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環(huán)境水中非揮發(fā)性有機(jī)物雌激素活性檢測(cè)方法
【專利摘要】環(huán)境水中非揮發(fā)性有機(jī)物雌激素活性檢測(cè)方法。本發(fā)明提供了一種檢測(cè)環(huán)境水中非揮發(fā)性有機(jī)物雌激素活性的方法，用以評(píng)價(jià)環(huán)境水體中綜合雌激素活性強(qiáng)度。本發(fā)明是通過(guò)固相萃取的方法，提取定量水樣中的有機(jī)物，將所提取的有機(jī)物與重組酵母菌共同培養(yǎng)后，檢測(cè)并評(píng)價(jià)水樣中有機(jī)物的雌激素活性。本發(fā)明所用重組酵母菌的DNA序列整合有人的雌激素受體hER基因，當(dāng)具有雌激素活性的物質(zhì)與雌激素受體結(jié)合，可以分泌β-半乳糖苷酶，它能分解底物β-D半乳糖苷氯酚紅，使其由黃色變?yōu)榧t色，通過(guò)檢測(cè)波長(zhǎng)540nm吸光度值，計(jì)算其雌激素活性的強(qiáng)度。同時(shí)，在水樣有機(jī)物雌激素活性檢測(cè)中，以17β-雌二醇作為陽(yáng)性對(duì)照物，結(jié)合其與重組酵母菌的反應(yīng)模型，可推算出水樣有機(jī)物的雌激素活性強(qiáng)度。
【專利說(shuō)明】環(huán)境水中非揮發(fā)性有機(jī)物雌激素活性檢測(cè)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于環(huán)境科學(xué)領(lǐng)域，涉及環(huán)境水樣評(píng)價(jià)技術(shù)，具體涉及環(huán)境水樣中非揮發(fā) 性有機(jī)物的雌激素活性檢測(cè)與評(píng)價(jià)。

【背景技術(shù)】
[0002] 環(huán)境中存在多種能模擬、干擾動(dòng)物及人類內(nèi)分泌系統(tǒng)的物質(zhì)，這些外源性化學(xué) 物進(jìn)入機(jī)體后，干擾體內(nèi)內(nèi)分泌物質(zhì)的合成、釋放、運(yùn)輸、代謝、結(jié)合等過(guò)程，并且能夠激 活或抑制內(nèi)分泌系統(tǒng)的功能，從而破壞機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。這一大類物質(zhì)被統(tǒng)稱為環(huán) 境內(nèi)分泌干擾物(environmentalendocrine disrupters/environmental endocrine disrupting chemicals)。環(huán)境內(nèi)分泌干擾物從來(lái)源上可以分為天然與人工合成兩大類， 前者如植物激素異黃酮類（isoflavones)、木酚素類（lignans)等，后者如藥用雌激素 DES(Diethylstilbestrol,己烯雌酚）、殺蟲(chóng)劑（Ο,ρ'-DDT、氯丹等）、除草劑（除草醚，甲草 胺等）、工業(yè)化學(xué)物（多氯聯(lián)苯，二噁英，鉛、汞、鎘等重金屬）、塑料工業(yè)原料（酞酸酯類，烷 基酚類）等。從作用效應(yīng)上，環(huán)境內(nèi)分泌干擾物有擬雌激素作用和擬雄激素作用，但大多數(shù) 化學(xué)物質(zhì)是以雌激素效應(yīng)為主，故大部分環(huán)境內(nèi)分泌干擾物亦可稱為環(huán)境雌激素 。Carlsen 在1992年撰文指出，近50年以來(lái)人類精子質(zhì)量不斷下降，成年男性精液量減少，精子數(shù)量 下降了 50%。同時(shí)，男性生殖系統(tǒng)發(fā)育異常與病變（隱睪、尿道下裂、睪丸和前列腺癌）增 加了近一倍。許多學(xué)者把這種現(xiàn)象的發(fā)生歸因于環(huán)境雌激素的污染。