久久一区二区免费播放,国产在线欧美日韩一区二区,国产综合色在线视频,精品伊人久久久香线蕉,精品视频麻豆网站,玖玖国产,国内精品久久久久影,在线观看精品视频一区二区三区,午夜久久影院,国产精品一区久久

一種檢測(cè)乙酰甲胺磷的方法和試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種檢測(cè)樣品中痕量乙酰甲胺磷的方法，并提供了試劑盒。利用多巴胺氧化聚合法，在載體材料上合成可特異性結(jié)合乙酰甲胺磷的人工抗體（分子印跡聚合物，MIP），用MIP特異性分離富集不同樣品中的痕量乙酰甲胺磷后，利用酶抑制-化學(xué)發(fā)光法測(cè)定所富集的乙酰甲胺磷含量。MIP對(duì)溫度、有機(jī)溶劑耐受性高，可直接特異性分離富集不同樣品中的痕量乙酰甲胺磷，去除其他有機(jī)磷農(nóng)藥、葉綠素等多種干擾物的影響。通過將MIP特異性樣品預(yù)處理與酶抑制法有機(jī)結(jié)合，MIP-酶抑制法不僅可利用酶抑制法特異性快速檢測(cè)某種農(nóng)藥，還可提高檢測(cè)靈敏度和特異性，可直接、快速、靈敏、高通量地檢測(cè)環(huán)境和食品中的痕量靶農(nóng)藥。
【專利說明】一種檢測(cè)乙酰甲胺磷的方法和試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子印跡技術(shù)和農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種乙酰甲胺磷人工抗體(MIP)的制備，以及將MIP與酶抑制-化學(xué)發(fā)光法有機(jī)結(jié)合，所建立的集特異性樣品預(yù)處理和酶抑制-化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)于一體，可特異、快速、靈敏、高通量地檢測(cè)樣品中痕量乙酰甲胺磷的新方法:MIP-酶抑制法，并提供相應(yīng)的檢測(cè)試劑盒。
技術(shù)背景
[0002]有機(jī)磷農(nóng)藥是我國(guó)目前使用量最大的一類農(nóng)藥，自從2007年I月I日我國(guó)全面禁用甲胺磷等5種中高毒有機(jī)磷農(nóng)藥以來，乙酰甲胺磷因其低毒、安全、廣譜、持效期長(zhǎng)、大田應(yīng)用效果好等優(yōu)勢(shì)，作為甲胺磷的替代農(nóng)藥，廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐中。但是乙酰甲胺磷在環(huán)境中仍然有殘留風(fēng)險(xiǎn)(我國(guó)規(guī)定，乙酰甲胺磷在蔬菜中的最大殘留限量為lmg/kg)，人們?cè)谑秤脷埩粲幸阴＜装妨椎霓r(nóng)產(chǎn)品和食品后，會(huì)在體內(nèi)蓄積，甚至發(fā)生急性中毒，危害人體健康和生命安全。因此，如何快速檢測(cè)出環(huán)境中乙酰甲胺磷的殘留量，對(duì)保證食品安全、保障人群健康具有重要意義。
[0003]目前乙酰甲胺磷的檢測(cè)方法主要有色譜法(氣相或液相色譜)、質(zhì)譜法、ELISA法、酶抑制法等。色譜及質(zhì)譜法靈敏度高，可區(qū)分具體的農(nóng)藥種類，但費(fèi)用相對(duì)昂貴，樣品前處理過程復(fù)雜，需要昂貴的儀器設(shè)備，無(wú)法用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。ELISA法靈敏度高、特異性強(qiáng)，但小分子農(nóng)藥的抗體制備難度較大，且抗體穩(wěn)定性差，對(duì)熱、pH、鹽濃度等有嚴(yán)格要求，多用于檢測(cè)血樣中的有機(jī)磷農(nóng)藥；食品和環(huán)境樣品需要經(jīng)過預(yù)處理，去除干擾物后，才能保證ELISA檢測(cè)的靈敏度和特異性，不宜用于現(xiàn)場(chǎng)直接快速檢測(cè)。酶抑制法快速，操作簡(jiǎn)便，目前廣泛用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)；但特異性差，樣品中的葉綠素等物質(zhì)對(duì)檢測(cè)的干擾很大，僅能判斷樣品中是否含有可抑制膽堿酯酶的有機(jī)磷或氨基甲酸酯農(nóng)藥，不能判斷出具體的農(nóng)藥品種及各種農(nóng)藥的量。
