久久一区二区免费播放,国产在线欧美日韩一区二区,国产综合色在线视频,精品伊人久久久香线蕉,精品视频麻豆网站,玖玖国产,国内精品久久久久影,在线观看精品视频一区二区三区,午夜久久影院,国产精品一区久久

一種定量檢測(cè)雞糞中氟喹諾酮類(lèi)的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種定量檢測(cè)雞糞中6種氟喹諾酮類(lèi)的檢測(cè)分析方法，該方法包括：(1)雞糞樣品經(jīng)冷凍干燥；(2)粉碎雞糞樣品并過(guò)篩；(3)加入EDTA-Mcllvaine和乙腈混合提取劑，漩渦混勻并超聲處理；(4)離心獲上清液為提取液；(5)去除有機(jī)溶劑后，提取液用濾膜過(guò)濾；(6)過(guò)濾液過(guò)HLB柱并抽干，用5%甲醇溶液清洗柱，最后經(jīng)甲醇洗脫目標(biāo)抗生素，收集洗脫液；(7)吹干，用乙腈/0.7%磷酸定容，充分溶解后過(guò)濾即可用于定量檢測(cè)。本發(fā)明方法實(shí)現(xiàn)了6種氟喹諾酮類(lèi)的同時(shí)檢測(cè)，具有低成本、易操作等特點(diǎn)，為復(fù)雜基質(zhì)中FQs類(lèi)抗生素的檢測(cè)提供了一種可選的方法，且方法檢出限、定量限均低，回收率高。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種定量檢測(cè)雞糞中氟喹諾酮類(lèi)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種復(fù)雜基質(zhì)中抗生素的檢測(cè)方法，具體地說(shuō)是雞糞中6種氟喹諾酮類(lèi)(FQs)抗生素的檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]氟喹諾酮類(lèi)(FQs)抗生素是一類(lèi)由人工合成的廣譜類(lèi)抗菌藥，是喹諾酮的哌嗪基派生物，通過(guò)抑制細(xì)菌的DNA解旋酶II (topoisomerase II)和拓?fù)洚悩?gòu)酶IV(topoisomerase IV)而影響細(xì)菌的DNA復(fù)制過(guò)程。由于具有廣譜抗革蘭氏細(xì)菌活性和口服吸收效果好等特性，F(xiàn)Qs在禽畜養(yǎng)殖業(yè)被大量用于禽畜疾病防治以及被用作飼料添加劑。依據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全球每年消耗的抗生素總量中，有90%被用于禽畜養(yǎng)殖。如美國(guó)每年養(yǎng)殖業(yè)使用抗生素約為I萬(wàn)多噸，由于代謝率僅為10%到40%，大部分抗生素被直接排放到環(huán)境中。近年來(lái)中國(guó)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅猛，規(guī)模化、集約化的程度不斷提高，每年用于飼料添加劑的抗生素占全球使用量的50%以上。中國(guó)每年畜禽糞便產(chǎn)生量約是工業(yè)固體廢棄物的2倍以上，部分地區(qū)甚至超過(guò)4倍。大量抗生素將進(jìn)入環(huán)境中而可能導(dǎo)致生物毒性和致病菌產(chǎn)生抗藥性基因等環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)和生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。而以歐盟為例，氟喹諾酮類(lèi)和喹諾酮類(lèi)作為主要的獸藥抗生素，其在歐盟主要國(guó)家使用比例僅次于四環(huán)素類(lèi)、磺胺類(lèi)，由此帶來(lái)的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)不容忽視。而對(duì)環(huán)境中該類(lèi)抗生素的檢測(cè)是評(píng)估其環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)、生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)的首要步驟，也是對(duì)其進(jìn)行治理的基礎(chǔ)環(huán)節(jié)，因此迫切需要開(kāi)發(fā)一種復(fù)雜基質(zhì)中氟喹諾酮類(lèi)(FQs)的檢測(cè)分析方法。
