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專利名稱：新一代布魯氏菌病抗體競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)，具體說就是新一代布魯氏菌病抗體 竟?fàn)幟嘎?lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測試劑盒。
(二)
背景技術(shù)：
免疫學(xué)檢測方法是應(yīng)用免疫學(xué)理論設(shè)計(jì)的一系列測定抗原、抗 體、免疫細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子的實(shí)驗(yàn)方法。隨著學(xué)科間的相互滲 透，免疫學(xué)涉及的范圍不斷擴(kuò)大，新的免疫學(xué)檢測方法層出不窮。免 疫學(xué)方法的應(yīng)用范圍亦在日益擴(kuò)大，不僅成為多種臨床疾病診斷的重 要方法，也為眾多學(xué)科的研究提供了方便。
抗原與相應(yīng)抗體相遇可發(fā)生特異性結(jié)合，并在外界條件的影響下 呈現(xiàn)某種反應(yīng)現(xiàn)象，如凝集或沉淀，藉此可用已知抗原(或抗體)檢測 未知抗體(或抗原)。試驗(yàn)所釆用的抗體常存在于血清中，因此又稱之
為血清學(xué)反應(yīng)(serological reaction)?？乖N類繁多，按其物理性 狀可分顆粒性和可'溶性兩類。前者指細(xì)胞性抗原(包括細(xì)菌抗原)，其 制備較為簡便， 一般用新鮮細(xì)胞以無菌生理鹽水或磷酸緩沖液洗滌后 配成一定濃度。若系細(xì)菌抗原，則取新鮮培養(yǎng)物，經(jīng)集菌作如下處理， H抗原因不耐熱用0. 3% ~0. 5%甲醛處理，0抗原耐熱可加熱IO(TC 2h去除H抗原后應(yīng)用?？扇苄钥乖梢允羌?xì)胞膜、細(xì)胞漿、細(xì)胞核 及核膜等細(xì)胞組成部分，也可能是經(jīng)細(xì)胞分泌至體液中的一些可溶性 因子。細(xì)胞組成部分常需經(jīng)過機(jī)械或酶解法等破碎、離心獲得粗制抗 原，并通過選擇性沉淀或?qū)游龅确椒ㄟM(jìn)一步純化。而體液中(如血清 等)的可溶性抗原則可直接用生化手段獲得所需成分。有些可溶性抗 原僅具有免疫反應(yīng)性，而無免疫原性，此類抗原尚需與載體偶聯(lián)方可 成為完全抗原。
布魯氏菌病(Brucellosis)又稱地中海弛張熱，馬爾他熱，波
浪熱或波狀熱，是由布魯氏菌引起的人畜共患性全身傳染病，其臨床 特點(diǎn)為長期發(fā)熱、多汗、關(guān)節(jié)痛及肝脾腫大等。1886年英國軍醫(yī)Bruce 在馬爾他島從死于"馬爾他熱"的士兵脾臟中分離出"布魯氏菌"，首次明確了該病的病原體。1897年Wright與其同事發(fā)現(xiàn)病人血清與 布魯氏菌的培養(yǎng)物可發(fā)生凝集反應(yīng)，稱為Wright凝集反應(yīng)，從而建 立了迄今仍用的血清學(xué)診斷方法。我國古代醫(yī)籍中對本病雖有描述， 但直到1905年Boone于重慶對本病作正式報道。目前該病在世界分 布，只有幾個國家消滅此病，而在中國的東北，華北，西北一帶有流 行和分布，其它地區(qū)有散發(fā)，且日益廣泛和危害嚴(yán)重。對畜牧業(yè)和人 類來嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。布魯氏菌是一類革蘭陰性的短小桿菌，內(nèi)毒素是 重要的致病物質(zhì)。布魯氏菌有強(qiáng)侵襲力，細(xì)菌可通過完整皮膚和粘膜 進(jìn)入宿主。布魯氏菌有6個生物型，我國流行的是羊布魯氏菌，牛布 魯氏菌和豬布魯氏菌三種，其中以羊布魯氏菌最常見。自然情況下， 有60多種動物可感染布魯氏菌，其主要是山羊，綿羊，牛和豬，以 流產(chǎn)為主，孕期動物最為宜感。人類對布魯氏菌易感，細(xì)菌進(jìn)入人體 后，遷延不愈，反復(fù)發(fā)作，發(fā)熱呈波浪式，如不治療，后果嚴(yán)重。
根據(jù)臨床癥狀、流行病學(xué)特點(diǎn)和特征性病變，不難做出布魯氏菌 病的初步診斷，但由于在臨床上小腸結(jié)腸炎耶氏菌、乙型副傷寒桿菌、 大腸桿菌0: 157感染存在相似的癥狀，必須借助實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)才 能對布魯氏菌病進(jìn)行最后確診。
為了建立適合本病診斷和流行病學(xué)調(diào)査的快速、敏感、特異、準(zhǔn) 確的方法，國內(nèi)外許多學(xué)者進(jìn)行了大量研究，并取得了顯著的成績。 先后建立了病原鑒定、熒光抗體中和檢測等檢測方法。然而，我國目 前應(yīng)用的虎紅平板和試管凝集方法為國際貿(mào)易淘汰方法，技術(shù)落后， 假陽性也相對較高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種滿足我國動物防疫需求、敏感、特異、 能夠準(zhǔn)確診斷布魯氏菌病的新一代布魯氏菌病抗體竟?fàn)幟嘎?lián)免疫吸 附試驗(yàn)檢測試劑盒。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的它是利用平滑型布魯氏菌的脂多糖 作抗原包被酶標(biāo)板，用滅活菌液免疫健康?；蛉斯じ腥窘】蹬Ｖ苽潢?性對照血清、標(biāo)準(zhǔn)弱陽性血清，用健康非免疫牛血清作陰性對照血清， 用新型單克隆抗體作競爭抗體，抗Fc受體的蛋白質(zhì)AG酶標(biāo)物作為二抗，配制血清稀釋液、洗滌液、底物溶液A、底物溶液B、 H202、終止
