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專利名稱：胎兒細(xì)胞和核酸的鑒定和分離的制作方法
胎兒細(xì)胞和核酸的鑒定和分離本申請(qǐng)要求2007年9月21日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No. 60/974，392的優(yōu)先權(quán)，在 此完整引入以供參考。
背景技術(shù)：
通常進(jìn)行產(chǎn)前測(cè)試或篩選以在妊娠期間確定胎兒性別或檢測(cè)胎兒中的遺傳疾病 和/或染色體異常。如今，已了解一或多種有缺陷的基因?qū)е碌挠?000種遺傳疾病。一些 例子包括囊性纖維變性、亨廷頓氏舞蹈病、β型地中海貧血、強(qiáng)直性肌營(yíng)養(yǎng)不良、鐮狀細(xì)胞 貧血、嚇啉病、和脆性X染色體綜合征。染色體異常是由染色體數(shù)異常、染色體質(zhì)重復(fù)或缺 失、以及染色體結(jié)構(gòu)缺陷導(dǎo)致的。染色體異常的例子有三體性，例如16三體性，在妊娠期頭 三個(gè)月導(dǎo)致流產(chǎn)的主要原因；21三體性(唐氏綜合征)；13三體性(帕塔綜合征)；18三體 性(愛德華綜合征)；克萊恩費(fèi)爾特(氏)綜合征((47、ΧΧΥ)、(47,XYY)、和(47、ΧΧΧ))；染 色體缺失(單體性)，例如特納綜合征(45、Χ0)；染色體易位、缺失和/或微缺失，例如羅伯 遜易位、Angelman綜合征、迪喬治綜合征和午-希二氏綜合征。目前可行的產(chǎn)前遺傳測(cè)試通常涉及侵入性方法。例如，在懷孕10-12周左右的孕 婦上進(jìn)行的絨毛膜絨毛采樣(CVS)和在14-16周左右進(jìn)行的羊膜穿刺都包括侵入性方法， 以獲得用于測(cè)試胎兒內(nèi)染色體異常的樣品。一般用細(xì)胞遺傳學(xué)或熒光原位雜交(FISH)分 析測(cè)試通過這些采樣過程獲得的胎兒細(xì)胞以測(cè)試染色體異常。雖然這些方法對(duì)于檢測(cè)染色體畸變是有用的，但是已顯示它們會(huì)引起流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)。 因此，僅僅會(huì)對(duì)察覺危險(xiǎn)增加的婦女，例如高齡孕婦(> 35歲)、具有異常母體血清篩選結(jié) 果的或那些先前已經(jīng)有過胎兒染色體異常的婦女建議羊膜穿刺或CVS。由于這些測(cè)試，35 歲以上的婦女生出患有染色體畸變，例如唐氏綜合征的嬰兒的百分比大大下降了。然而，缺 乏對(duì)于大多數(shù)孕婦的合適或相對(duì)安全的產(chǎn)前測(cè)試或篩選導(dǎo)致了 35歲下婦女中約80%的唐 氏綜合征嬰兒的出生。因此，需要一種對(duì)于孕婦普遍人群的非侵襲性篩選測(cè)試，特別是針對(duì)鑒定胎兒染 色體畸變和其它遺傳變異或缺陷的測(cè)試。這需要非侵襲性的檢測(cè)、分離可用于產(chǎn)前遺傳篩 選的胎兒細(xì)胞和胎兒核酸的技術(shù)。發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明部分基于核小體表位可用于胎兒細(xì)胞或胎兒核酸的標(biāo)記的發(fā)現(xiàn)。因此，本 發(fā)明提供了針對(duì)這些核小體表位的抗體，含有這些抗體的試劑盒，以及用這些抗體檢測(cè)或 分離胎兒細(xì)胞和/或胎兒核酸的方法。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，提供了一種特異性結(jié)合胎兒核小體表位的抗體。在本 發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，提供了含有本發(fā)明抗體的試劑盒。在本發(fā)明的還有一個(gè)實(shí)施例中，提供了適用于測(cè)試胎兒遺傳組成的試劑盒。該試 劑盒含有分離的胎兒核酸樣品，該樣品是用本發(fā)明的抗體分離的。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，提供了一種在胎兒的母體獲得的生物樣品中檢測(cè)胎 兒核酸和/或胎兒細(xì)胞存在的方法。該方法包括使生物樣品與本發(fā)明的抗體接觸，并檢測(cè) 抗體與生物樣品中核小體的結(jié)合?？贵w與核小體的特異性結(jié)合說明胎兒核酸和/或胎兒細(xì)胞的存在。在本發(fā)明的還有一個(gè)實(shí)施例中，提供了分離胎兒的核酸的方法。該方法包括通過 使從胎兒母體獲得的宮頸粘液樣品與本發(fā)明的抗體接觸，分離核酸。在本發(fā)明的還有一個(gè)實(shí)施例中，提供了富集胎兒核酸的方法。該方法包括通過使 獲自胎兒母體的宮頸粘液樣品與本發(fā)明的抗體接觸，分離核酸。在本發(fā)明的還有一個(gè)實(shí)施例中，提供了鑒定胎兒遺傳組成的方法。該方法包括根 據(jù)本發(fā)明的方法分離胎兒核酸，并基于分離的胎兒核酸鑒定遺傳組成。在還有一個(gè)實(shí)施例中，提供了一種組合物，含有一種肽和佐劑，該肽含有與SEQ ID NO 1的序列具有至少80%相同性的氨基酸序列。