[0004]為提高酶抑制法的靈敏度，耦合酶促反應(yīng)的化學(xué)發(fā)光法(簡(jiǎn)稱為酶抑制-化學(xué)發(fā)光法)通過化學(xué)發(fā)光法測(cè)定酶抑制水平，可有效提高酶抑制法的靈敏度。具有靈敏度高、檢測(cè)限低的優(yōu)點(diǎn)(M.Guardigli et al.Chemiluminescent high-throughputmicroassay for evaluation of acetylcholinesterase inhibitors.Analytica ChimicaActa.2005, 535，139-144)。但本方法同樣具有酶抑制法缺乏特異性、抗干擾能力差、往往只能定性測(cè)定樣品中是否存在有機(jī)磷農(nóng)藥或氨基甲酸酯農(nóng)藥，無(wú)法確定某種農(nóng)藥的含量等缺點(diǎn)。
[0005]針對(duì)酶抑制-化學(xué)發(fā)光法缺乏特異性、抗干擾能力差等缺點(diǎn)，若能采用特異性樣品預(yù)處理方法，首先特異性富集某種農(nóng)藥(如乙酰甲胺磷)同時(shí)去除干擾物，然后用酶抑制-化學(xué)發(fā)光法快速檢測(cè)所富集的靶農(nóng)藥，則可快速靈敏地測(cè)定樣品中某種特定的農(nóng)藥種類和含量。人工抗體(MIP)因具有特異識(shí)別能力、耐受性好等特點(diǎn)，在化學(xué)分析等許多領(lǐng)域已得到廣泛應(yīng)用。Shen等以MAA作為功能單體、EGDMA為交聯(lián)齊U、AIBN為引發(fā)劑，合成了甲胺磷、乙酰甲胺磷的MIP，結(jié)果表明，MIP對(duì)相應(yīng)的模板分子有很強(qiáng)的特異性識(shí)別和吸附能力(Zhong-Lan shen et al.Study on the BindingCharacteristic of Methamidophos-specific Molecularly Imprinted Polymer and theInteractions between Template and Monomers.Journal of the Chinese ChemicalSociety.2008，55，587-593)。Wei等以乙酰甲胺磷為模板分子，甲基丙烯酸為功能單體，在SPR傳感芯片上合成了超薄的MIP膜，結(jié)果表明，含MIP的SPR芯片可準(zhǔn)確檢測(cè)出兩種樣品中的乙酸甲胺憐濃度，回收率為96.6-98% (C.Wei et al.Ultrasensitively sensingacephate using molecular imprinting techniques on a surface plasmon resonancesensor.Talanta.2011，83，1422 - 1427)?？梢姡琈IP技術(shù)在乙酰甲胺磷檢測(cè)的樣品預(yù)處理和快速檢測(cè)上有很好的應(yīng)用前景，但上述研究中的MIP僅限應(yīng)用于固相萃取，或檢測(cè)需要復(fù)雜的儀器(如SPR儀)，尚無(wú)將MIP和酶抑制法有機(jī)結(jié)合，快速測(cè)定某種靶農(nóng)藥的報(bào)道。