液，組裝組成。
本發(fā)明新 一代布魯氏菌病抗體竟?fàn)嶦L ISA檢測試劑盒，還有以下
技術(shù)特征'
1.所述的抗原包被酶標(biāo)板是這樣制備的
(1)包被無菌條件下，將凍干抗原用蒸餾水懸浮到凍干前 的體積，用0. 05MpH9. 6的碳酸緩沖液按1: 1000稀釋，以100pl/孔， 包被聚苯乙烯96孔板，加蓋于4。C過夜；
(2 )洗滌以0. Olmol/L, pH值為7. 2的PBST作洗滌液，加 入足量室溫作用3分鐘后甩去，如上重復(fù)3次，或用洗板機(jī)重復(fù)洗3 次，拍干至無水印為止；
(3) 封閉用含r/。牛血清白蛋白的0.01mol/L，pH值為6. 3的 PBST按100ul/孔，加入至酶標(biāo)板中，37。C作用l小時，甩去，加入足 量洗滌液，室溫作用3分鐘后甩去，如上重復(fù)3次，或用洗板機(jī)重復(fù)洗 3次，拍干至無水印為止，自然干燥；
(4) 包裝將封閉好的酶標(biāo)板放于鋁箔袋中，加入lg包裝的 干燥劑，用真空包裝機(jī)將酶標(biāo)板包裝好，貼上標(biāo)簽。
2.所述的陽性對照血清的制備方法如下
(1) 制造用動物制備陽性血清的牛需要經(jīng)過實(shí)驗(yàn)室檢測，必須 是18月齡性成熟、健康牛，無小腸結(jié)腸炎耶氏菌、乙型副傷寒桿菌、 大腸桿菌0: 157感染，以及無繁殖系統(tǒng)感染等抗體陰性的健康牛；觀. 察一周；
(2) 免疫原制備將布氏桿菌牛種S1119. 3接種馬鈴薯浸液瓊脂 扁瓶，置37'C培養(yǎng)48小時，待形成一層菌落時，選取純凈扁瓶，吸棄 凝集水，用含0.5%苯酚的滅菌生理鹽水將菌苔洗下，傾入中性玻瓶中， 加甲醛溶液至終濃度為O. 2%,置37'C振蕩滅活48小時，經(jīng)無菌檢驗(yàn)合 格，于4。C以20000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，取沉淀，用生理鹽水做IO 倍稀釋，用作免疫原。于2X: rC冰箱保存?zhèn)溆茫?3) 免疫程序用免疫原按5ml/點(diǎn)分4點(diǎn)肌肉注射，免疫動 物，14日后，同法免疫一次，再14日后釆血，分離血清，用ELISA檢 測；血清OD450nm和陰性血清OD450nm的比值(P/N) 〉l方可大量釆血； 如檢驗(yàn)不合格，應(yīng)再加強(qiáng)免疫一次；
(4) 血清制造以常規(guī)方法采血，分離其血清，將其作為待 檢血清，用血清稀釋液作l: 2， 1: 4...…l: 128稀釋，用質(zhì)控強(qiáng)陽 性血清作參照進(jìn)行ELISA試驗(yàn)，取待檢血清OD650nm/質(zhì)控強(qiáng)陽性血清 0D65Onm值-l時的待檢血清稀釋度作為血清稀釋倍數(shù)，用血清稀釋液 對血清進(jìn)行稀釋；
(5) 分裝將血清用0.45)am的濾器進(jìn)行抽濾除菌，無菌條 件下加入硫柳汞和慶大霉素使其終濃度均為O. 02%以防腐，然后無菌
條件下定量分裝、凍干，貼上標(biāo)簽；
(6) 標(biāo)準(zhǔn)弱陽性血清制造將強(qiáng)陽性血清用血清稀釋液作 1: 1. 5稀釋。
3. 所述的陰性對照血清的制備方法如下:
(1) 制造用動物同陽性對照血清的制造用動物；
(2) 血清制造以常規(guī)方法釆血，分離其血清；
(3) 血清處理與分裝將血清用0.45ym的濾器進(jìn)行抽濾除菌， 無菌條件下加入硫柳汞和慶大霉素使其終濃度均為O. 02%以防腐，然 后無菌條件下定量分裝，貼上標(biāo)簽。
4. 所述的新型動物布魯氏菌病單克隆抗體制備方法如下
(1) 雜交瘤細(xì)胞株的培養(yǎng)將雜交瘤細(xì)胞株從液氣中取出， 置于370C水浴中迅速融化，1Q00轉(zhuǎn)/分鐘離心沉淀細(xì)胞，去掉凍存液， 加入10mlMEM培養(yǎng)基，分成兩個培養(yǎng)瓶于37'C二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)， 2-3天細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶底后，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)；
(2) 腹水新型單克隆抗體的制備按O. 5ml/只腹腔注射小鼠 降植烷，三天后，再按5X105-6/只的細(xì)胞濃度腹腔注射雜交瘤細(xì)胞， 約十天后產(chǎn)生腹水，每天釆一次，可連續(xù)釆2 - 3次，腹水取出后，3000轉(zhuǎn)/min離心10min，收集上清并混合，于56。C水浴處理10分鐘，-80 'C凍存為半成品；
(3) 中間品檢驗(yàn)無菌檢驗(yàn)按"獸藥典"進(jìn)行，應(yīng)無菌生
長；
(4) 效價測定取出質(zhì)檢過的動物布魯氏菌病抗原包被酶標(biāo)板， 每孔加入動物布魯氏菌病抗體競爭ELISA診斷試劑盒的樣品稀釋液 45ul,動物布魯氏菌病標(biāo)準(zhǔn)陰性血清5ul,加2排孔，標(biāo)準(zhǔn)陽性血清5ul， 加2排孔，動物布魯氏菌病單克隆抗體以l: IO倍比稀釋，每個稀釋度 加2列，26。C孵育30分鐘.單克隆抗體效價為OD450為0. 60至1.80時的 單抗稀釋倍數(shù)；