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，提供了制備與胎兒核小體表位特異性結(jié)合的抗體的 方法。該方法包括用含有肽和佐劑的組合物免疫動(dòng)物，該肽含有與SEQ IDNO 1的序列具有 至少80%相同性的氨基酸序列。發(fā)明詳述本發(fā)明部分基于核小體表位可用于胎兒細(xì)胞或胎兒核酸的標(biāo)記的發(fā)現(xiàn)。因此，本 發(fā)明提供了針對(duì)這些核小體表位的抗體，含有這些抗體的試劑盒，以及用這些抗體檢測(cè)或 分離胎兒細(xì)胞和/或胎兒核酸的方法。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種與胎兒核小體表位特異性結(jié)合的抗體。本文 所用的術(shù)語(yǔ)“抗體”包括抗體結(jié)合區(qū)、CDR、單鏈抗體、嵌合抗體或人源化抗體。本發(fā)明的抗 體可以是單克隆抗體或多克隆抗體。所述抗體可以是任何同工型，例如IgG、IgM、IgA、IgD、 或 IgE0在一個(gè)實(shí)施例中，胎兒核小體表位可以是任何與獨(dú)特的胎兒染色質(zhì)或胎兒核小體 有關(guān)的表位，或與對(duì)應(yīng)母體表位不同的表位。在另一個(gè)實(shí)施例中，胎兒核小體表位具有與對(duì) 應(yīng)母體表位不同的分子結(jié)構(gòu)(例如一級(jí)、二級(jí)或三級(jí))。在另一個(gè)實(shí)施例中，胎兒核小體中 的胎兒核小體表位比母體核小體中的表位更暴露于、或更容易接觸抗體。在真核細(xì)胞中，有五大類組蛋白，它們是染色質(zhì)的主要蛋白質(zhì)組成。這些是Hl (有 時(shí)稱作接頭組蛋白)、H2A、H2B、H3和H4。一般H2A、H2B、H3和H4組蛋白兩兩裝配，通過 使146堿基對(duì)的DNA繞蛋白質(zhì)軸包裹，形成八聚體核小體核心顆粒。接頭組蛋白Hl和接頭 DNA像把珠穿在線上一樣連接各個(gè)核小體。H3類組蛋白包括四種不同蛋白質(zhì)類型主要類 型H3. 1和H3. 2，替換型H3. 3，和睪丸特異性變體H3t。雖然H3. 1和H3. 2密切相關(guān)，僅在 Ser96處不同，但H3. 1和H3. 3至少有5個(gè)氨基酸位點(diǎn)不同。另外，與在成年組織，包括肝 臟、腎臟和心臟中的存在相比，H3. 1在胎肝中高度富集。在成人組織中，H3. 3變體比H3. 1 變體更多，而對(duì)胎肝正相反。這些不同可被本發(fā)明的抗體所用，以在同時(shí)含有胎兒和母體細(xì) 胞和/或胎兒核酸的母體生物樣品中檢測(cè)胎兒細(xì)胞和/或胎兒核酸。因此，胎兒核小體表位可以是與組蛋白有關(guān)的表位。在一個(gè)實(shí)施例中，胎兒核小體 表位是與組蛋白H3有關(guān)的表位。在另一個(gè)實(shí)施例中，胎兒核小體表位是與組蛋白H3. 1有 關(guān)的表位。在另一個(gè)實(shí)施例中，胎兒核小體表位是與組蛋白H3. 1有關(guān)，但與組蛋白H3. 3無 關(guān)的表位。在另一個(gè)實(shí)施例中，胎兒核小體表位包含或由一表位構(gòu)成，該表位具有氨基酸序 列Ser-Ala-Val-Met-Ala-Leu-Gln-Glu-Ala-Cys (SEQ ID NO :1)。在另一個(gè)實(shí)施例中，胎兒 核小體表位包括或由一表位構(gòu)成，該表位具有SEQ ID N0:1的氨基酸序列中的2、3、4、5、6、7、8、9、或10個(gè)氨基酸殘基。在另一個(gè)實(shí)施例中，胎兒核小體表位包含或由一表位構(gòu)成，該 表位在含有與SEQ ID NO :1的氨基酸序列具有至少70%、至少80%或至少90%相同性的 氨基酸序列的肽內(nèi)。在另一個(gè)實(shí)施例中，胎兒核小體表位是與組蛋白H3. 1有關(guān)的表位，包 含或由一表位構(gòu)成，該表位在具有SEQ ID NO :1的氨基酸序列的肽內(nèi)。本發(fā)明的抗體包括 與特異性結(jié)合于具有氨基酸序列SEQ ID NO 1的肽內(nèi)的表位的那些抗體。本發(fā)明的抗體還可以針對(duì)組蛋白，特別是組蛋白H3. 1的特異性構(gòu)象或結(jié)構(gòu)特征。 例如，胎兒核小體表位可以是與組蛋白3. 1的一個(gè)區(qū)域有關(guān)的表位，該區(qū)域在胎兒核小體 中與母體核小體中對(duì)應(yīng)的H3. 1相比更暴露。也可利用胎兒和母體H3組蛋白中發(fā)生的翻譯 后修飾(例如甲基化或乙?；?的不同來靶向要檢測(cè)的胎兒H3. 1，以檢測(cè)、富集和/或分離 胎兒DNA。也可用兩組抗體分離胎兒核酸，一組設(shè)計(jì)成與特異性組蛋白構(gòu)象或序列結(jié)合，第 二組設(shè)計(jì)成與翻譯后修飾結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施例中，胎兒核小體表位不包括與含有翻譯后修飾的組蛋白(例如組蛋 白H3或H3. 