[0006]如果將MIP與酶抑制-化學(xué)發(fā)光法聯(lián)合使用，利用MIP的特異性吸附能力，在特異高效地富集樣品中的痕量乙酰甲胺磷的同時(shí)去除干擾物，然后利用酶抑制-化學(xué)發(fā)光法快速靈敏地測(cè)定所富集的乙酰甲胺磷，實(shí)現(xiàn)利用簡(jiǎn)單的酶抑制法靈敏、特異、快速地測(cè)定某種特定農(nóng)藥(如乙酰甲胺磷)含量之目的，特異性樣品預(yù)處理還可提高酶抑制-化學(xué)發(fā)光檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性。目前尚無(wú)集樣品預(yù)處理和酶抑制法于一體的方法報(bào)道，也無(wú)酶抑制法可特異性檢測(cè)某種農(nóng)藥的報(bào)道。因此，將MIP與酶抑制-化學(xué)發(fā)光法結(jié)合，建立一種集特異性樣品預(yù)處理和酶抑制-化學(xué)發(fā)光檢測(cè)于一體的快速檢測(cè)方法，不僅可快速準(zhǔn)確檢測(cè)乙酰甲胺磷，也有望用于其它有機(jī)磷或氨基甲酸酯農(nóng)藥的快速檢測(cè)上，在環(huán)境、農(nóng)業(yè)、食品等學(xué)科中將有很大的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]為克服傳統(tǒng)酶抑制法缺乏特異性、抗干擾能力低、穩(wěn)定性較差等技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種檢測(cè)乙酰甲胺磷的MIP-酶抑制法，可特異、快速、靈敏、高通量地檢測(cè)蔬菜和環(huán)境樣品中的痕量乙酰甲胺磷。
[0008]本發(fā)明公開一種可特異性檢測(cè)乙酰甲胺磷的MIP-酶抑制法，其特征在于以多巴胺為功能單體制備的乙酰甲胺磷MIP可特異性分離富集樣品中痕量乙酰甲胺磷，并建立了相應(yīng)的MIP-酶抑制法試劑盒。
[0009]實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案是:
[0010]本發(fā)明提供的采用多巴胺氧化聚合法在載體材料上合成可特異性結(jié)合乙酰甲胺磷的人工抗體(MIP)的方法，包括以下步驟:
[0011]步驟一:聚合反應(yīng):
[0012](a)將模板分子乙酰甲胺磷與多巴胺按摩爾比為1:10-50的比例溶于PH=7.6的Tris-HCL緩沖溶液中，混勻的混合液；
[0013](b)加入載體材料，
[0014](c)聚合:室溫下暴露于空氣中48_72h進(jìn)行聚合；
[0015]空白印跡聚合物(NIP)的合成方法與MIP的合成方法相似，只是在合成過程中不加模板分子；
[0016]步驟二:洗脫模板分子:使用10%冰乙酸的水溶液和三蒸水反復(fù)震蕩洗滌載體材料，再得到含MIP的載體材料。即制備得到可特異性結(jié)合乙酰甲胺磷的人工抗體(MIP)。[0017]上述方法中所述的載體材料是多孔酶標(biāo)板、濾膜、納米級(jí)微球或微米級(jí)微球。所述的濾膜如是硝酸纖維濾膜、醋酸纖維濾膜或?yàn)V紙。所述的微球是四氧化三鐵磁性微球或二氧化硅微球；
[0018]在所述的載體材料是多孔酶標(biāo)板時(shí)，在步驟一之步驟(b)中，所述的加入載體材料的具體方法是:將混合液加入到多孔酶標(biāo)板的孔中；在步驟二中，所述的使用10%冰乙酸的水溶液和三蒸水反復(fù)震蕩洗滌載體材料的具體方法是:使用10%冰乙酸的水溶液反復(fù)震蕩洗滌多孔酶標(biāo)板7-14次，每次30-50min，再用三蒸水震蕩洗滌7_14次，每次30_50min，即得到含MIP的酶標(biāo)板。