(5) 成品制備按效價檢測結(jié)果將單抗稀釋，分裝成O. 2ml/ 瓶，密封瓶口，貼好標(biāo)簽，注明批次。
本發(fā)明新一代布魯氏菌病抗體竟?fàn)幟嘎?lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測試劑 盒是一種敏感、特異、能夠準(zhǔn)確診斷布魯氏菌病的競爭ELISA試劑盒，
本發(fā)明滿足我國動物防疫的需求，借助實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)對布魯氏菌病 進(jìn)行最后確診。
具體實(shí)施例方式
下面對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
實(shí)施例1，本發(fā)明新一代布魯氏菌病抗體竟?fàn)幟嘎?lián)免疫吸附試驗(yàn) 檢測試劑盒，它是利用平滑型布魯氏菌的脂多糖作抗原包被酶標(biāo)板， 用滅活菌液免疫健康?；蛉斯じ腥窘】蹬Ｖ苽潢栃詫φ昭?、標(biāo)準(zhǔn)弱 陽性血清，用健康非免疫牛血清作陰性對照血清，用新型單克隆抗體 作競爭抗體，抗Fc受體的蛋白質(zhì)AG酶標(biāo)物作為二抗，配制血清稀釋 液、洗滌液、底物溶液A、底物溶液B、 H202、終止液，組裝組成。
本發(fā)明新一代布魯氏菌病抗體竟?fàn)嶦LISA檢測試劑盒，還有以下 技術(shù)特征
1.所述的抗原包被酶標(biāo)板是這樣制備的 (1 )包被無菌條件下，將凍干抗原用蒸餾水懸浮到凍干前的體積，用0.05MpH9. 6的碳酸緩沖液按1:1000稀釋，以lOOiil/孔， 包被聚苯乙烯96孔板，加蓋于4'C過夜；
(2 )洗滌以0. Olmol/L, pH值為7. 2的PBST作洗滌液，加 入足量室溫作用3分鐘后甩去，如上重復(fù)3次，或用洗板機(jī)重復(fù)洗3 次，拍干至無水印為止；
(3) 封閉用含1°/。牛血清白蛋白的0. 01mol/L, pH值為6. 3的 PBST按100ul/孔，加入至酶標(biāo)板中，37。C作用l小時，甩去，加入足 量洗滌液，室溫作用3分鐘后甩去，如上重復(fù)3次，或用洗板機(jī)重復(fù)洗 3次，拍干至無水印為止，自然干燥；
(4) 包裝將封閉好的酶標(biāo)板放于鋁箔袋中，加入lg包裝的 干燥劑，用真空包裝機(jī)將酶標(biāo)板包裝好，貼上標(biāo)簽。
2。所述的陽性對照血清的制備方法如下
(1) 制造用動物制備陽性血清的牛需要經(jīng)過實(shí)驗(yàn)室檢測，必須 是18月齡性成熟、健康牛，無小腸結(jié)腸炎耶氏菌、乙型副傷寒桿菌、 大腸桿菌0: 157感染，以及無繁殖系統(tǒng)感染等抗體陰性的健康牛；觀 察一周；
(2) 免疫原制備將布氏桿菌S1119. 3接種馬鈴薯浸液瓊脂扁 瓶，置37t:培養(yǎng)48小時，待形成一層菌落時，選取純凈扁瓶，吸棄凝 集水，用含0.5。/。苯酚的滅菌生理鹽水將菌苔洗下，傾入中性玻瓶中， 加甲醛溶液至終濃度為O. 2y。，置37'C振蕩滅活48小時，經(jīng)無菌檢驗(yàn)合 格，于4。C以20000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，取沉淀，用生理鹽水做IO
倍稀釋，用作免疫原。于2x: 8i:冰箱保存?zhèn)溆茫?br> (3) 免疫程序用免疫原按5ml/點(diǎn)分4點(diǎn)肌肉注射，免疫動 物，14日后，同法免疫一次，再14日后釆血，分離血清，用ELISA檢 測；血清OD450nm和陰性血清OD450nm的比值(P/N) 〉l方可大量釆血； 如檢驗(yàn)不合格，應(yīng)再加強(qiáng)免疫一次；
(4) 血清制造'以常規(guī)方法釆血，分離其血清，將其作為待 檢血清，用血清稀釋液作l: 2, 1: 4......1: 128稀釋，用質(zhì)控強(qiáng)陽性血清作參照進(jìn)行ELISA試驗(yàn)，取待檢血清OD650nm/質(zhì)控強(qiáng)陽性血清
OD650mn值4時的待檢血清稀釋度作為血清稀釋倍數(shù)，用血清稀釋液 對血清進(jìn)行稀釋；
(5) 分裝將血清用0.45jum的濾器進(jìn)行抽濾除菌，無菌條 件下加入硫柳汞和慶大霉素使其終濃度均為O. 02%以防腐，然后無菌 條件下定量分裝、凍干，貼上標(biāo)簽；
(6) 標(biāo)準(zhǔn)弱陽性血清制造將強(qiáng)陽性血清用血清稀釋液作 1: 1. 5稀釋。
3. 所述的陰性對照血清的制備方法如下
(1) 制造用動物同陽性對照血清的制造用動物；
(2) 血清制造以常規(guī)方法采血，分離其血清；
(3) 血清處理與分裝將血清用0.45inm的濾器進(jìn)行抽濾除菌， 無菌條件下加入硫柳汞和慶大霉素使其終濃度均為O. 02%以防腐，然 后無菌條件下定量分裝，貼上標(biāo)簽。
4. 所述的新型動物布魯氏菌病單克隆抗體制備方法如下
(1)雜交瘤細(xì)胞株的培養(yǎng)將雜交瘤細(xì)胞株從液氮中取出， 置于370C水洛中迅速融化，100Q轉(zhuǎn)/分鐘離心沉淀細(xì)胞，去掉凍存液， 加入10mlMEM培養(yǎng)基，分成兩個培養(yǎng)瓶于37'C二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)， 2-3天細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶底后，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)；