1)有關(guān)的表位。在另一個(gè)實(shí)施例中，胎兒核小體表位不包括與含有翻譯后磷酸 化、甲基化或乙酰化的氨基酸的組蛋白(例如H3或H3. 1)有關(guān)的表位。在另一個(gè)實(shí)施例 中，胎兒核小體表位不包括與含有翻譯后磷酸化的色氨酸(“S”)殘基或翻譯后被甲基化 或乙酰化的賴氨酸(“K”)或精氨酸(“R”)殘基的組蛋白(例如組蛋白H3或H3. 1)有關(guān) 的表位。在另一個(gè)實(shí)施例中，胎兒核小體表位不包括與含有甲基化的N-末端4位賴氨酸 (“K4”)，甲基化或乙?；?位賴氨酸殘基(“K9”)，或磷酸化的10位色氨酸(“S10”) 的組蛋白(例如組蛋白H3或H3. 1)有關(guān)的表位。一般來說，本發(fā)明的抗體含有可檢測(cè)的部分(例如標(biāo)記)。本領(lǐng)域存在許多可檢 測(cè)的標(biāo)記，而且本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知標(biāo)記方法?？捎糜诒景l(fā)明的一般標(biāo)記類型包括但不限 于，放射性同位素、熒光、化學(xué)發(fā)光和生物發(fā)光分子、生色團(tuán)、酶、酶底物、酶的輔因子、酶抑 制劑、生色團(tuán)、染料、金屬離子、金屬液膠、配體(例如生物素、親和素、鏈霉親和素、地高辛 或半抗原)等?？蓹z測(cè)的標(biāo)記包括那些發(fā)熒光的標(biāo)記，包括能在可檢測(cè)范圍內(nèi)顯示熒光的 那些物質(zhì)或其部分。可用于本發(fā)明的標(biāo)記的具體例子包括但不限于，放射性標(biāo)記，包括但不限于1251、 mI、35S、32P、14C和3H;化學(xué)發(fā)光物質(zhì)，包括但不限于魯米諾、異氨基苯二酰胼、theromatic吖 啶酯(theromatic acridinium ester)、咪唑、吖啶鹽和草酸酯；生物發(fā)光化合物，包括但不 限于熒光素、熒光酶、和水母素；熒光物質(zhì)，包括但不限于熒光素、FITC、羅丹明、藻紅蛋白、 藻藍(lán)蛋白、別藻藍(lán)蛋白、鄰苯二醛、得克薩斯紅、丹磺酰氯、二氯三吖嗪基胺熒光素、綠色熒 光蛋白、和熒光胺；酶，包括但不限于β-葡糖醛酸酶、β-D-糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶、 脲酶、過氧化酶(例如辣根過氧化酶(HRP))、堿性磷酸酶、乙酰膽堿酯酶、葡萄糖氧化酶、 己糖激酶和鳥苷二磷酸酶、核糖核酸酶、熒光酶、磷酸果糖激酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、天 冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、磷酸烯醇丙酮酸脫羧酶、α-磷酸甘油、天冬酰胺酶(aspariginase)、葡萄 糖-6-磷酸脫氫酶、葡萄糖淀粉酶、和β -內(nèi)酰胺酶。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的抗體被熒光標(biāo)記。在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的抗體是 熒光標(biāo)記的，而且抗體與胎兒細(xì)胞或胎兒核酸的特異性結(jié)合可通過流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法，例如 通過熒光激活細(xì)胞分揀(FACS)檢測(cè)。在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的抗體固定在固相載體上?？贵w可直接或間接(例如通過接頭)固定在固相載體上。使抗體結(jié)合于固相載體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的， 可使用任何已知或?qū)戆l(fā)現(xiàn)的方法。在一個(gè)實(shí)施例中，固相載體是一群磁性顆粒、柱(例如 樹脂柱)中的顆粒、微通道的表面、微孔、平板、陣列、濾器、膜或載玻片。在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的抗體可以被固定、或涂布在裝置(例如微流裝置)表 面。示范性的微流裝置包括注入裝置、流出裝置和在注入裝置和流出裝置之間延伸的微通 道排列。微通道排列可以是任何為生物樣品提供隨機(jī)流徑的微通道。例如，微通道排列可 包括多條整合在微通道基面上并從其伸出的橫向分隔柱。所述柱通常排列成能夠提供隨機(jī) 化流徑的模式。微流裝置的例子如美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)11/458，668和11/331，988所述，兩者都 在此完整弓丨入以供參考?？捎帽景l(fā)明的抗體部分或完全涂布微流裝置的微通道排列表面。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了含有本發(fā)明抗體的試劑盒。