[0019]本發(fā)明提供的檢測(cè)乙酰甲胺磷的試劑盒含有權(quán)利要求6所述的可特異性結(jié)合乙酰甲胺磷的人工抗體(MIP)。該試劑盒具體可由含MIP的載體材料、乙酰甲胺磷標(biāo)準(zhǔn)溶液(0-200ng/mL)、膽堿酯酶 AChE (500mU/mL)、乙酰膽堿 ATCI (20 μ mol/mL)、膽堿氧化酶 ChOX(lmg/mL)、辣根過氧化物酶HRP (15U/mL)、魯米諾Luminol (I μ mol/mL)組成,所述的含MIP的載體材料按本發(fā)明所述的方法制得。
[0020]對(duì)本發(fā)明所制備的MIP的性能評(píng)價(jià)，以96孔酶標(biāo)板為例:
[0021]1、形態(tài)評(píng)價(jià):掃描電鏡分析顯示酶標(biāo)板上合成的MIP為均一的高分子膜狀物，厚度為150-750nm,紅外光譜檢測(cè)顯示MIP在3100，1600，1000，880和650厘米處具有5個(gè)明顯的紅外吸收峰，與多巴胺的特征峰一致，證明在96孔酶標(biāo)板孔內(nèi)制備了含多巴胺分子的 MIP。
[0022]2、靜態(tài)吸附試驗(yàn)評(píng)價(jià)MIP吸附容量:準(zhǔn)確吸取300 μ L乙酰甲胺磷標(biāo)準(zhǔn)品水溶液(0.50-100ng/mL)，分別加入到MIP、NIP和空白孔中，25°C室溫下在振蕩器中振蕩IOmin后在37°C恒溫條件下吸附l_6h，用LC-MS測(cè)定上清中乙酰甲胺磷的濃度Free (ng/mL)，根據(jù)結(jié)合前后上清液中乙酰甲胺磷濃度的變化計(jì)算每cm2的乙酰甲胺磷結(jié)合量Bond(ng/cm2)。以[Bound]/[Free]為縱坐標(biāo)，[Bound]為橫坐標(biāo)建立Scatchard曲線，以Scatchard曲線的斜率為平衡解離常數(shù)Kd,以公式:[Bound]/[Free] =?([Bound]/Kd) + (Bmax/Kd),計(jì)算最大吸附容量Bmax。本發(fā)明所制備的MIP的Kd=8.26ng/mL, Bmax=2.07ng/cm2,而陰性對(duì)照(NIP)的 Kd=27.78ng/mL, Bmax=L 00ng/cm2。
[0023]3、靜態(tài)吸附試驗(yàn)評(píng)價(jià)MIP吸附特異性:采用IPB( imprinting-1nduced promotionof binding)值來評(píng)價(jià) MIP 的選擇性:IPB=(Cmip?Cnip)/CnipX 100%。其中，Cmip 為與MIP結(jié)合的乙酰甲胺磷的量，Cnip為與NIP結(jié)合的乙酰甲胺磷的量，得到MIP的IPB值為
1.24-1.93。
[0024]本發(fā)明公開了所述MIP-酶抑制法試劑盒的構(gòu)成和使用方法:試劑盒由含MIP的載體材料(酶標(biāo)板、濾膜、微球等)、乙酰甲胺磷標(biāo)準(zhǔn)溶液(0-200ng/mL)、膽堿酯酶AChE( 500mU/mL)、乙酰膽堿ATCI (20 μ mol/mL)、膽堿氧化酶ChOX (lmg/mL)、辣根過氧化物酶HRP (15U/mL)、魯米諾Luminol (I μ mol/mL)構(gòu)成。使用方法包括以下步驟(以96孔酶標(biāo)板為例):
[0025]步驟一:向所得含MIP的酶標(biāo)板孔內(nèi)加入300 μ L乙酰甲胺磷標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品，37°C作用l_6h后用純水洗滌2-3次。
[0026]步驟二:每孔加入120 μ L三蒸水和10-20 μ L膽堿酯酶(AChE) (500mU/mL), 37°C孵育 10-20min。
[0027]步驟三:每孔加入105 μ L含0.1 μ mol/mL魯米諾(luminol), 0.5mg/mL膽堿氧化酶(ChOX)和10U/mL辣根過氧化物酶(HRP)的混合液。