(2 )腹水新型單克隆抗體的制備按O. 5ml/只腹腔注射小鼠 降植烷，三天后，再按5X105-6/只的細(xì)胞濃度腹腔注射雜交瘤細(xì)胞， 約十天后產(chǎn)生腹水，每天釆一次，可連續(xù)釆2-3次，腹水取出后，3000 轉(zhuǎn)/min離心10min,收集上清并混合，于56。C水洛處理10分鐘，-80 "C凍存為半成品；
(3) 中間品檢驗(yàn)無菌檢驗(yàn)按"獸藥典"進(jìn)行，應(yīng)無菌生
長；
(4) 效價測定取出質(zhì)檢過的動物布魯氏菌病抗原包被酶標(biāo)板，每孔加入動物布魯氏菌病抗體竟?fàn)嶦LISA診斷試劑盒的樣品稀釋液
45ul，動物布魯氏菌病標(biāo)準(zhǔn)陰性血清5ul，力口2排孔，標(biāo)準(zhǔn)陽性血清5ul，
加2排孔，動物布魯氏菌病單克隆抗體以l: IO倍比稀釋，每個稀釋度 加2列，26'C孵育30分鐘.單克隆抗體效價為OD45o為0. 60至1. 80時的
單抗稀釋倍數(shù)；
(5)成品制備按效價檢測結(jié)果將單抗稀釋，分裝成0.2m1/ 瓶，密封瓶口，貼好標(biāo)簽，注明批次。
5.所述的血清稀釋液、洗滌液、底物溶液A、底物溶液B、 HA、終 止液是這樣配制的
(1) IO倍洗液(PBST)的配制
氯化鈉，8克；磷酸二氫鉀，0. 2克；磷酸氫二鈉(12H20) ， 6.2.9 克；加蒸僧水至100亳升，力PO. 5亳升吐溫20;調(diào)pH值7. 2, IO磅高壓 15分鐘；
(2) IO倍樣品稀釋液的配制
氯化鈉，8. 5克；磷酸二氫鉀，0. 2克；磷酸氫二鈉(12H20) ， 6.29 克；0. 5亳升吐溫20， EDTA， 5, 7克，加蒸餾水至100亳升，pH6. 3, 10磅高壓15分鐘；
(3) IO倍底物A溶液的配制
取檸檬酸4. 2g，醋酸鈉13. 5g,過氧化尿O. 5g，加去離子水100ml， 調(diào)pH值4， 0,過濾除菌；分裝1. 2ml/瓶分裝，密封瓶口，粘貼 標(biāo)簽；
(4) 底物B溶液的配制
取TMBO. 2192g, 二甲基亞砜20ml，室溫下溶解；分裝0. 2ml/ 瓶分裝于黑瓶，密封瓶口，粘貼標(biāo)簽；
(5) HA液的配制
分裝由美國VWR公司生產(chǎn)，0.2ml/瓶分裝于黑瓶，密封瓶口， 粘貼標(biāo)簽； '(6) IO倍終止液的配制
取55. 6毫升98%的濃硫酸加入80毫升水中，調(diào)至總體積100毫升；
分裝1.2亳升/瓶分裝于小瓶，密封瓶口，粘貼標(biāo)簽、批次。
實(shí)施例2，就本發(fā)明新一代布魯氏菌病抗體竟?fàn)幟嘎?lián)免疫吸附試 驗(yàn)檢測試劑盒的有關(guān)問題作如下說明
1關(guān)于菌種選擇及標(biāo)準(zhǔn)
菌種選擇及種子代數(shù)國內(nèi)外分離了很多布魯氏菌，有著不同的 血清型。目前我所保存和使用的布魯氏菌為牛型S1119. 3株，該菌株 為國際制備布魯氏菌病檢測抗原的標(biāo)準(zhǔn)菌株，該菌株易于培養(yǎng)，并且 不易發(fā)生粗變。凍干保存于-7(TC，保存期至少10年。
根據(jù)該細(xì)菌的遺傳穩(wěn)定性研究，細(xì)菌經(jīng)連續(xù)傳10代后，SLPS抗原 位點(diǎn)結(jié)構(gòu)更為穩(wěn)定。
2關(guān)于抗原制備
2.1細(xì)菌繁殖條件控制S1119. 3是國際制備檢測布魯氏菌病 抗原的標(biāo)準(zhǔn)菌株，生長過程中易于判定病菌增殖情況，且不易粗變。 但無論哪種血清型菌株，對人和動物都有一定的感染力，因此，細(xì)菌 繁殖必須在三級生物安全實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。
2.2細(xì)菌滅活將細(xì)菌滅活可以降低生產(chǎn)的生物安全風(fēng)險。研 究表明，布魯氏菌S1119. 3用0. 5%的石炭酸生理鹽水收獲細(xì)菌培養(yǎng)物， 裝于滅菌容器內(nèi)。加熱至8(TC維持90分鐘，殺死細(xì)菌滅活后，對提取 SLPS沒有影響。
2.3抗原純化、濃縮抗原的純度決定包被抗原實(shí)際含量和檢 測限度，因此，必須對抗原進(jìn)行提純；純化、濃縮的方法采用簡便易 行的常規(guī)法，利用布魯氏菌抗原sLPS可存在于有機(jī)相石炭酸中的特 性，再用醋酸鈉甲醛溶液沉淀抗原sLPS，用水透析，冷凍干燥抗原 sLPS。再經(jīng)超聲波裂解，從而獲得純化的抗原。
2.4效價測定提純抗原為用于包被酶標(biāo)板，需用抗sLPS的單克隆抗體測定測定抗原效價，根據(jù)試驗(yàn)研究，因?yàn)閱慰寺】贵w識別單一 抗原位點(diǎn)的專一性，按生產(chǎn)規(guī)程制備的抗原純度基本符合試劑盒要 求，但每批抗原的制造過程中SLPS的量不是確定不變的，所以每批抗
原均需進(jìn)行效價測定。使用經(jīng)過標(biāo)定的單克隆抗體，在抗原量足夠時,