在一個(gè)實(shí)施例中，試 劑盒還包括使用試劑盒檢測(cè)來自母體生物學(xué)樣品的胎兒細(xì)胞或胎兒核酸的說明書。在一些 實(shí)施例中，試劑盒包括涂布有本發(fā)明抗體的微流裝置或其它固相。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了適用于測(cè)試胎兒遺傳組成的試劑盒。該試劑盒 包含使用本發(fā)明抗體分離或富集的胎兒的分離或富集的核酸樣品。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了檢測(cè)胎兒母體獲得的生物學(xué)樣品中胎兒核酸存 在的方法。該方法包括使生物學(xué)樣品與本發(fā)明抗體接觸，并檢測(cè)抗體與生物學(xué)樣品中核小 體的結(jié)合?？贵w與核小體的特異性結(jié)合表明了胎兒細(xì)胞的存在。所述生物學(xué)樣品可以是任何母體生物學(xué)樣品，例如體液或其組分，其可能含有胎 兒細(xì)胞或胎兒核酸。在一個(gè)實(shí)施例中，生物學(xué)樣品是血液、血漿、血清、尿、宮頸粘液、羊水、 絨毛膜絨毛樣品、或其組分。在另一個(gè)實(shí)施例中，生物學(xué)樣品是血液、血漿、血清、尿或其組 分。在另一個(gè)實(shí)施例中，生物學(xué)樣品是宮頸粘液樣品?？蓮奶旱哪阁w通過任何本領(lǐng)域已 知或?qū)戆l(fā)現(xiàn)的方法獲得生物學(xué)樣品。在另一個(gè)實(shí)施例中，檢測(cè)步驟包括檢測(cè)本發(fā)明的抗體與細(xì)胞或其片段(例如凋 亡體)的特異性結(jié)合。本發(fā)明的抗體與細(xì)胞的特異性結(jié)合表明胎兒細(xì)胞的存在。一般說， 可用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)本發(fā)明抗體與生物學(xué)樣品中的核小體或細(xì)胞的特異性結(jié)合。例 如，當(dāng)抗體被熒光標(biāo)記時(shí)，可使用的示范性流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法，包括但不限于熒光激活細(xì)胞分 揀(FACS)。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了分離或富集胎兒核酸的方法。所述方法包括通 過使生物學(xué)樣品與本發(fā)明抗體接觸，分離從胎兒母體獲得的生物學(xué)樣品中的核酸?？稍谌魏螘r(shí)間從胎兒的母體獲得生物學(xué)樣品，例如在妊娠最初三個(gè)月的第一、第 二、或第三個(gè)月。在一個(gè)實(shí)施例中，在妊娠頭三個(gè)月中獲得生物學(xué)樣品。在另一個(gè)實(shí)施例中， 在妊娠中三個(gè)月期間獲得生物學(xué)樣品。在另一個(gè)實(shí)施例中，在妊娠第4-12周、8-12周、或 10-12周獲得生物學(xué)樣品。在另一個(gè)實(shí)施例中，在妊娠13-28周、13-24周、13-20周、13-16 周、17-20周、或21-24周獲得生物學(xué)樣品。生物學(xué)樣品可以是任何上述母體生物學(xué)樣品。在一個(gè)實(shí)施例中，生物學(xué)樣品是血 液、血漿、血清、尿液、宮頸粘液、羊水、絨毛膜絨毛樣品、或其組分。在另一個(gè)實(shí)施例中，生物 學(xué)樣品是尿液、宮頸粘液、羊水、絨毛膜絨毛樣品或其組分。在另一個(gè)實(shí)施例中，生物學(xué)樣品 是宮頸粘液樣品或其組分。宮頸粘液樣品，例如宮頸內(nèi)粘液樣品或經(jīng)宮頸的粘液樣品可用 本領(lǐng)域任何已知或?qū)頃?huì)開發(fā)的技術(shù)獲得。這些技術(shù)包括但不限于，經(jīng)宮頸拭子、宮頸內(nèi)灌洗、刮板、細(xì)胞刷、抽吸、子宮內(nèi)灌洗或其組合。宮頸粘液樣品可以是新鮮樣品，例如不經(jīng)過充分保存的，或從新鮮樣品保存的樣 品，例如保存在合適的水相保存介質(zhì)中的，或者可以是從一或多個(gè)宮頸粘液樣品過濾出的 含有核酸的介質(zhì)樣品。本發(fā)明的宮頸粘液樣品可以維持或儲(chǔ)藏在約4-20°C之間，例如在低 鈣堿性介質(zhì)內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施例中，宮頸粘液樣品是處理過的樣品，例如用合適試劑處理過，以促使 粘液溶解，從而幫助從樣品分離核酸組分的新鮮或保存的樣品。例如，本發(fā)明的宮頸粘液樣 品可以是用粘液溶解劑或粘蛋白酶，例如N-乙酰-L-半胱氨酸、L-半胱氨酸、二硫蘇糖醇 (DTT)、鹽酸溴己銨(brornhexine hydrochloride)、和任何透明質(zhì)酸酶，包括透明質(zhì)酸分解 酶、透明質(zhì)酸氨基葡糖苷酶(hyaluronoglucosarninidase)和透明質(zhì)酸葡糖苷酸酶處理過 的樣品。在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的宮頸粘液樣品是用酶，例如糖水解酶(例如半乳 糖苷酶或轉(zhuǎn)化酶)；蛋白酶；胃蛋白酶；或其組合處理過的樣品。