研究表明，環(huán)境雌激 素對(duì)機(jī)體甲狀腺素、兒茶酚胺、睪酮等有明顯的干擾效應(yīng)，臨床上表現(xiàn)為畸型胎、性別畸型、 發(fā)育異常、生殖功能障礙、代謝紊亂，甚至癌癥等。人群流行病學(xué)調(diào)查也顯示人類的生殖障 礙，發(fā)育異常，以及某些癌癥與內(nèi)分泌干擾有關(guān)。環(huán)境雌激素的毒理學(xué)研究是目前的一大熱 點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，在雄性小鼠性分化的關(guān)鍵時(shí)期，環(huán)境內(nèi)分泌干擾物鄰苯二甲酸二辛酯（DEHP) 可導(dǎo)致其隱睪發(fā)生，且其發(fā)生率與劑量存在一定的相關(guān)性。近來(lái)人們認(rèn)為，環(huán)境內(nèi)分泌干擾 物不僅對(duì)生殖系統(tǒng)有影響，對(duì)非生殖系統(tǒng)尤其是免疫系統(tǒng)也有直接的或者間接的影響。淋 巴器官尤其是能夠分化出T細(xì)胞的胸腺可以影響生殖器官，免疫系統(tǒng)可以通過(guò)中樞神經(jīng)系 統(tǒng)一胸腺一性腺軸影響到生殖系統(tǒng)，而性腺激素也可以通過(guò)影響淋巴器官而間接影響免疫 能力。由于自身免疫性疾病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)生與機(jī)體內(nèi)性激素水 平的變化有關(guān)，而環(huán)境內(nèi)分泌干擾物可以直接打破激素平衡，所以有人認(rèn)為與后者的接觸 增大了自身免疫病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。
[0003] 水污染作為一個(gè)世界性的難題在我國(guó)表現(xiàn)尤為突出。研究資料顯示，我國(guó)各種水 體都已受到不同程度的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的污染，甚至包括人們賴以生存的水源水。檢測(cè) 評(píng)價(jià)這類物質(zhì)在水中的存在意義十分重大。針對(duì)水體中存在多種微量具雌激素活性有機(jī)物 的現(xiàn)狀，本專利旨在提出一套檢測(cè)與評(píng)價(jià)水中非揮發(fā)性混合有機(jī)物雌激素活性的方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的任務(wù)是提出一種環(huán)境水樣中非揮發(fā)性有機(jī)物雌激素活性檢測(cè)方法，用以 評(píng)價(jià)不同環(huán)境水體中多種、微量有機(jī)物（天然、人工合成）綜合的雌激素活性強(qiáng)度及其變化 規(guī)律。與已有的檢測(cè)與評(píng)價(jià)水中類雌激素污染物的方法相比，該方法快速簡(jiǎn)便，成本低廉， 所需樣品量少，靈敏度高，能夠反映水中混合有機(jī)物雌激素受體的誘導(dǎo)效應(yīng)，并且通過(guò)標(biāo)準(zhǔn) 曲線計(jì)算得到樣品中類雌激素污染物的毒性當(dāng)量值。
[0005] 實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案是：通過(guò)固相萃取的方法，將水中的有機(jī)物進(jìn)行吸附，然 后進(jìn)行洗脫、濃縮，將濃縮的有機(jī)物樣本與重組酵母菌共同培養(yǎng)，該酵母菌的DNA序列整 合有人的雌激素受體hER基因，當(dāng)具有雌激素活性的物質(zhì)與雌激素受體結(jié)合，可以分泌產(chǎn) 生一種生物酶（β-半乳糖苷酶），它能分解底物β-D半乳糖苷氯酚紅（Chlorophenol red-β -dgalactopyranoside，CPRG)，使其由黃色變?yōu)榧t色，通過(guò)檢測(cè)540nm吸光度值，計(jì) 算其雌激素活性的強(qiáng)度；同時(shí)，以雌二醇作為陽(yáng)性對(duì)照物，結(jié)合其與重組酵母菌的反應(yīng)模 型，推算出水樣有機(jī)物樣本的雌激素活性。