其OD應(yīng)為1. 5 ~ 2. 0，這個顯色區(qū)間是ELISA最敏感，抗原量稍有變化， 其OD即迅速變化，抗原量小于標(biāo)準(zhǔn)時，OD值可能偏低，試驗(yàn)不靈敏， OD值偏高(大于3. 0),可能會出現(xiàn)超出酶標(biāo)儀的檢測范圍。
3關(guān)于新型單克隆抗體
3.1雜交瘤細(xì)胞株本竟?fàn)嶦LISA使用的單克隆抗體為抗SLPS
抗原位點(diǎn)的特異性單克隆抗體。雜交瘤細(xì)胞株釆用為純化滅活后的 sLPS免疫BalB/C小鼠，待小鼠脾細(xì)胞與SP2/0瘤細(xì)胞敲合后，篩選獲 得，經(jīng)鑒定為抗sLPS的特異單克隆抗體細(xì)胞株，經(jīng)實(shí)驗(yàn)鑒定，該細(xì)胞 與OIE公認(rèn)的新型單克隆抗體的特異性一致，其特點(diǎn)是不與酶標(biāo)記的 抗FC受體結(jié)合。目前保存于我公司，于液氣中保存，并有專人負(fù)責(zé)看 管。
3.2腹水新型單克隆抗體的處理用單克隆抗體細(xì)胞株注射小 鼠制備的單克隆抗體濃度很高，在使用時稀釋濃度較高，抗體經(jīng)過56 °C滅后，其中的活性酶類被滅活，用差速離心可去除腹水中的懸浮物， 經(jīng)過濾除菌后分裝即可測定效價使用。
4關(guān)于標(biāo)準(zhǔn)陰性血清和陽性血清制備陰性血清和陽性血清的 方法很多，相對而言用本動物制備效果最好，特異性更強(qiáng)。由于目前 國內(nèi)的動物多數(shù)被免疫不同的布魯氏菌疫苗，陰性血清釆自臨床健康 動物，除要求布魯氏菌抗體陰性外，要求無小腸結(jié)腸炎耶氏菌抗體、 乙型副傷寒桿菌抗體，大腸桿菌O: 157抗體，這樣更能反應(yīng)中國健康 動物的實(shí)際情況。用大劑量熱殺死的布魯氏菌多次免疫的方法制備陽 性血清，細(xì)菌種量和程序，免疫時間可根據(jù)實(shí)際檢驗(yàn)情況進(jìn)行。動物 感染布魯氏菌后，開始產(chǎn)生抗sLPS抗體，其抗體水平在30天左右達(dá)到 高峰，持續(xù)時間長；另外使用經(jīng)無菌過濾的確診診斷自然感染布魯氏 菌動物的血清，也有利于反應(yīng)中國動物的實(shí)際感染情況。根據(jù)OIE制 訂的陽性血清的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及中國的具體情況進(jìn)行，從而保證用布魯氏菌所制備的抗體及將陽性血清作為標(biāo)準(zhǔn)對照血清的準(zhǔn)確性。
標(biāo)準(zhǔn)陽性血清是試劑盒中驗(yàn)證EUSA試驗(yàn)操作是否正確，反應(yīng)是 否特異的一個重要成分，也是反應(yīng)該試劑合是否工作的指標(biāo)。根據(jù)動
物布魯氏菌病抗體竟?fàn)嶦LISA試驗(yàn)的靈敏性試驗(yàn)研究，標(biāo)準(zhǔn)陽性血清 對新型單抗的竟?fàn)幰种坡式咏?00%，完全顯色，在實(shí)驗(yàn)階段OD值從沒 超過1.80。標(biāo)準(zhǔn)陰性血清對單抗沒有竟?fàn)幰种疲捎谘宓挠绊?，?竟?fàn)嶦LISA實(shí)驗(yàn)中其OD值就略小于空白對照?？瞻讓φ?，在新型竟?fàn)?ELISA實(shí)驗(yàn)中其OD值為O. 05-0. 50。
5關(guān)于臨界值(cutoff)的確定，確定陰陽性限值是決定檢測 結(jié)果準(zhǔn)確性非常重要的指標(biāo)，本實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)用制備的竟?fàn)嶦LISA試劑 盒檢測了解30份布魯氏菌病準(zhǔn)陰性血清，37份免疫動物布魯氏菌血清 及16份0IE陽性血清，應(yīng)用國際上OIE已確認(rèn)準(zhǔn)確性的CELISA試劑盒， 檢測結(jié)果進(jìn)行比對，確定了陽性率在20%以上。理論上檢測限應(yīng)為檢 測大量的陰性血清樣品，進(jìn)行陽性率分布研究，以排除非特異性反應(yīng) 影響特異性，但在實(shí)際工作上，難以得到大量的確定陰性樣品，只能 通過和其他的檢測試劑進(jìn)行比對來確定，本實(shí)驗(yàn)中檢測的30份確定陰 性樣品其陽性率在20%以下。
6關(guān)于特異性檢驗(yàn)特異性是確定診斷結(jié)果準(zhǔn)確與否的重要指 標(biāo)之一。為驗(yàn)證其特異性，用OIE標(biāo)準(zhǔn)陽性血清、標(biāo)準(zhǔn)陰性血清、陰 性參考血清、免疫血清作樣品檢測動物布魯氏菌病抗體競爭酶聯(lián)免疫 吸附試驗(yàn)檢測試劑盒的陰性檢出率，結(jié)果為100%。用乙型副傷寒桿 菌、小腸結(jié)腸炎耶氏菌、大腸桿菌0:157陰、陽性血清進(jìn)行試劑盒的 陰性檢出率檢測，結(jié)果為96.5%。試驗(yàn)結(jié)果表明，動物布魯氏菌病抗 體竟?fàn)嶦LISA檢測試劑盒具有較高的特異性。