在另一個(gè)實(shí)施例中，從胎兒母體獲得的生物學(xué)樣品經(jīng)過凋亡誘導(dǎo)處理，或經(jīng)處理 促使胎兒核酸從完整的胎兒細(xì)胞釋放，然后與抗體接觸。例如，生物學(xué)樣品可以是用試劑、 或經(jīng)過高ΡΗ、剪切或熱休克處理的樣品。依托泊苷等試劑，包括但不限于VP16和其它相當(dāng) 的酶可用于促使胎兒核酸釋放。在另一個(gè)實(shí)施例中，處理生物樣品以富集胎兒核酸和/或減少母體核酸含量。例 如，可處理生物學(xué)樣品，以減少或使任何核酸降解，例如母體DNA特征的DNA。這樣的核酸的 一個(gè)例子是高甲基化的母體DNA?？捎萌魏螠p少、降解或選擇性除去高甲基化母體DNA的方 法，包括但不限于，甲基化特異性限制酶，例如McrBC(BioLabs)，對(duì)高甲基化母體DNA特異 性的抗體，例如抗-5’ -甲基-胞嘧啶抗體和/或抗-甲基CpG結(jié)合蛋白-2(MeCP2)抗體， 或配體或蛋白(例如與母體DNA中的甲基化CpG島特異性結(jié)合的MeCP2)。還可用胎兒核酸的特異性標(biāo)記富集胎兒核酸。例如，低甲基化的乳腺絲抑蛋白 (Hiaspin)DNA可用作用于胎兒DNA的標(biāo)記。在一個(gè)實(shí)施例中，來自生物學(xué)樣品的總DNA可以 用亞硫酸氫鈉處理，它誘導(dǎo)低甲基化胎兒DNA中的化學(xué)改變，從而將胎兒DNA的未甲基化的 胞嘧啶轉(zhuǎn)化成尿苷(U)。可用這種改變優(yōu)勢(shì)分離或富集胎兒DNA，例如優(yōu)勢(shì)擴(kuò)增含有從胞嘧 啶轉(zhuǎn)化過來的尿苷的胎兒DNA。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了鑒定胎兒基因組成的方法。該方法包括根據(jù)本 發(fā)明的方法分離胎兒核酸，和基于分離的胎兒核酸鑒定胎兒的基因組成。胎兒的基因組成可指示胎兒性別或胎兒中的狀況或疾病。在一個(gè)實(shí)施例中，基因 組成包括但不限于單體性、部分單體性、三體性、部分三體性、染色體易位、染色體重復(fù)、染 色體缺失或微缺失、和染色體倒位。一般來說，術(shù)語(yǔ)“單體性”指一對(duì)染色體中僅存在一條。單體性是一類非整倍性。 當(dāng)染色體的長(zhǎng)或短臂缺失時(shí)，部分單體性發(fā)生。單體性引起的常見人類遺傳病包括xo，僅 有一條X染色體而不是在正常女性中可見的通常兩條(XX)，也被稱為特納綜合征；貓叫綜 合征，由于5號(hào)染色體短P (來自單詞petit，法語(yǔ)中的“小”)臂末端缺失導(dǎo)致的部分單體 性；和1ρ36缺失綜合征，一種由于1號(hào)染色體短ρ臂末端缺失導(dǎo)致的部分單體性。相反，術(shù)語(yǔ)“三體性”指體內(nèi)對(duì)特別編號(hào)的類型(numbered type)存在三條，而不是 正常的兩條染色體。因此，額外的21號(hào)染色體的存在被稱為21三體性。大部分三體性，與大部分其它染色體數(shù)目異常一樣，導(dǎo)致明顯的出生缺陷。許多三體性導(dǎo)致流產(chǎn)或早年死亡。 當(dāng)一段額外的染色體結(jié)合在其它染色體之一上，或者如果染色體之一具有其染色質(zhì)部分的 兩個(gè)拷貝時(shí)，發(fā)生部分三體性。嵌合三體性是這樣一種情況，即僅在生物體的一些細(xì)胞中存 在額外的染色體物質(zhì)。雖然三體性可以發(fā)生于任何染色體上，具有許多三體性的少數(shù)嬰兒 活到了出生。在人類中，最常見的存活而沒有自發(fā)流產(chǎn)的類型包括21三體性(唐氏綜合 征)；18三體性(愛德華綜合征)；13三體性(帕塔綜合征)；9三體性；8三體性(Warkany 綜合征2)；和16三體性(在人類中最常見的三體性，發(fā)生于以上的妊娠中，雖然常在頭 三個(gè)月導(dǎo)致自發(fā)流產(chǎn))。涉及性染色體的三體性包括XXX(三X染色體綜合征)；XXY(克萊 恩費(fèi)爾特(氏)綜合征)；和XYY (XYY綜合征)。在另一個(gè)實(shí)施例中，基因組成包括等位或基因異常，例如一個(gè)或多個(gè)突變，例如一 個(gè)或多個(gè)基因中的點(diǎn)突變、插入、缺失。在另一個(gè)實(shí)施例中，基因組成包括但不限于一種或多種多態(tài)性模式或遺傳標(biāo)記， 例如短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)、單核苷酸多態(tài)性(SNP)等。在另一個(gè)實(shí)施例中，基因組成表明疾病或異常。疾病或異常的例子包括但不限于 囊性纖維變性、鐮狀細(xì)胞貧血、苯并酮尿癥、Tay-Scahs病、腎上腺增生、范可尼貧血、脊髓 性肌萎縮、進(jìn)行性假肥大性肌營(yíng)養(yǎng)不良、亨廷頓氏舞蹈病、Beta地中海貧血、強(qiáng)直性肌營(yíng)養(yǎng) 不良、脆性X染色體綜合征、唐氏綜合征、愛德華綜合征、帕塔綜合征、克萊恩費(fèi)爾特(氏) 綜合征、三X染色體綜合征、XYY綜合征、8三體性、16三體性、特納綜合征、羅伯遜易位、 Angelman綜合征、迪喬治綜合征、午-希二氏綜合征、RhD綜合征、結(jié)節(jié)性硬化、毛細(xì)血管擴(kuò) 張性共濟(jì)失調(diào)和普拉德_威利綜合征。