[0006] 本發(fā)明所使用的酵母菌株為雌激素受體重組酵母菌（Saccharomyces cerevisiae)，可根據(jù)以下文獻(xiàn)所提出的方法進(jìn)行構(gòu)建。
[0007] ① Benita S. Katzenellenbogen, Bhavna Bhardwaj, Henry Fang, B. Avery Ince, Farzad Pakdel，Joseph C. Reese, David Schodin and Carol K. Wrenn. Hormone binding and transcription activation by estrogen receptors:Analyses using mammalian and yeast systems. The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology，1993， 47:39-48 ；
[0008] ②何世華，梁增輝，戰(zhàn)威，賈凌志，晁福寰.環(huán)境雌激素重組酵母測(cè)評(píng)系統(tǒng)的建 立·環(huán)境與健康雜志，2002,19(1) :57-59 ;
[0009] ③李劍，饒凱鋒，馬梅，王子健.酵母雙雜交技術(shù)構(gòu)建重組雌激素受體相關(guān)受體 (ERR)基因酵母.環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2011，31 (1): 33-39。
[0010] 本發(fā)明提供的環(huán)境水樣中非揮發(fā)性有機(jī)物雌激素活性檢測(cè)方法，包括以下步驟：
[0011] 步驟一：通過(guò)固相萃取的方法，對(duì)水中的微量有機(jī)物進(jìn)行吸附、富集，然后進(jìn)行洗 脫、濃縮，得到濃縮有機(jī)物樣本。
[0012] 步驟二：酵母菌增殖培養(yǎng)基、測(cè)試培養(yǎng)基和酵母菌液的制備。
[0013] ①酵母菌增殖培養(yǎng)基為液體培養(yǎng)基，每升包括以下成分：
[0014] KH2P0411. 5 ?13. 5g ;
[0015] (NH4)2S041. 5 ?2. 0g ;
[0016] K0H3.5?4.2g;
[0017] MgS040. 12 ?0· 22g ;
[0018] Fe2 (S04) 30. 65 ?0· 80mg ;
[0019] L-白氨酸 31 ?50mg ;
[0020] L-組氨酸 40 ?6〇mg ;
[0021] 腺噪呤 33 ?50mg ;
[0022] L-精氨酸-HC1 15 ?22mg ;
[0023] L-甲硫氨酸15?22mg ;
[0024] L-酪氨酸 22 ?35mg ;
[0025] L-異亮氨酸22?35mg ;
[0026] L-賴氨酸-HC1 22 ?35mg ;
[0027] L_苯丙氨酸19?25mg ;
[0028] L-谷氨酸 85 ?92mg ;
[0029] L_ 繳氛酸 130 ?156mg ;
[0030] L-絲氨酸 310 ?350mg ;
[0031] L-天門(mén)冬氨酸90?llOmg ;
[0032] 維生素 ΒΙΟ. 3 ?0· 5mg ;
[0033] 維生素 Β60· 3 ?0· 5mg ;
[0034] 維生素 Β30· 3 ?0· 5mg ;
[0035] 內(nèi)消旋肌醇 Myo-inositoll. 1 ?3. 3mg ;
[0036] Biotin 維生素 Η 0· 3 ?0· 5mg ;
[0037] L-蘇氨酸 1· 9 ?2. 8g ;