7關(guān)于敏感性檢驗(yàn)ELISA是目前檢測抗布魯氏菌病抗體最敏 感的方法之一，由于有交叉反應(yīng)，疫苗型抗體的存在，這使血清學(xué)檢 測方法很難區(qū)分診斷。特別是我國大規(guī)模強(qiáng)制免疫動物，疫苗型抗體 與自然感染抗體的區(qū)分，必須借助抗體檢測竟?fàn)嶦LISA方能區(qū)分并最 后確診魯氏菌病，減少誤診，避免經(jīng)濟(jì)損失。在選用間接ELISA篩選 診斷的基礎(chǔ)上，釆用竟?fàn)嶦LISA對被檢樣品進(jìn)行確診診斷。研究過程中16份0IE標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和37份人工感染血清進(jìn)行檢測，陽性檢出率 達(dá)96.23%。取5份國際標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，用生理鹽水分別作系列倍比稀 釋，分別做竟?fàn)嶦LISA、間接ELISA、虎紅平板凝集試驗(yàn)和補(bǔ)體結(jié)合試 驗(yàn)，其中竟?fàn)嶦LISA試驗(yàn)釆用3個不同批次的試劑盒進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果顯 示競爭ELISA試驗(yàn)與間接ELISA試驗(yàn)相同，血清最大稀釋度達(dá)l: 5120，
檢測靈敏性遠(yuǎn)高于虎紅平板凝集實(shí)驗(yàn)和補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗(yàn)。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果 能夠表明制備的動物布魯氏菌病抗體竟?fàn)嶦LISA檢測試劑盒檢測敏感 性達(dá)到國際OIE水平，填補(bǔ)了國內(nèi)'空白。
8關(guān)于用法與判定試驗(yàn)方法與試驗(yàn)結(jié)果密切相關(guān)，正確的操作 和恰當(dāng)?shù)呐卸ú拍艿贸稣_的結(jié)果，ELISA是非常敏感的檢測方法， 往往因?yàn)閷?shí)驗(yàn)操作不當(dāng)造成檢測結(jié)果差異很大，因此對用法與結(jié)果判
定方法也做出具體規(guī)定試劑盒在使用前應(yīng)恢復(fù)至室溫，因冰冷的診 斷試劑加入到酶標(biāo)板上需要時間才能使反應(yīng)條件達(dá)到18 28T，這樣
就造成實(shí)際反應(yīng)時間不足，影響抗原抗原結(jié)合。在洗板機(jī)操作條件下， 4次洗板就足夠。結(jié)果計(jì)算中，設(shè)計(jì)了兩個陰陽性及空白對照以計(jì)算 平均值，檢測試驗(yàn)的準(zhǔn)確性。陽性百分率的計(jì)算方法為國際上通用的 計(jì)算方法。
9關(guān)于注意事項(xiàng)因?yàn)镋LISA檢測試劑盒中的成分均為生物活性 成分，其中的抗體等又都是蛋白成分，在室溫下及頻繁升降溫能夠造 成蛋白變性從而影響試劑盒的檢測效果，所以必須按要求存放使用； 另外，試劑盒中的顯色劑及終止液均含有對人有害的化學(xué)物質(zhì)，實(shí)驗(yàn) 中應(yīng)避免皮膚接觸。
10關(guān)于穩(wěn)定性、貯存和有效期在進(jìn)行保存期研究時，分別將 布魯氏菌病抗體竟?fàn)嶦LISA檢測試劑盒放置于2 ~ 8 °C 、室溫和37 °C ，
每隔一定時間取幾條包被好的酶標(biāo)板條進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果表明檢測試劑 盒在2 8'C保存12個月，室溫保存6個月，37X:保存9曰，其物理性狀， 檢測特異性及靈敏性均不受影響，因此，我們將保存期規(guī)定為2 8 'C保存，有效期1年。
實(shí)施例3，診斷布魯氏菌病的初級結(jié)合試驗(yàn)，包括熒光偏振檢測 和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)。熒光偏振法是一種均相法，不需要除去未結(jié)合試劑，操作速度快，兩分鐘便得到結(jié)果，可以消除一些疫苗反應(yīng)。它 既可以用于實(shí)驗(yàn)室檢測，也可以運(yùn)用于牧場和野外，適合野生動物布 魯氏菌病的檢測。FPA的敏感性高，是優(yōu)秀的篩選試驗(yàn)。價格相對低 廉，準(zhǔn)確度與其它的初級結(jié)合試驗(yàn)一樣。這種類型的測定，也適合自 動化。它的原理是測量分子反應(yīng)率變化，這種改變是由于在試驗(yàn)樣品 中抗體與可溶性抗原反應(yīng)引起。如果抗體結(jié)合抗原，抗原的旋轉(zhuǎn)率將
下降，則可測量這種反應(yīng)。FPA的基本原理是分子在溶液中旋轉(zhuǎn)隨機(jī)
利率與其大小成反比(小分子旋轉(zhuǎn)快速，較大的分子更慢)。如果一 個小分子通過依附在一個更大的分子上使其變大，就可以測量小分子
的旋轉(zhuǎn)速度變化。FPA使用的是通過水解特異多糖再標(biāo)記熒光制備的 抗原。這種分子的平均相對分子質(zhì)量為22kD ,使其遠(yuǎn)小于分子量為 160kD的抗體分子(如IgG抗體)。FPA的操作方法中，可在玻璃管或96 孔板內(nèi)稀釋血清、血液或牛奶后，使用FPA分析儀去掉本底的熒光讀 數(shù)。這個讀數(shù)被存儲并且在以后的讀值中減去它。FPA分析儀通過偏 振光通過特定的角度測量分子的轉(zhuǎn)動速度。然后加入熒光標(biāo)記的特異 多糖抗原，混合后，孵育2分鐘(血清或牛奶；全血孵育15秒)，最后 用分析儀讀取最終數(shù)值。如果在被驗(yàn)樣品有抗體，抗原分子的旋轉(zhuǎn)時 間增加，導(dǎo)致較高的亳偏振單位(mP)讀數(shù)。毫偏振單位(mP)讀數(shù)
的大小與抗體存在的數(shù)量成比例。