在另一個(gè)實(shí)施例中，基因組成包括任何不與Y染色體獨(dú)特相關(guān)的基因病況或異常。在另一個(gè)實(shí)施例中，基因組成包括任何對(duì)應(yīng)于或與胎兒的親子關(guān)系相關(guān)的遺傳病 況。本發(fā)明的遺傳測(cè)試可以直接使用本發(fā)明的分離的核酸樣品或?qū)⑵渥鳛椤盎跀U(kuò) 增”的基因組成測(cè)試法的模板。這些測(cè)試是本領(lǐng)域熟知的，包括但不限于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (“PCR”)，實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(“RT-PCR”)，連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(“LCR”)，自持續(xù)序列復(fù)制 (“3SR”)，也稱為基于核酸的擴(kuò)增(“NASBA”)，Q-B-復(fù)制酶擴(kuò)增，滾環(huán)復(fù)制(“RCA”)，轉(zhuǎn) 錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(“TMA”)，接頭輔助DNA擴(kuò)增(“LADA”)，多次置換擴(kuò)增(“MDA”)，和侵入 物和鏈?zhǔn)街脫Q擴(kuò)增(“SDA”)。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種組合物，含有肽和佐劑，該肽具有與SEQ ID NO 1的序列具有至少70%、至少80%、或至少90%相同性的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施例 中，所述肽含有一氨基酸序列，它與SEQ ID NO :1的序列100%相同。合適的佐劑包括但不 限于弗氏完全佐劑、弗式不完全佐劑、弗式完全佐劑的替換物、明礬、乙烯乙酸乙烯酯共聚 物、L-酪氨酸、二縮甘露醇_油酸酯(manide-oleate)、皂甙/膽固醇微囊、或硝基纖維素 (即肽抗原吸附的硝基纖維素)。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種制備與胎兒核小體表位特異性結(jié)合的抗體 的方法。該方法包括用含有肽和佐劑的組合物免疫動(dòng)物，該肽具有與SEQ IDNO 1的序列具 有至少80%相同性的氨基酸序列。該動(dòng)物可以是例如哺乳動(dòng)物(例如小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、山羊、馬等)。在一些實(shí)施例中，該方法包括從被免疫的動(dòng)物獲得細(xì)胞(例如脾細(xì)胞)， 產(chǎn)生單克隆抗體，并篩選這些單克隆抗體與胎兒核小體的特異性結(jié)合。在其它實(shí)施例中，該 方法包括從被免疫的動(dòng)物獲得多克隆抗體，和可任選的從多克隆抗血清純化胎兒核小體特 異性抗體。
實(shí)施例下列實(shí)施例是為了說明，而不是為了以任何方法、方式、形式明確或含蓄地限制本 發(fā)明。雖然它們是可能使用的方法中典型的例子，但是也可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其 它過程、方法或技術(shù)。實(shí)施例1通過從妊娠中三月早期(或頭三個(gè)月晚期)的孕婦拭取或灌洗獲得宮頸粘液樣 品。將收集裝置上的宮頸粘液樣品置于含有緩沖液的試管中，儲(chǔ)藏于約4°C，并轉(zhuǎn)移到處理 實(shí)驗(yàn)室中，同時(shí)維持樣品溫度為約4°C。可用合適的冰袋等實(shí)現(xiàn)維持在4°C。在到達(dá)處理實(shí)驗(yàn)室后，登記樣品并將其給實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員進(jìn)行處理。樣品溫至室 溫，用于隨后處理。接著，可將樣品置于37°C溫箱內(nèi)的搖床上約15-30分鐘，以釋放截留在 粘液中的DNA。可用粘蛋白酶進(jìn)一步溶解粘液，以釋放DNA，也可將樣品置于例如化學(xué)處理等本領(lǐng) 域熟知的條件下誘導(dǎo)樣品凋亡，以釋放胎兒核小體。除去收集裝置，用例如0. 22gm濾膜過 濾緩沖液，以除去污染物，該污染物包括母體細(xì)胞和精細(xì)胞。另外，可離心來自樣品的液體 以沉淀細(xì)胞，以從高分子量粘液和細(xì)胞中分離游離的DNA。可任選地在緩沖液中的樣品內(nèi)加 入DNA酶I以除去未被保護(hù)的高分子量DNA。然后，使清潔的濃縮樣品通過美國(guó)專利申請(qǐng)11/038,920中公開的那類微流裝置， 其具有一收集區(qū)，該收集區(qū)具有多個(gè)隨機(jī)定位的柱，該柱是通過使組蛋白特異性抗體結(jié)合 在其含柱的收集區(qū)內(nèi)制備的?？