[0038] 硫酸銅5?9mg ;
[0039] 葡萄糖18?22g ;
[0040] 酵母菌增殖培養(yǎng)基的配制方法：在1升超純水中依次加入以上各種成分，通過(guò)震 蕩使先加入的成分溶解后，再加入后一成分，直至最后成分溶解，混勻；再加入顯色底物 β -D半乳糖苷氯酚紅（CPRG) 100mg，即得到酵母菌增殖培養(yǎng)基；酵母菌增殖培養(yǎng)基配制完 畢后應(yīng)過(guò)濾除菌。
[0041] ②酵母菌液的制備：將雌激素受體重組酵母菌株接種至酵母菌增殖培養(yǎng)基后， 30°C振蕩培養(yǎng)24h?48h得到酵母菌液，在此酵母菌液加入甘油，酵母菌液與甘油的體積比 85 :15,混勻后每2mL分裝于1支無(wú)菌EP管中，保存于-80°C低溫冰箱。
[0042] ③測(cè)試培養(yǎng)基的配制：取50mL酵母菌增殖培養(yǎng)基加至無(wú)菌三角瓶中，從一 80°C冰 箱取含酵母菌液的EP管一支，將其解凍后取0. 2mL加入到酵母菌增殖培養(yǎng)基中，30°C搖床 中培養(yǎng)12?36h，在每升新配制的酵母菌增殖培養(yǎng)基中加入15?25mL培養(yǎng)了 12?36h 的酵母菌液，形成測(cè)試培養(yǎng)基，所加酵母菌液濃度需至少滿足以下一條：①顯微鏡下計(jì)數(shù)約 4X 107個(gè)/mL ;②波長(zhǎng)640nm吸光度值為0. 8?1. 2。
[0043] 步驟三：以17β_雌二醇作為陽(yáng)性對(duì)照物，將雌二醇、濃縮有機(jī)物樣本分別與重組 酵母菌共同培養(yǎng)；即每次試驗(yàn)均設(shè)陽(yáng)性對(duì)照（17 β-雌二醇）和陰性對(duì)照（即溶劑對(duì)照，丙 酮或無(wú)水乙醇）。每個(gè)受試水樣至少設(shè)置三組平行對(duì)照。陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和受試水樣均 由所設(shè)置的濃度梯度進(jìn)行倍比稀釋，然后將其置于無(wú)菌環(huán)境中，待溶劑揮發(fā)干燥后各加入 200 μ L測(cè)試培養(yǎng)基，于30°C培養(yǎng)72h后，測(cè)量540nm和640nm吸光度值。
[0044] 步驟四：以陽(yáng)性對(duì)照物17β_雌二醇濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度值為縱坐標(biāo)繪制陽(yáng) 性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到擬合曲線及其方程，各測(cè)試水樣的吸光度值則帶入所得方程計(jì)算得 出17 β-雌二醇當(dāng)量水平；
[0045] 步驟五：對(duì)于具有雌激素活性的水樣，采用水樣量評(píng)價(jià)法和陽(yáng)性物當(dāng)量法來(lái)評(píng)價(jià) 和比較其中有機(jī)物雌激素活性的強(qiáng)度。
[0046] 水樣量評(píng)價(jià)法：
[0047] 即產(chǎn)生與陽(yáng)性物同等效應(yīng)所需要濃縮的水樣量。用EC25-E2表示各水樣中非揮發(fā) 性有機(jī)物的雌激素活性相當(dāng)于陽(yáng)性對(duì)照物17 β -雌二醇產(chǎn)生效應(yīng)最大值1/4 (l/4E2max)時(shí) 所需要的水樣量（mL)，其值越小，表示水樣中非揮發(fā)性有機(jī)化合物的雌激素活性越高。將 540nm下的吸光度與640nm下的吸光度相除以消除菌液濃度的影響，取校正后的吸光度與 水樣量進(jìn)行曲線擬合，從所得的方程中求出產(chǎn)生與陽(yáng)性對(duì)照物17 β -雌二醇最大效應(yīng)相當(dāng) 的25%活性的水樣量，即EC25-E2，以mL表示。