兩種類型的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)用于對抗體的檢測。它們是間接酶 聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和竟?fàn)幟嘎?lián)免疫吸附試驗(yàn)。間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)， 以抗體結(jié)合在固相上，用一種能與所選擇的或所有同種型的抗體結(jié)合 的酶標(biāo)記試劑的反應(yīng)。因?yàn)橐呙缈贵w也可能用這個法檢測到，所以 它主要是用來作為篩選試驗(yàn)。它有幾個優(yōu)點(diǎn)，包括自動化、商業(yè)供貨、 準(zhǔn)確性、相對短的檢驗(yàn)時間、相對便宜等適應(yīng)性。間接酶聯(lián)免疫吸附 試驗(yàn)(IELISA')用于檢測平滑或粗糙型布魯氏菌產(chǎn)生的抗體，可用于 大部分哺乳動物。此檢驗(yàn)法可在90分鐘內(nèi)完成也可作為優(yōu)秀的篩選 試驗(yàn)，用于實(shí)驗(yàn)室檢測。它的敏感性最高，主要有于布魯氏菌菌病的 消除計(jì)劃。
快速間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(RIELISA),用于檢測平滑或粗糙型 布魯氏菌產(chǎn)生的抗體，可用于大部分哺乳動物。此檢驗(yàn)法可在15分鐘內(nèi)完成可作為優(yōu)秀的篩選試驗(yàn)，最大優(yōu)點(diǎn)是可以在牧場、田間操作、 快捷。
奶液間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(MIELISA)，用于檢測反芻動物奶水 內(nèi)的布魯氏菌抗體，此常規(guī)檢測法可測出平滑型布魯氏菌在牛羊奶內(nèi) 的抗體。耗時90分鐘，為作為混合奶樣品的篩選試驗(yàn)。因?yàn)闄z測動 物的奶液可以用于布魯氏菌病的監(jiān)測，同時也減少了對產(chǎn)奶動物的刺 激。
竟?fàn)幟嘎?lián)免疫吸附試驗(yàn)使用單克隆抗體與檢驗(yàn)樣品中的抗體竟 爭。它不僅具有間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)屬性，且有選擇合適的親和力 競爭抗體用以消除由于疫苗和交叉反應(yīng)的抗體引起的血清學(xué)反應(yīng)。竟 爭酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(CELISA)，用于檢測平滑型布魯氏菌產(chǎn)生的抗 體，適用于人和幾乎全部動物。此檢測法以高敏感度的單克隆抗體為 基礎(chǔ)，是很好的最后布魯氏菌病的確診試驗(yàn)，也是用于區(qū)分疫苗免疫 和野毒感染的唯一方法。
權(quán)利要求
1.一種新一代布魯氏菌病抗體競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測試劑盒，其特征在于它是利用平滑型布魯氏菌的脂多糖作抗原包被酶標(biāo)板，用滅活菌液免疫健康?；蛉斯じ腥窘】蹬Ｖ苽潢栃詫φ昭?、標(biāo)準(zhǔn)弱陽性血清，用健康非免疫牛血清作陰性對照血清，用新型單克隆抗體作競爭抗體，抗Fc受體的蛋白質(zhì)AG酶標(biāo)記物為二抗，配制血清稀釋液、洗滌液、底物溶液A、底物溶液B、H202、終止液，組裝組成。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種新一代布魯氏菌病抗體竟?fàn)幟嘎?lián) 免疫吸附試驗(yàn)檢測試劑盒，其特征在于所述的抗原包被酶標(biāo)板是這 樣制備的(1 )包被無菌條件下，將凍干抗原用蒸餾水懸浮到凍干前 的體積，用0. 05MpH9. 6的碳酸緩沖液按1: 1000稀釋，以100nl/孔， 包被聚苯乙烯96孔板，加蓋于4'C過夜；(2 )洗滌以0. 01mol/L， pH值為7. 2的PBST作洗滌液，加 入足量室溫作用3分鐘后甩去，如上重復(fù)3次，或用洗板機(jī)重復(fù)洗3 次，拍干至無水印為止；(3) 封閉用含l。/。牛血清白蛋白的0.01mol/L，pH值為6. 3的 PBST按100ul/孔，加入至酶標(biāo)板中，37。C作用l小時，甩去，加入足 量洗滌液，室溫作用3分鐘后甩去，如上重復(fù)3次，或用洗板機(jī)重復(fù)洗 3次，拍干至無水印為止，自然干燥；(4) 包裝將封閉好的酶標(biāo)板放于鋁箔袋中，加入lg包裝的 干燥劑，用真空包裝機(jī)將酶標(biāo)板包裝好，貼上標(biāo)簽。
3. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種新一代布魯氏菌病抗體竟?fàn)幟嘎?lián) 免疫吸附試驗(yàn)檢測試劑盒，其特征在于所述的陽性對照血清的制備 方法如下 .U)制造用動物制備陽性血清的牛需要經(jīng)過實(shí)驗(yàn)室檢測，必須 是18月齡性成熟、健康牛，無小腸結(jié)腸炎耶氏菌、乙型副傷寒桿菌、 大腸桿菌0: 157感染，以及無繁殖系統(tǒng)感染等抗體陰性的健康牛，觀 察一周；(2)免疫原制備將布氏桿菌S1119. 3接種馬鈴薯浸液瓊脂扁 瓶，置37'C培養(yǎng)48小時，待形成一層菌落時，選取純凈扁瓶，吸棄凝 集水，用含O. 5%苯酚的滅菌生理鹽水將菌苔洗下，傾入中性玻瓶中， 加甲醛溶液至終濃度為O. 2%,置37。