稍O(shè)計(jì)抗體與具有以下氨基酸殘基序列的十肽偶聯(lián)=Ser-Al a-Val-Met-Ala-Leu-Gln-Glu—Ala-CySo如上制備的經(jīng)處理的粘液樣品在真空泵的牽引下，緩慢通過微流裝置?？贵w通過 與暴露的獨(dú)特序列偶聯(lián)，與含有胎兒組蛋白3. 1的樣品中的染色質(zhì)偶聯(lián)并螯合。然后用緩 沖液洗滌微流裝置，洗滌重復(fù)2-3次，以除去可能存在于宮頸粘液中的任何非特異性結(jié)合 的生物物質(zhì)。還可使用設(shè)計(jì)成與翻譯后修飾，例如糖基化、磷酸化和/或甲基化胎兒核酸的抗 體偶聯(lián)。另外，可用兩組抗體，它們?cè)O(shè)計(jì)成與特異組蛋白構(gòu)象以及上述翻譯后修飾偶聯(lián)。從微流裝置上釋放抗體螯合的生物材料，并純化以除去可能存在的鹽。然后用市 售DNA抽提試劑盒，例如Roche (羅氏)出售的，從樣品抽提DNA。然后將DNA濃縮到合適的體積，即，20-50 μ 1，用實(shí)時(shí)PCR或基于熒光的PCR進(jìn)行 分析以檢測(cè)染色體Y-特異性序列。分析結(jié)果顯示在DNA中有男性Y-序列的陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果， 這是胎兒DNA存在于被抗體螯合的生物材料中的證據(jù)。用兩個(gè)位點(diǎn)的定量實(shí)時(shí)PCR顯示在 螯合的DNA材料中以顯著程度不存在母體DNA。例如，顯示Y-水平與至少一半的第二獨(dú)特 序列(例如β-球蛋白)的水平相當(dāng)證明，大部分，或幾乎所有DNA是胎兒來源的。或者， 可通過鑒定Η3. 1對(duì)Η3. 3在DNA中的相對(duì)比例來顯示，存在的相對(duì)比例是存在于胎兒來源的核小體中的比例，其可確認(rèn)DNA的胎兒來源。在該確認(rèn)后，能可靠地分析DNA中的非整倍性或其它遺傳異?；蚣膊?，該分析可 提示妊娠并發(fā)癥。可對(duì)分離的胎兒DNA進(jìn)行分子DNA測(cè)序或多態(tài)性DNA序列分析。該分析 可利用實(shí)時(shí)PCR來計(jì)量與特異性DNA序列有關(guān)的DNA水平，以篩選非整倍性，或用PCR擴(kuò)增 DNA，然后將其在微陣列或基因-特異性微陣列中溫育。本文所弓I用的所有專利和出版物在此完整弓丨入以供參考。雖然本發(fā)明已用目前的優(yōu)選例進(jìn)行了描述，但是應(yīng)理解，可在不違背本發(fā)明的精 神的前提下進(jìn)行各種修改。因此，本發(fā)明僅以所附權(quán)利要求書進(jìn)行限定。
權(quán)利要求
一種與胎兒核小體表位特異性結(jié)合的抗體。
2.如權(quán)利要求1所述的抗體，其特征在于，所述胎兒核小體表位是與組蛋白H3有關(guān)的表位。
3.如權(quán)利要求1所述的抗體，其特征在于，所述胎兒核小體表位是與組蛋白H3.1有關(guān) 的表位。
4.如權(quán)利要求1所述的抗體，其特征在于，所述胎兒核小體表位是與組蛋白H3.1的一 個(gè)區(qū)域有關(guān)的表位，所述區(qū)域在胎兒核小體中比在母體核小體中更暴露。
5.如權(quán)利要求1所述的抗體，其特征在于，所述胎兒核小體表位是與組蛋白H3.1有關(guān)， 但與組蛋白3. 3無關(guān)的表位。
6.如權(quán)利要求1所述的抗體，其特征在于，所述胎兒核小體表位是在具有SEQIDNO 1 的氨基酸序列的肽內(nèi)的表位。
7.一種與胎兒核小體表位特異性結(jié)合的抗體，其特征在于，所述抗體與權(quán)利要求6所 述的抗體競(jìng)爭(zhēng)與含有所述表位的肽結(jié)合。
8.如權(quán)利要求1所述的抗體，其特征在于，所述胎兒核小體表位是在肽內(nèi)的表位，所述 肽具有與SEQ ID NO 1的氨基酸序列具有至少90%相同性的氨基酸序列。
9.如權(quán)利要求1所述的抗體，其特征在于，所述抗體含有可檢測(cè)的部分。
10.如權(quán)利要求1所述的抗體，其特征在于，所述抗體被熒光標(biāo)記。
11.如權(quán)利要求1所述的抗體，其特征在于，所述抗體被固定在固相載體上。
12.—種含有權(quán)利要求1的抗體的試劑盒。
13.如權(quán)利要求12所述的試劑盒，其特征在于，還含有用試劑盒檢測(cè)胎兒細(xì)胞或從母 體的生物樣品中分離胎兒核酸的說明書。
14.一種適合測(cè)試胎兒的基因組成的試劑盒，其特征在于，包括胎兒的分離的核酸樣 品，所述樣品是用權(quán)利要求1所述的抗體分離的。
15.一種在生物樣品中檢測(cè)胎兒核酸存在的方法，包括使生物樣品與權(quán)利要求1所述的抗體接觸，和檢測(cè)所述抗體與生物樣品中的核小體的結(jié)合，其中，所述抗體與核小體的特異性結(jié)合表明胎兒核酸的存在。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，所述生物樣品是血液、血漿、血清、尿液、 宮頸粘液、羊水或絨毛膜絨毛樣品。