[0028]步驟四:檢測(cè)前每孔加入10-20 μ L乙酰膽堿(六1'(:1)(2(^11101/1^)，立即用酶標(biāo)儀檢測(cè)5min內(nèi)的累積發(fā)光值變化，讀數(shù)間隔為10s。
[0029]步驟五:確定乙酰甲胺磷濃度。以乙酰甲胺磷對(duì)膽堿酯酶的抑制率為縱坐標(biāo)，乙酰甲胺磷濃度為橫坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中抑制率=(RLUO-RLU)/RLU0X 100% (RLU0:乙酰甲胺磷濃度為O時(shí)的發(fā)光值；RLU:不同乙酰甲胺磷濃度下的發(fā)光值)。通過測(cè)定發(fā)光值計(jì)算出乙酰甲胺磷的抑制率，根據(jù)抑制率與乙酰甲胺磷濃度之間的線性關(guān)系，即可確定乙酰甲胺磷的濃度。
[0030]另一方面，本發(fā)明還公開了一種特異、快速的乙酰甲胺磷檢測(cè)方法，以及所述MIP-酶抑制法檢測(cè)樣品中痕量乙酰甲胺磷方面的用途。檢測(cè)方法包括下列步驟:
[0031](I)環(huán)境樣品或蔬菜樣品的制備；
[0032](2)權(quán)利要求1所述MIP-酶抑制試劑盒結(jié)合酶標(biāo)儀檢測(cè)上述樣品溶液；
[0033](3)獲得乙酰甲胺磷含量。
[0034]本發(fā)明建立了一種集特異性樣品預(yù)處理和酶抑制-化學(xué)發(fā)光檢測(cè)于一體，可利用酶抑制法直接檢測(cè)樣品中痕量乙酰甲胺磷的檢測(cè)新方法:人工抗體-酶抑制法(MIP-酶抑制法)，并提供相應(yīng)的試劑盒。MIP-酶抑制法利用多巴胺氧化聚合法，在不同載體材料(如多孔酶標(biāo)板、濾膜(如硝酸纖維濾膜、醋酸纖維濾膜、濾紙等)、納米或微米級(jí)微球(如四氧化三鐵磁性微球、二氧化硅微球等)上合成可特異性結(jié)合乙酰甲胺磷的人工抗體(又稱分子印跡聚合物，MIP)，用MIP特異性分離富集不同樣品中的痕量乙酰甲胺磷后，利用酶抑制-化學(xué)發(fā)光法測(cè)定所富集的乙酰甲胺磷含量。MIP對(duì)溫度、有機(jī)溶劑耐受性高，可直接特異性分離富集不同樣品中的痕量乙酰甲胺磷，去除其他有機(jī)磷農(nóng)藥、葉綠素等多種干擾物的影響。通過將MIP特異性樣品預(yù)處理與酶抑制法有機(jī)結(jié)合，MIP-酶抑制法不僅可利用酶抑制法特異性快速檢測(cè)某種農(nóng)藥，還可提高檢測(cè)靈敏度和特異性，可直接、快速、靈敏、高通量地檢測(cè)環(huán)境和食品中的痕量靶農(nóng)藥。MIP-酶抑制法試劑盒由含MIP的載體材料(如96孔酶標(biāo)板、濾膜、微球等)、乙酰甲胺磷標(biāo)準(zhǔn)溶液、膽堿酯酶(AChE)、乙酰膽堿(ATCI)、膽堿氧化酶(ChOX)、辣根過氧化物酶(HRP )、魯米諾(LuminoI)構(gòu)成。試劑盒對(duì)環(huán)境和食品中乙酰甲胺磷的檢測(cè)靈敏度為1-2.5ng/mL,日內(nèi)偏差為7.10-16.81%，日間偏差為3.98-7.42%，批次間偏差為4.04-7.25%，可特異、靈敏、高通量地測(cè)定環(huán)境和食品中的乙酰甲胺磷。
[0035]本發(fā)明中用于檢測(cè)乙酰甲胺磷的酶抑制-化學(xué)發(fā)光法，其原理為:膽堿酯酶水解乙酰膽堿生成膽堿，膽堿被膽堿氧化酶氧化生成甜菜堿和H202，后者在辣根過氧化物酶的作用下作為與魯米諾反應(yīng)產(chǎn)生光子，而有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)膽堿酯酶有抑制作用，以致乙酰膽堿無(wú)法被水解生成膽堿，連鎖反應(yīng)被封閉，化學(xué)發(fā)光值相應(yīng)降低，發(fā)光值的降低與乙酰甲胺磷在一定濃度范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，根據(jù)發(fā)光值的抑制率變化即可測(cè)定樣品中乙酰甲胺磷的含量。