[0048] 陽(yáng)性物當(dāng)量法：
[0049] 雌二醇當(dāng)量（EEQs)表示一定體積水樣的雌激素活性水平所對(duì)應(yīng)的相當(dāng)效應(yīng)的陽(yáng) 性對(duì)照物17 β -雌二醇濃度，值越大其雌激素活性越強(qiáng)。將540nm下的吸光度減去640nm 下的吸光度以消除菌液濃度的影響，取校正后的陽(yáng)性對(duì)照組陽(yáng)性對(duì)照物17 β-雌二醇吸光 度最大值作為100%雌激素效應(yīng)，對(duì)校正后的陽(yáng)性對(duì)照吸光度系列進(jìn)行曲線擬合，從所得的 方程中求出50%雌激素效應(yīng)的對(duì)應(yīng)的陽(yáng)性對(duì)照物17 β -雌二醇濃度（ng)，再對(duì)校正后的樣 品吸光度系列進(jìn)行曲線擬合，求出50%雌激素效應(yīng)的水樣的量（L)，由此計(jì)算得出各水樣 的EEQs,結(jié)果以ng/L表示。
[0050] 本發(fā)明提供的檢測(cè)方法可用于：①檢測(cè)、評(píng)價(jià)與比較不同水體中有機(jī)物的雌激素 活性強(qiáng)度水平。②水環(huán)境中多種、微量混合有機(jī)物綜合的雌激素活性檢測(cè)與評(píng)價(jià)。③使水中 非揮發(fā)性有機(jī)物雌激素活性作為城鎮(zhèn)自來(lái)水廠、污水處理廠評(píng)價(jià)水處理工藝效果的指標(biāo)， 方便其選擇適合去除環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的水處理工藝和方法。
[0051] 本發(fā)明方法具體操作：
[0052] 環(huán)境水樣收集：收集容器：5L棕色玻璃瓶（預(yù)處理方法），玻璃器皿的預(yù)處理如 下：使用前需浸泡濃硫酸重鉻酸鉀洗液24h，取出以超純水沖洗至少3次洗凈，置于450°C烘 烤2h。
[0053] 環(huán)境水樣中非揮發(fā)性有機(jī)物提取方法：
[0054] C18柱的活化
[0055] 活化：使用5mL甲醇（色譜純）浸潤(rùn)lOmin后，以5mL/min的速率抽濾，重復(fù)兩次； 再使用5mL超純水浸潤(rùn)lOmin后，以5mL/min的速率抽濾，重復(fù)兩次。
[0056] 水樣過(guò)柱：各水樣以約2mL/min的流速通過(guò)活化完畢的C18柱富集水樣中的有機(jī) 物。全程監(jiān)測(cè)TOC以確保吸附柱的未飽和。
[0057] 有機(jī)物提?。河袡C(jī)物的提取按照以下步驟依次進(jìn)行：
[0058] ①淋洗：使用5mL超純水以5mL/min的速率抽濾；
[0059] ②冷凍干燥：將淋洗之后的C18柱放置于真空冷凍干燥機(jī)中凍干3h ;
[0060] ③洗脫：使用2mL甲醇（色譜純）浸潤(rùn)lOmin后，以lmL/min的速率抽濾,重復(fù)一 次；再使用2mL二氯甲烷（色譜純）浸潤(rùn)lOmin后，以lmL/min的速率抽濾；最后使用2mL 正己烷（色譜純）浸潤(rùn)lOmin后，以lmL/min的速率抽濾。
[0061] ④將所得的洗脫液置于氮吹儀中，40°C，氮吹至干品；
[0062] ⑤溶劑定容，使用無(wú)水乙醇或者丙酮定容，定容后使得0. lmL溶液中含250mL水樣 的有機(jī)物；
[0063] ⑥把定各后的樣品放直于4 C冰箱中避光保存。
[0064] 培養(yǎng)基的配制
[0065] 每升酵母菌增殖培養(yǎng)基成分包括以下成分：