C振蕩滅活48小時，經(jīng)無菌檢驗(yàn)合 格，于4。C以20000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，取沉淀，用生理鹽水做IO 倍稀釋，用作免疫原，于2匸 8匸冰箱保存?zhèn)溆茫?3) 免疫程序用免疫原按5ml/點(diǎn)分4點(diǎn)肌肉注射，免疫動物， 14日后，同法免疫一次，再14日后釆血，分離血清，用ELISA檢測， 血清OD450mn和陰性血清OD450mn的比值(P/N) >1方可大量釆血，如檢 驗(yàn)不合格，應(yīng)再加強(qiáng)免疫一次；(4) 血清制造以常規(guī)方法采血，分離其血清，將其作為待 檢血清，用血清稀釋液作l: 2， 1: 4...…l: 128稀釋，用質(zhì)控強(qiáng)陽 性血清作參照進(jìn)行ELISA試驗(yàn)，取待檢血清OD650咖/質(zhì)控強(qiáng)陽性血清 OD650nm值^時的待檢血清稀釋度作為血清稀釋倍數(shù)，用血清稀釋液 對血清進(jìn)行稀釋；(5) 分裝將血清用0.45iam的濾器進(jìn)行抽濾除菌，無菌條 件下加入硫柳汞和慶大霉素使其終濃度均為O. 02%以防腐，然后無菌 條件下定量分裝、凍干，貼上標(biāo)簽；(6) 標(biāo)準(zhǔn)弱陽性血清制造將強(qiáng)陽性血清用血清稀釋液作 1: 1. 5稀釋。
4.根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種新一代布魯氏菌病抗體競爭酶聯(lián) 免疫吸附試驗(yàn)檢測試劑盒，其特征在于所述的陰性對照血清的制備 方法如下(1) 制造用動物同陽性對照血清的制造用動物；(2) 血清制造以常規(guī)方法釆血，分離其血清；(3) 血清處理與分裝將血清用0.45nm的濾器進(jìn)行抽濾除菌， 無菌條件下加入硫柳汞和慶大霉素使其終濃度均為O. 02%以防腐，然 后無菌條件下定量分裝，貼上標(biāo)簽。
5.根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種新一代布魯氏菌病抗體竟?fàn)幟嘎?lián) 免疫吸附試驗(yàn)檢測試劑盒，其特征在于所述的新型動物布魯氏菌病單克隆抗體制備方法如下(1)雜交瘤細(xì)胞株的培養(yǎng)將雜交瘤細(xì)胞株從液氮中取出， 置于37攝氏度水浴中迅速融化，1000轉(zhuǎn)/分鐘離心沉淀細(xì)胞，去掉凍 存液，加入10mlMEM培養(yǎng)基，分成兩個培養(yǎng)瓶于37'C二氧化碳培養(yǎng)箱 中培養(yǎng)，2-3天細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶底后，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)；(2) 腹水新型單克隆抗體的制備按O. 5ml/只腹腔注射小鼠 降植烷，三天后，再按5X105-6/只的細(xì)胞濃度腹腔注射雜交瘤細(xì)胞，約十天后產(chǎn)生腹水，每天釆一次，可連續(xù)釆2-3次，腹水取出后，3000 轉(zhuǎn)/min離心10min,收集上清并混合，于56。C水洛處理10分鐘，-80 'C凍存為半成品；(3) 中間品檢驗(yàn)無菌檢驗(yàn)按"獸藥典"進(jìn)行，應(yīng)無菌生長；(4) 效價測定取出質(zhì)檢過的動物布魯氏菌病抗原包被酶標(biāo)板， 每孔加入動物布魯氏菌病抗體竟?fàn)嶦LISA診斷試劑盒的樣品稀釋液 45ul，動物布魯氏菌病標(biāo)準(zhǔn)陰性血清5ul,加2排孔，標(biāo)準(zhǔn)陽性血清5ul， 加2排孔，動物布魯氏菌病單克隆抗體以l: IO倍比稀釋，每個稀釋度 加2列，26'C孵育30分鐘，單克隆抗體效價為OD450為0. 60至1. 80時 的單抗稀釋倍數(shù)；(5) 成品制備按效價檢測結(jié)果將單抗稀釋，分裝成0.2m1/ 瓶，密封瓶口，貼好標(biāo)簽，注明批次。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于提供一種滿足我國動物防疫需求、敏感、特異、能夠準(zhǔn)確診斷布魯氏菌病的新一代布魯氏菌病抗體競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測試劑盒。它是利用平滑型布魯氏菌的脂多糖作抗原包被酶標(biāo)板，用滅活菌液免疫健康?；蛉斯じ腥窘】蹬Ｖ苽潢栃詫φ昭?、標(biāo)準(zhǔn)弱陽性血清，用健康非免疫牛血清作陰性對照血清，用新型單克隆抗體作競爭抗體，抗Fc受體的蛋白質(zhì)AG酶標(biāo)物作為二抗，配制血清稀釋液、洗滌液、底物溶液A、底物溶液B、H₂O₂、終止液，組裝組成。本發(fā)明是一種敏感、特異、能夠準(zhǔn)確診斷布魯氏菌病的競爭ELISA試劑盒，本發(fā)明滿足我國動物防疫的需求，借助實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)對布魯氏菌病進(jìn)行最后確診。
文檔編號G01N33/569GK101581726SQ20091007163
公開日2009年11月18日 申請日期2009年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月26日
發(fā)明者張曉艷 申請人:張曉艷