[0003]由于畜禽糞便基質(zhì)復(fù)雜，F(xiàn)Qs分析時(shí)受到的雜質(zhì)干擾大。目前在環(huán)境基質(zhì)中抗生素的檢測(cè)技術(shù)中，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)具有檢測(cè)范圍寬，靈敏度高，較強(qiáng)的抗干擾能力等特點(diǎn)，但由于成本較高而影響到它的廣泛應(yīng)用。而熒光檢測(cè)器(FLD)成本相對(duì)較低而且對(duì)于FQs類(lèi)物質(zhì)靈敏度較高，因此通過(guò)高效液相色譜-熒光分析法(LC/FLD)檢測(cè)FQs應(yīng)用越來(lái)越多。潘等使用LC/FLD對(duì)食品中6種FQs檢測(cè)分析，Li等使用LC/FLD對(duì)土壤中的4種FQs進(jìn)行殘留檢測(cè)，但回收率相對(duì)偏低(洛美沙星為61.3%?67.8%、恩諾沙星63.2%?75.7%)。Zhao等建立了 LC-FLD對(duì)禽畜糞便中7中FQs同時(shí)檢測(cè)分析的方法，但由于未經(jīng)過(guò)SPE凈化過(guò)程，方法定量限偏高(0.031?0.15 mg/kg)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是解決復(fù)雜基質(zhì)中FQs不易于分析測(cè)定，且現(xiàn)有分析測(cè)定技術(shù)回收率低、定量限高、成本高等問(wèn)題，建立了一種基于固相萃取一高效液相色譜熒光檢測(cè)法，用以分析雞糞中6種氟喹諾酮類(lèi)(FQs):諾氟沙星(N0R)、環(huán)丙沙星(CIP)、洛美沙星(L0M)、達(dá)氟沙星(DAN)、恩諾沙星(ENR)、沙拉沙星(SAR)。該方法具有較高的回收率，較低的定量限，且分析成本較LC-MS/M S方法低，為復(fù)雜基質(zhì)中FQs的檢出提供了一種高效經(jīng)濟(jì)的方法，具有較高的推廣價(jià)值。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案是:一種定量檢測(cè)雞糞中氟喹諾酮類(lèi)的方法，包括如下步驟:(1)雞糞樣品經(jīng)冷凍干燥；
(2)粉碎雞糞樣品并過(guò)篩；
(3)加入EDTA-Mcllvaine和乙腈混合提取劑，漩渦混勻并超聲處理；
(4)離心獲上清液為提取液，重復(fù)提取1-3次，合并各次提取液；
(5)去除有機(jī)溶劑后，提取液用濾膜過(guò)濾；
(6)過(guò)濾液過(guò)HLB柱并抽干，用5%甲醇溶液清洗柱，最后經(jīng)甲醇洗脫目標(biāo)抗生素，收集洗脫液；
(7)吹干，用乙腈/0.7%磷酸定容，充分溶解后過(guò)濾即可用于定量檢測(cè)。
[0006]上述的方法，所述氟喹諾酮類(lèi)包括NOR、CIP、LOM、DAN、ENR和SAR六種物質(zhì)。
[0007]上述的方法，第(2)步粉碎并過(guò)篩是后過(guò)2mm篩。
[0008]第(3)步加入EDTA-Mcllvaine:乙腈=1:1 (體積比)的混合提取劑，鏇潤(rùn)混勻30S，超聲10-25 min，其中混合提取劑為pH≤3.0，優(yōu)選pH=2，超聲提取時(shí)間為15min。
[0009]第(4)步離心 獲上清液為提取液，重復(fù)提取2次，合并3次提取液，其中以3000至5000 rpm進(jìn)行離心。
[0010]第(5)步去除有機(jī)溶劑采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在40°C左右水浴中減壓蒸發(fā)，提取液用過(guò)1.2μπι玻璃纖維濾膜。
[0011]第(6)步的具體步驟是:以I mL/min的速率通過(guò)HLB柱并抽干,用6 mL 5%甲醇溶液清洗柱，最后經(jīng)5 mL甲醇洗脫目標(biāo)抗生素，收集洗脫液。
[0012]第(7)步的具體步驟是:在40°C條件下高純氮?dú)獯蹈?，用體積比為1:9的乙腈/0.7%磷酸定容至I mL，超聲5 min促溶，過(guò)0.22 μ m濾膜后待測(cè)。
[0013]所述的方法，采用高效液相色譜熒光檢測(cè)法測(cè)定氟喹諾酮類(lèi)抗生素。