17.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，所述生物樣品是宮頸粘液樣品。
18.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，所述檢測(cè)包括檢測(cè)抗體與細(xì)胞的特異性 結(jié)合，所述抗體與細(xì)胞的特異性結(jié)合顯示胎兒細(xì)胞的存在。
19.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，所述檢測(cè)是用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法進(jìn)行的。
20.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，所述檢測(cè)是用熒光激活細(xì)胞分揀(FACS) 進(jìn)行的，其中所述抗體被熒光標(biāo)記。
21.一種從胎兒分離核酸的方法，其特征在于，包括用權(quán)利要求1所述的抗體分離獲自胎兒的母體的生物樣品中的核酸。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，所述生物樣品是尿、宮頸粘液、羊水或絨 毛膜絨毛樣品。
23.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，所述抗體被固定在固相表面。
24.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，在與抗體接觸前，所述生物樣品經(jīng)過凋亡 誘導(dǎo)處理。
25.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，在與抗體接觸前，所述生物樣品經(jīng)過凋亡 誘導(dǎo)處理，其中，所述凋亡誘導(dǎo)處理包括化學(xué)處理、高PH、剪切或熱休克。
26.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，所述生物樣品是在頭三個(gè)月妊娠期間獲 得的。
27.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，所述生物樣品是宮頸粘液樣品，其中，所 述宮頸粘液樣品是通過經(jīng)宮頸拭子、宮頸內(nèi)灌洗、細(xì)胞刷、抽吸、子宮內(nèi)灌洗或其組合獲得 的。
28.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，所述生物樣品是宮頸粘液樣品，并且所述 宮頸粘液樣品在與抗體接觸前經(jīng)粘液溶解劑處理。
29.一種鑒定胎兒基因組成的方法，其特征在于，包括根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法分離胎兒核酸；和基于分離的胎兒核酸鑒定胎兒的基因組成。
30.如權(quán)利要求29所述的方法，其特征在于，所述基因組成選自單體性、部分單體性、 三體性、部分三體性、染色體易位、染色體重復(fù)、染色體缺失或微缺失、和染色體倒位。
31.如權(quán)利要求29所述的方法，其特征在于，所述基因組成指示疾病或異常，所述疾病 或異常選自囊性纖維變性、鐮狀細(xì)胞貧血、苯并酮尿癥、Tay-Scahs病、腎上腺增生、范可 尼貧血、脊髓性肌萎縮、進(jìn)行性假肥大性肌營(yíng)養(yǎng)不良、亨廷頓氏舞蹈病、地中海貧血、強(qiáng) 直性肌營(yíng)養(yǎng)不良、脆性X染色體綜合征、唐氏綜合征、愛德華綜合征、帕塔綜合征、克萊恩費(fèi) 爾特(氏)綜合征、三X染色體綜合征、XYY綜合征、8三體性、16三體性、特納綜合征、羅伯 遜易位、Angelman綜合征、迪喬治綜合征、午-希二氏綜合征、RhD綜合征、結(jié)節(jié)性硬化、毛細(xì) 血管擴(kuò)張性共濟(jì)失調(diào)和普拉德_威利綜合征。
32.—種組合物，其特征在于，所述組合物含有肽和佐劑，所述肽具有與SEQID ΝΟ:1的 序列有至少80%相同性的氨基酸序列。
33.如權(quán)利要求32所述的組合物，其特征在于，所述氨基酸序列與SEQIDNO :1的序列 100%相同。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于檢測(cè)存在于獲自母體的生物樣品中的胎兒細(xì)胞和/或胎兒核酸的方法、抗體和試劑盒。還提供了用于從母體宮頸粘液樣品分離胎兒核酸，和用于測(cè)試或篩選分離的胎兒核酸以診斷胎兒基因異常的方法和試劑盒。
文檔編號(hào)G01N33/53GK101883851SQ200880108751
公開日2010年11月10日 申請(qǐng)日期2008年9月22日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月21日
發(fā)明者F·比肖夫 申請(qǐng)人:生物概念股份有限公司