[0036]眾所周知，酶抑制法具有簡(jiǎn)單、檢測(cè)快速、靈敏等特點(diǎn)，但是因?yàn)樘禺愋圆詈涂垢蓴_能力差而無(wú)法準(zhǔn)確測(cè)定某種農(nóng)藥含量。本發(fā)明所制備的人工抗體(MIP)在制備的過程中能形成與乙酰甲胺磷大小和形狀相匹配的立體空腔，并具有特定的非共價(jià)結(jié)合鍵，能在室溫下特異性地結(jié)合乙酰甲胺磷，因而可快速且特異地分離和富集各種樣品中的乙酰甲胺磷。利用MIP的仿生識(shí)別能力，建立MIP-酶抑制法，MIP特異性分離富集不同樣品中的痕量乙酰甲胺磷后，使用酶抑制-化學(xué)發(fā)光法測(cè)定所富集的乙酰甲胺磷。MIP可有效去除樣品中的雜質(zhì)，保證酶抑制-化學(xué)發(fā)光可特異、靈敏、準(zhǔn)確地測(cè)定乙酰甲胺磷。MIP-酶抑制法集選擇性樣品預(yù)處理和靈敏快速的酶抑制-化學(xué)發(fā)光檢測(cè)于一體，可直接檢測(cè)不同樣品中痕量乙酰甲胺磷，特異、靈敏、快速、穩(wěn)定，特別適合用于現(xiàn)場(chǎng)快速測(cè)定復(fù)雜樣品如食品和環(huán)境樣品中痕量乙酰甲胺磷，在痕量農(nóng)藥的檢測(cè)中具有十分廣泛的應(yīng)用價(jià)值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0037]載體材料以96孔酶標(biāo)板為例。
[0038]圖1為本發(fā)明制備的MIP和空白對(duì)照。左側(cè)(A1-H6)為未經(jīng)任何處理的孔(空白對(duì)照)，右側(cè)(A7-H12)為MIP的孔。顯示MIP的孔內(nèi)有棕黑色的MIP膜。
[0039]圖2為本發(fā)明制備的MIP的掃描電鏡圖。圖2a為空白，圖2b為MIP，圖2c為NIP(陰性對(duì)照)。與空白相比，所制得的MIP和NIP均為高分子膜狀物，且MIP較NIP分布均一。
[0040]圖3a為空白酶標(biāo)板的傅里葉變換紅外光譜(FT-1R)圖譜，圖3b為本發(fā)明制備的MIP的FT-1R圖譜，其縱坐標(biāo)為吸光度，橫坐標(biāo)為波數(shù)(厘米―1)。FT-1R證實(shí)了酶標(biāo)板表面確實(shí)是含多巴胺分子的MIP (圖3b)。與空白相比，MIP和NIP在3100，1600，1000，880和650厘米―1處具有5個(gè)明顯的紅外吸收峰，分別代表C-H的伸縮振動(dòng)，芳烴的骨架振動(dòng)，N-H的面外彎曲振動(dòng)，C-H的面外彎曲振動(dòng)以及O-H的面外彎曲振動(dòng)，與多巴胺的特征峰一致，證明本發(fā)明在96孔酶標(biāo)板孔內(nèi)制備了含多巴胺分子的MIP。
[0041]圖4為MIP-酶抑制法檢測(cè)乙酰甲胺磷的化學(xué)發(fā)光動(dòng)力曲線圖，縱坐標(biāo)為不同乙酰甲胺磷濃度下(0-200ng/mL)的發(fā)光強(qiáng)度；橫坐標(biāo)為時(shí)間(時(shí):分:秒)(HH:麗:SS)。其中，乙酰甲胺磷濃度從上 往下，分別為:0，2.5，5，10，20，100，200ng/mL)?？煽闯?，乙酰甲胺磷的濃度越高，得到的化學(xué)發(fā)光平衡值越低。說明乙酰膽堿對(duì)膽堿酯酶的抑制作用使酶促反應(yīng)受到影響，因此檢測(cè)到的化學(xué)發(fā)光值相應(yīng)降低。通過測(cè)定發(fā)光值的降低，即可確定樣品中含有的乙酰甲胺磷含量，從而定量測(cè)定乙酰甲胺磷。