[0014]所述的方法，所述檢測(cè)具體操作步驟是:WATERS Xterra RP18色譜柱(250mmX4.6 ymX5 μ m,)，柱溫:40°C ;熒光檢測(cè)器(FLD)檢測(cè)波長(zhǎng):激發(fā)波長(zhǎng)280 nm,發(fā)射波長(zhǎng)450 nm:進(jìn)樣體積:20 μ L ;流速:0.8 ml/min,采用二元梯度泵,流動(dòng)相A為乙腈,流動(dòng)相B為0.7 %磷酸溶液；梯度洗脫程序:0~20 min, 10% A ;20~35 min, 10%~25% A ；35 ~45 min, 40% A ；45 ~55 min; 10% A0
[0015]本發(fā)明采用固相萃取一高效液相色譜熒光檢測(cè)法分析雞糞中6種氟喹諾酮類(lèi)(FQs)，選用Mcllvaine- Na2EDTA緩沖液/乙腈(1:1) (pH=2)作為提取劑，超聲提取時(shí)間15分鐘，經(jīng)HLB固相柱凈化，選用甲醇為洗脫劑，濃縮后用HPLC/FLD檢測(cè)時(shí)應(yīng)用乙腈/0.7%磷酸(1:9，V/V)為流動(dòng)相。FQs在0.01~1.0 mg/kg濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好線性關(guān)系，R2為
0.9969 ~0.9999。加標(biāo)(濃度水平 0.01,0.5、1.0 mg/kg 干重)回收率達(dá) 76.7% ~106.7%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差0.7%~14.4% (n=4)。方法檢出限為0.002~0.022 mg/kg,方法定量限為
0.0068 ~0.074 mg/kg。
[0016]對(duì)FQs類(lèi)物質(zhì)從環(huán)境樣品中提取，提取劑的選擇非常重要。目前常用的提取劑有Mg (NO3) 2溶液、EDTA-Mcllvaine緩沖液和乙腈等無(wú)機(jī)有機(jī)溶液。比較研究50%Mg (NO3) 2-2.5% NH3.H20、EDTA-MclIvaine 緩沖液(pH=4)和乙腈等無(wú)機(jī)、有機(jī)提取液，甲醇:乙酸:水(6:1:3,V/V)和EDTA-Mcllvaine:乙腈(1:1,V/V)等混合提取液，以及EDTA-Mcllvaine緩沖液與甲醇:乙酸:水(6:1:3，V/V)復(fù)合提取時(shí)各目標(biāo)物的回收率后，本發(fā)明選擇EDTA-Mcllvaine:乙腈(1:1)作為提取劑，NOR、CIP、LOM、DAN、ENR和SAR六種物質(zhì)的回收率分別為 83.6%±4.4 ,68.0%±4.9,74.1%±6.1,79.7%±4.8,90.8%±4.7 和64.3%±5.5。
[0017]氟喹諾酮類(lèi)抗生素結(jié)構(gòu)式含哌嗪基，有2個(gè)pKa值(ρΚ&1=5.5?6.3，pKa2=7.6?
8.5)，在水溶液酸性條件下(通常pH〈5)，氟喹諾酮是陽(yáng)離子形式，在對(duì)喹諾酮類(lèi)樣品預(yù)處理中大多將樣品PH調(diào)節(jié)為酸性，將其轉(zhuǎn)化為陽(yáng)離子形式有利于提取。在選擇EDTA-Mcllvaine:乙腈(1:1)作為提取劑，用HCL或NaOH調(diào)節(jié)提取液pH為1.0?8.0后對(duì)樣品進(jìn)行提取，過(guò)SPE柱后上機(jī)測(cè)定。經(jīng)對(duì)比研究，本發(fā)明在選擇EDTA-Mcllvaine:乙腈=1:1作為提取劑條件下，調(diào)節(jié)提取劑pH至pH=2。
[0018]提取時(shí)間影響目標(biāo)物的回收率，提取時(shí)間過(guò)短無(wú)法有效將目標(biāo)抗生素從基質(zhì)中提取出來(lái)，致使回收率低，而提取時(shí)間多長(zhǎng)這可能將基質(zhì)中的有機(jī)物雜質(zhì)提取出來(lái)，影響隨后的分析測(cè)定。本發(fā)明在40°C條件下超聲提取時(shí)間確定為15 min，采用3次提取，合并提取液，以備下一步處理。
[0019]由于雞糞基質(zhì)的復(fù)雜性，需選擇適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑盡可能將目標(biāo)物洗脫，同時(shí)避免洗脫下來(lái)干擾雜質(zhì)影響目標(biāo)物的檢測(cè)。目前常用的洗脫溶劑有甲醇、甲醇:丙酮(80:20)、甲醇:乙酸乙酯(1:9)和二氯甲烷。分別以甲醇，甲醇:丙酮(80:20)、甲醇:乙酸乙酯(1:9)和二氯甲烷為洗脫劑，進(jìn)行對(duì)比研究，本發(fā)明選用甲醇作為洗脫劑，洗脫體積為4ml。
