抗性前列腺癌(hormone refractory prostateCancer，HRPC)。對(duì)于HRPC，目前尚無有效的療法，而現(xiàn)有治療手段包括放射治療、化學(xué)治療等均不能延長(zhǎng)患者生命達(dá)一年以上。因此探索新型有效的前列腺癌治療方法，一直是泌尿外科臨床所面臨的重要課題之一。[0003]目前我國(guó)對(duì)于前列腺癌的篩查率相對(duì)較低，這也是造成前列腺癌死亡率偏高的重要原因之一。因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)可用于前列腺癌診斷的相關(guān)蛋白。而多肽因分子量小，組織穿透性好，無免疫原性且對(duì)細(xì)胞表面受體具有較高親和力而成為靶向傳遞研究中的理想配體。然而已知的天然受體-配體對(duì)是非常有限的。
[0004]噬菌體展示肽庫技術(shù)的發(fā)展則為發(fā)現(xiàn)和表征新的配體及對(duì)應(yīng)受體提供了有力的工具，不僅有望實(shí)現(xiàn)臨床應(yīng)用于腫瘤的靶向治療，也有助于解釋疾病發(fā)生機(jī)制的理論研究。噬菌體展示技術(shù)通過將特定片段插入噬菌體DNA中而將相應(yīng)的多肽表達(dá)在pill衣殼蛋白上，從而在噬菌體的DNA和衣殼蛋白之間搭建橋梁，使得各種靶分子的多肽配體可通過體外或體內(nèi)篩選得以快速鑒定。發(fā)展至今，應(yīng)用此技術(shù)已成功篩選得到針對(duì)肝癌、結(jié)腸癌、乳腺癌等多種人類腫瘤的靶向多肽，但是對(duì)于篩選前列腺癌靶向配體的相關(guān)報(bào)道則很少。
[0005]因此，本發(fā)明利用噬菌體展示肽庫技術(shù)于前列腺癌腫瘤模型體內(nèi)篩選得到16條可靶向前列腺癌的短肽，并對(duì)此多肽的靶向特性進(jìn)行了鑒定，以考察其作為靶向配體用于傳遞藥物至前列腺腫瘤部位的可行性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一系列利用噬菌體展示肽庫技術(shù)篩選得到的具有靶向前列腺癌特性的多肽。
[0007]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述多肽在制備前列腺癌診斷試劑盒中的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn):
[0009]用噬菌體展示肽庫減性篩選腫瘤細(xì)胞特異性結(jié)合多肽或靶肽的方法為:通常用兩個(gè)細(xì)胞系進(jìn)行篩選，將噬菌體展示隨機(jī)肽庫先通過不含靶抗原的正常細(xì)胞篩選，未結(jié)合的上清再通過含靶抗原的細(xì)胞，篩選出噬菌體擴(kuò)增后進(jìn)行下一輪篩選，最終得到特異性結(jié)合肽。
[0010]首先，采用上述噬菌體展示肽庫減性篩選技術(shù)，以前列腺癌LNCaP和PC3細(xì)胞作為靶細(xì)胞，正常細(xì)胞為吸附細(xì)胞，對(duì)NEW ENGLAND Biolabs的Ph.D._7? Phage DisplayPeptide Library Kit進(jìn)行四輪體外篩選，通過逐輪增強(qiáng)洗滌力度，獲得了前列腺癌特異性的噬菌體克隆。上述的篩選后，分別于第二輪、第三輪和第四輪篩選結(jié)果中隨機(jī)挑取單克隆進(jìn)行DNA的提取和測(cè)序。應(yīng)用生物信息學(xué)工具分析篩選得到的多肽序列，同時(shí)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)用于分析候選噬菌體單克隆對(duì)細(xì)胞的結(jié)合能力，從而鑒定出與前列腺癌細(xì)胞具有較強(qiáng)的親和力的噬菌體16個(gè)克隆，將該16個(gè)克隆送去測(cè)序，并分別命名為PCP1-16，測(cè)序結(jié)果證實(shí)PCP1-16的氨基酸序列分別如SEQ ID NO:1_16所示。
[0011]本發(fā)明篩選得到的多肽經(jīng)鑒定具有以下特性及優(yōu)點(diǎn):
[0012]多肽可有效地識(shí)別并特異性結(jié)合前列腺癌細(xì)胞系LNCaP和PC3，而對(duì)正常的前列腺細(xì)胞系RWPE-1，及其他腫瘤細(xì)胞H印G2、A549、SW480的結(jié)合能力弱，表現(xiàn)出針對(duì)前列腺癌特異的識(shí)別和結(jié)合能力；
[0013]該多肽具有分子量小，組織穿透性好，無免疫原性且對(duì)細(xì)胞表面受體具有較高親和力的普遍特點(diǎn)，該多肽可用于制備前列腺癌診斷試劑藥盒，該試劑盒診斷靈敏度高、特異性高，可用于前列腺癌高危人群的普查及前列腺癌的早期臨床診斷、以及治療效果的評(píng)價(jià)與病人病情轉(zhuǎn)歸、預(yù)后的判斷。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1為ELISA檢測(cè)第四輪篩選噬菌體克隆與LNCaP和PC3的親和力對(duì)比柱狀圖；