[0042]圖5為MIP-酶抑制法測(cè)定乙酰甲胺磷的標(biāo)準(zhǔn)曲線，圖中:Y:利用發(fā)光平衡值計(jì)算出乙酰甲胺磷對(duì)膽堿酯酶的抑制率，抑制率=(RLUO-RLU)/RLUO*100 (RLU:不同乙酰甲胺磷濃度下的發(fā)光值；RLU0:乙酰甲胺磷濃度為O時(shí)的發(fā)光值)；X:乙酰甲胺磷濃度(ng/mL)。縱坐標(biāo)為不同濃度的乙酰甲胺磷對(duì)膽堿酯酶的抑制率；橫坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)品乙酰甲胺磷濃度。隨著乙酰甲胺磷濃度的增加，其抑制率增加，抑制率與乙酰甲胺磷濃度在2.5~200ng/mL范圍內(nèi)存在較好的線性關(guān)系。通過測(cè)定發(fā)光值計(jì)算出乙酰甲胺磷的抑制率，即可定量測(cè)定樣品中乙酰甲胺磷含量。
[0043]圖6為本發(fā)明方法流程圖，圖中各物質(zhì)為:
[0044]
【權(quán)利要求】
1.一種采用多巴胺氧化聚合法在載體材料上合成可特異性結(jié)合乙酰甲胺磷的人工抗體(MIP)的方法，包括以下步驟: 步驟一:聚合反應(yīng): Ca)將模板分子乙酰甲胺磷與多巴胺按摩爾比為1:10-50的比例溶于PH=7.6的Tris-HCL緩沖溶液中，混勻的混合液； (b)加入載體材料， (c)聚合:室溫下暴露于空氣中48-72h進(jìn)行聚合； 步驟二:洗脫模板分子:使用10%冰乙酸的水溶液和三蒸水反復(fù)震蕩洗滌載體材料，再得到含MIP的載體材料。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的所述的載體材料是多孔酶標(biāo)板、濾膜、納米級(jí)微球或微米級(jí)微球。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的濾膜如是硝酸纖維濾膜、醋酸纖維濾膜或?yàn)V紙。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的微球是四氧化三鐵磁性微球或二氧化硅微球。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的載體材料是多孔酶標(biāo)板，在步驟一之步驟(b)中，所述的加入載體材料的具體方法是:將混合液加入到多孔酶標(biāo)板的孔中；在步驟二中，所述的使用10%冰乙酸的水溶液和三蒸水反復(fù)震蕩洗滌載體材料的具體方法是:使用10%冰乙酸的水溶液反復(fù)震蕩洗滌多孔酶標(biāo)板7-14次，每次30-50min，再用三蒸水震蕩洗滌7-14次，每次30-50min，即得到含MIP的酶標(biāo)板。
6.按權(quán)利要求1所述方法制備的可特異性結(jié)合乙酰甲胺磷的人工抗體(MIP)。
7.—種檢測(cè)乙酰甲胺磷的試劑盒，它有權(quán)利要求6所述的可特異性結(jié)合乙酰甲胺磷的人工抗體(MIP)。
8.—種檢測(cè)乙酰甲胺磷的試劑盒，由含MIP的載體材料、乙酰甲胺磷標(biāo)準(zhǔn)溶液(0-200ng/mL)、膽堿酯酶 AChE(500mU/mL)、乙酰膽堿 ATCI (20 μ mol/mL)、膽堿氧化酶 ChOX(lmg/mL)、辣根過氧化物酶HRP (15U/mL)、魯米諾Luminol (I μ mol/mL)組成,所述的含MIP的載體材料按權(quán)利要求1所述的方法制得。
【文檔編號(hào)】G01N33/531GK103837523SQ201410072679
【公開日】2014年6月4日 申請(qǐng)日期:2014年2月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月28日
【發(fā)明者】呂斌, 王雪娟, 劉燕婕, 石云 申請(qǐng)人:華中科技大學(xué)