[0020]本發(fā)明中，樣品前處理后采用初始流動(dòng)相乙腈/0.7%磷酸(1: 9，V/V)定容，色譜峰峰形對(duì)稱(chēng)，分離效果較好。定容后采取超聲5 min促溶。
[0021 ] 本發(fā)明中色譜儀器運(yùn)行條件及環(huán)境如下:WATERS Xterra RP18色譜柱(250mmX4.6 ymX5 μ m,)，柱溫:40°C ;熒光檢測(cè)器(FLD)檢測(cè)波長(zhǎng):激發(fā)波長(zhǎng)280 nm,發(fā)射波長(zhǎng)450 nm;進(jìn)樣體積:20 μ L ;流速:0.8 ml/min。二元梯度泵,流動(dòng)相A為乙腈,流動(dòng)相B為0.7 %磷酸溶液。梯度洗脫程序:0?20 min, 10% A ;20?35 min, 10%?25% A ;35?45 min,40% A ；45 ?55 min;10% A。
[0022]高效液相色譜熒光檢測(cè)法(SPE-HPLC/FLD)測(cè)定氟喹諾酮類(lèi)(FQs)抗生素，流動(dòng)相的選擇非常重要。目前采用0.025 mo I/L的乙酸銨一 0.5%乙酸緩沖液與乙腈或0.7%磷酸與乙腈作為流動(dòng)相較為常見(jiàn)。本發(fā)明選用0.7%磷酸與乙腈作為流動(dòng)相，使得6種FQs抗生素出峰時(shí)間穩(wěn)定,分離效果較好,分離度均大于1.5,無(wú)拖尾現(xiàn)象。
[0023]本發(fā)明與現(xiàn)有檢測(cè)方法相比，具有以下優(yōu)點(diǎn):
1、回收率高:加標(biāo)(濃度水平0.01、0.5、1.0 mg/kg干重)回收率達(dá)76.7%?106.7% ；
2、定量限低:定量限為0.0068?0.074 mg/kg ；
3、檢出限低:方法檢出限為0.002?0.022 mg/kg ；
4、分析成本低:分析成本較LC-MS/MS方法低。
【具體實(shí)施方式】
[0024]實(shí)施例一
比較 50% Mg(NO3)2-2.5% NH3.H20、EDTA-Mcllvaine 緩沖液(pH=4)和乙腈等無(wú)機(jī)、有機(jī)提取液，甲醇:乙酸:7jC (6:1:3, V/V)和EDTA-Mcllvaine:乙腈(1:1,V/V)等混合提取液，以及EDTA-Mcllvaine緩沖液與甲醇:乙酸:水(6:1:3，V/V)復(fù)合提取時(shí)各目標(biāo)物的回收率。結(jié)果如表1，從表中可以看出，單獨(dú)使用無(wú)機(jī)提取液50% Mg(NO3)2-2.5% NH3-H2O,EDTA-Mcllvaine緩沖液或有機(jī)提取液乙腈時(shí)，均無(wú)法從基質(zhì)中有效提取出目標(biāo)物；而使用有機(jī)無(wú)機(jī)混合提取液甲醇:乙酸:水(6:1:3，V/V)時(shí)，對(duì)于NOR、CIP等目標(biāo)物提取效率仍然偏低，采用EDTA-Mcllvaine緩沖液與甲醇:水:乙酸=6:1:3復(fù)合提取時(shí)，提取效率基本能達(dá)到要求，但實(shí)驗(yàn)提取劑使用量較大，提取步驟較繁瑣，需兩種提取劑先后各提取兩次，前處理后的樣品上機(jī)檢測(cè)時(shí)檢出的雜質(zhì)也較多；而使用EDTA-Mcllvaine:乙腈(1:1)時(shí)，6種目標(biāo)物回收率均較理想，且溶劑使用量小，提取步驟簡(jiǎn)便，雜質(zhì)也較少。這是因?yàn)镕Qs容易與環(huán)境樣品中的二價(jià)或三價(jià)金屬離子形成化合物，加入螯合劑EDTA可以防止被二價(jià)或三價(jià)金屬離子綁定。而乙腈相對(duì)于甲醇、乙酸乙酯、二氯甲烷等具有更好的提取喹諾酮類(lèi)的效果，并且乙腈在沉淀糞便樣品中蛋白質(zhì)方面效果較好，要優(yōu)于甲醇和丙酮。綜合考慮，選擇EDTA-Mcllvaine:乙腈(1:1)作為提取劑。
[0025]表1不同提取劑的比較
【權(quán)利要求】