[0015]其中，圖1A為PCP1-20這20個(gè)噬菌體克隆分別對(duì)LNCaP的親和力，圖1B為PCP1-20這20個(gè)噬菌體單克隆分別對(duì)PC3的親和力，21為原庫隨機(jī)噬菌體克隆對(duì)LNCaP的親和力，22為原庫隨機(jī)噬菌體克隆對(duì)PC3的親和力。
[0016]圖2為噬菌體克隆對(duì)不同細(xì)胞的體外靶向能力鑒定(噬菌體相對(duì)結(jié)合=TUit3ps菌體
克隆/ TU空白對(duì)照B旌菌體)。
[0017]其中，圖2A為噬菌體PCP1-6分別對(duì)不同細(xì)胞的結(jié)合能力結(jié)果圖，圖2B為噬菌體PCP7-11分別對(duì)不同細(xì)胞的結(jié)合能力結(jié)果圖，圖2C為噬菌體PCP12-16分別對(duì)不同細(xì)胞的結(jié)合能力結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0018]本發(fā)明通過以下實(shí)施例作進(jìn)一步說明，但不作為本發(fā)明的限制。
[0019]實(shí)施例1前列腺癌特異性結(jié)合多肽的篩選
[0020]本實(shí)施例采用噬菌體展示隨機(jī)12肽庫減性篩選與前列腺癌細(xì)胞特異性結(jié)合的多肽，其具體步驟如下:
[0021]用胰酶消化人前 列腺癌細(xì)胞LNCaP和PC3后，調(diào)整細(xì)胞密度，接種于預(yù)先包被多聚賴氨酸的培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞長(zhǎng)至80% -90%融合度時(shí)進(jìn)行篩選實(shí)驗(yàn)。
[0022]取上述LNCaP和PC3細(xì)胞，用無血清DMEM培養(yǎng)后，加入牛血清白蛋白BSA封閉，再加入20 μ I噬菌體肽庫，孵育1.5h后，傾倒除去未結(jié)合噬菌體，倒置拍甩除去殘余溶液。用洗滌液0.2% (v / v)TBST緩沖液沖洗4次，加入非特異性緩沖液0.2M甘氨酸-鹽酸(pH2.2) 2ml，吸出洗脫液，加入250 μ 15MTris_HCl (pH9.0)中和后，將洗脫液轉(zhuǎn)至RWPE-1細(xì)胞中，孵育3h后，收集上清，即為第一輪篩選得到的噬菌體，將得到的噬菌體取少量利用大腸桿菌通過滴定法確定噬菌體的濃度，其余的噬菌體感染大腸桿菌進(jìn)行擴(kuò)增，用于下一輪的篩選。
[0023]第二輪篩選時(shí)，洗滌液TBST中Tween-20濃度提高至0.5%，與LNCaP和PC3孵育時(shí)間為40min，洗滌次數(shù)增加至7次，其余條件、步驟與第一輪相同。
[0024]第三輪篩選時(shí)，洗滌液TBST中Tween-20濃度提高至0.8%，與LNCaP和PC3孵育時(shí)間減少至25min，并且洗滌次數(shù)增加至10次，其余條件、步驟與第一輪相同。
[0025]第四輪篩選時(shí)，洗滌液TBST中Tween-20濃度提高至1.0%，與LNCaP和PC3孵育時(shí)間減少至20min，并且洗滌次數(shù)增加至15次，其余條件、步驟與第一輪相同。
[0026]測(cè)定第四輪篩選獲得的噬菌體的滴度后，在LB / IPTG / Xgal平板上隨機(jī)挑取藍(lán)色噬菌斑，制備噬菌體單克隆用于鑒定。
[0027]實(shí)施例2噬菌體的擴(kuò)增
[0028]將實(shí)施例1中，每輪篩選獲得的噬菌體用LB培養(yǎng)基進(jìn)行100倍比稀釋后，取20 μ I稀釋后噬菌體與200 μ I對(duì)數(shù)生長(zhǎng)早期的大腸桿菌菌液混勻，加入到于45°C保溫的LB頂層瓊脂后迅速傾倒于含有IPTG / Xgal的LB固體平板，處理24小時(shí)，計(jì)數(shù)平板上噬菌體可生長(zhǎng)的斑數(shù)，然后用此數(shù)目乘以稀釋倍數(shù)即得到每10 μ I噬菌體的空斑形成單位(pfu)滴度。
[0029]前列腺癌細(xì)胞特異結(jié)合的噬菌體多肽的富集:如表1所示，與LNCaP和PC3結(jié)合的陽性噬菌體克隆經(jīng)四輪篩選后噬菌體回收率提高1000倍。
[0030]表1經(jīng)過四輪篩選后陽性噬菌體的回收率
[0031]
【權(quán)利要求】
1.一種短肽，其特征在于:能特異性結(jié)合前列腺癌細(xì)胞。
2.如權(quán)利要求1所述的短肽，其特征在于:其為PCP1-16，其氨基酸序列分別如SEQIDNO:1-16 所示。
3.如權(quán)利要求1-2所 示的短肽在制備檢測(cè)前列腺癌細(xì)胞的制劑中的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于:所述前列腺細(xì)胞為L(zhǎng)NCaP和PC3。
5.權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)所述的短肽在制備前列腺癌診斷試劑盒中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK103897037SQ201410115439
【公開日】2014年7月2日 申請(qǐng)日期:2014年3月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月24日
【發(fā)明者】華國(guó)光 申請(qǐng)人:華國(guó)光