1.一種定量檢測(cè)雞糞中氟喹諾酮類(lèi)的方法，其特征在于: (1)雞糞樣品經(jīng)冷凍干燥； (2)粉碎雞糞樣品并過(guò)篩； (3)加入EDTA-Mcllvaine和乙腈混合提取劑，漩渦混勻并超聲處理； (4)離心獲上清液為提取液，重復(fù)提取1-3次，合并各次提取液； (5)去除有機(jī)溶劑后，提取液用濾膜過(guò)濾； (6)過(guò)濾液過(guò)HLB柱并抽干，用5%甲醇溶液清洗柱，最后經(jīng)甲醇洗脫目標(biāo)抗生素，收集洗脫液； (7)吹干，用乙腈/0.7%磷酸定容，充分溶解后過(guò)濾即可用于定量檢測(cè)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量檢測(cè)雞糞中氟喹諾酮類(lèi)的檢測(cè)分析方法，其特征在于:氟喹諾酮類(lèi)是NOR、CIP、LOM、DAN、ENR和SAR六種物質(zhì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量檢測(cè)雞糞中氟喹諾酮類(lèi)的檢測(cè)分析方法，其特征在于:第(2)步粉碎并過(guò)篩是后過(guò)2mm篩。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量檢測(cè)雞糞中氟喹諾酮類(lèi)的檢測(cè)分析方法，其特征在于:第(3)步加入EDTA-Mcllvaine:乙腈=1:1 (體積比)的混合提取劑,鏇潤(rùn)混勻30 S，超聲10-25 min，其中混合提取劑為pH≤3.0，優(yōu)選pH=2，超聲提取時(shí)間為15min。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量檢測(cè)雞糞中氟喹諾酮類(lèi)的檢測(cè)分析方法，其特征在于:第(4)步離心獲上清液為提取液，重復(fù)提取2次，合并3次提取液，其中以3000至5000 rpm進(jìn)行離心。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量檢測(cè)雞糞中氟喹諾酮類(lèi)的檢測(cè)分析方法，其特征在于:第(5)步去除有機(jī)溶劑采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在40°C左右水浴中減壓蒸發(fā)，提取液用過(guò)1.2μπι玻璃纖維濾膜。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量檢測(cè)雞糞中氟喹諾酮類(lèi)的檢測(cè)分析方法，其特征在于:第(6)步的具體步驟是:以I mL/min的速率通過(guò)HLB柱并抽干，用6 mL 5%甲醇溶液清洗柱，最后經(jīng)5 mL甲醇洗脫目標(biāo)抗生素，收集洗脫液。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量檢測(cè)雞糞中氟喹諾酮類(lèi)的檢測(cè)分析方法，其特征在于:第(7)步的具體步驟是:在40°C條件下高純氮?dú)獯蹈?，用體積比為1:9的乙腈/0.7%磷酸定容至I mL，超聲5 min促溶，過(guò)0.22 μ m濾膜后待測(cè)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量檢測(cè)雞糞中氟喹諾酮類(lèi)的檢測(cè)分析方法，其特征在于:采用高效液相色譜熒光檢測(cè)法測(cè)定氟喹諾酮類(lèi)抗生素。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的定量檢測(cè)雞糞中氟喹諾酮類(lèi)的檢測(cè)分析方法，其特征在于: 所述檢測(cè)具體操作步驟是:WATERS Xterra RP18色譜柱(250 mmX4.6 ymX5 μ m,),柱溫:40°C;熒光檢測(cè) 器(FLD)檢測(cè)波長(zhǎng):激發(fā)波長(zhǎng)280 nm,發(fā)射波長(zhǎng)450 nm:進(jìn)樣體積:20μ L ;流速:0.8 ml/min，采用二元梯度泵，流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為0.7 %磷酸溶液；梯度洗脫程序:0 ~20 min, 10% A ；20 ~35 min, 10% ~25% A ；35 ~45 min, 40% A ；45 ~55min;10% A。
【文檔編號(hào)】G01N30/02GK103969362SQ201410093362
【公開(kāi)日】2014年8月6日 申請(qǐng)日期:2014年3月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月14日
【發(fā)明者】薛南冬, 劉博 , 張石磊, 李發(fā)生, 陳宣宇, 孟磊 申請(qǐng)人:中國(guó)環(huán)境科學(xué)研究院