[0066] ΚΗ2Ρ0411· 5 ?13. 5g ; (NH4)2S041. 5 ?2. Og ;KOH 3. 5 ?4. 2g ;MgS040. 12 ?0· 22g ; Fe2(S04)30. 65 ?0· 80mg ;L_ 白氨酸 31 ?50mg ;L_ 組氨酸 40 ?60mg ;腺噪呤 33 ?50mg ; L_精氨酸-HC1 15?22mg ;L-甲硫氨酸15?22mg ;L-酪氨酸22?35mg ;L-異亮氨酸22? 35mg ;L-賴氨酸-HC1 22?35mg L-苯丙氨酸19?25mg ;L-谷氨酸85?92mg ;L-纟顏氨酸 130?156mg ;L_絲氛酸310?350mg ;L_天門(mén)冬氛酸90?llOmg ;維生素 B10. 3?0· 5mg ; 維生素 B60. 3 ?0· 5mg ;維生素 B30. 3 ?0· 5mg ;內(nèi)消旋肌醇 Myo-inositoll. 1 ?3. 3mg ; Biotin維生素 Η 0· 3?0· 5mg ;L_蘇氨酸1. 9?2. 8g ;硫酸銅5?9mg ;葡萄糖18?22g。
[0067] 在1升超純水中依次加入以上各個(gè)物質(zhì)，邊加邊震蕩混勻。之后加入顯色底物 β-D半乳糖苷氯酚紅（CPRG)lOOmg。酵母菌增殖培養(yǎng)基配置完畢后應(yīng)過(guò)濾除菌。
[0068] 測(cè)試培養(yǎng)基的配制：
[0069] 在每升增殖培養(yǎng)基中加入15?25mL培養(yǎng)了 12?36h酵母菌液形成測(cè)試培養(yǎng)基。 所加酵母菌液濃度（需至少滿足以下一條）：①顯微鏡下計(jì)數(shù)約4X107個(gè)/mL;②吸光度值 (640nm)為 0· 8 ?1. 2。
[0070] 有機(jī)物的雌激素活性檢測(cè)
[0071] 試驗(yàn)組設(shè)陽(yáng)性對(duì)照物17 β_雌二醇、陰性對(duì)照（即溶劑對(duì)照，丙酮或無(wú)水乙醇）和 環(huán)境水樣有機(jī)濃縮物待測(cè)組。在無(wú)菌96孔板中將陽(yáng)性對(duì)照組、陰性對(duì)照組和受試水樣組均 由設(shè)置濃度梯度進(jìn)行倍比稀釋。將96孔板置于無(wú)菌環(huán)境中待溶劑揮發(fā)干燥后每孔各加入 200 μ L測(cè)試培養(yǎng)基后置于生化培養(yǎng)箱中30°C培養(yǎng)72h后測(cè)量540nm和640nm吸光度值。
[0072] 結(jié)果計(jì)算：
[0073] 1. EC25_E2 :將540nm下的吸光度與640nm下的吸光度相除以消除菌液濃度的影響， 取校正后的吸光度與水樣量進(jìn)行多項(xiàng)式擬合：
[0074]

【權(quán)利要求】
1. 一種環(huán)境水中非揮發(fā)性有機(jī)物雌激素活性檢測(cè)方法，包括以下步驟： 步驟一、通過(guò)固相萃取的方法，對(duì)待測(cè)水樣中的微量有機(jī)物進(jìn)行吸附、富集，然后進(jìn)行 洗脫、濃縮，得到濃縮有機(jī)物樣本； 步驟二、酵母菌增殖培養(yǎng)基、酵母菌液和測(cè)試培養(yǎng)基的制備： ① 酵母菌增殖培養(yǎng)基為液體培養(yǎng)基，每升包括以下成分： ΚΗ2Ρ0411· 5 ?13. 5g ; (NH4)2S041.5 ?2.0g; KOH 3· 5 ?4. 2g ; MgS040. 12 ?0· 22g ; Fe2 (S04) 30. 65 ?0. 80mg ; L -白氨酸31?50mg ; L -組氨酸40?60mg ; 腺嘌呤33?50mg ; L -精氨酸-HC1 15 ?22mg ; L -甲硫氨酸15?22mg ; L -酪氨酸22?35mg ; L -異亮氨酸22?35mg ; L -賴氨酸-HC1 22 ?35mg ; L -苯丙氨酸19?25mg ; L -谷氨酸85?92mg ; L -纟顏氨酸130?156mg ; L -絲氛酸310?350mg ; L -天門(mén)冬氨酸90?llOmg ; 維生素 B10. 3?0· 5mg ; 維生素 B60. 3?0· 5mg ; 維生素 B30. 3?0· 5mg ; 內(nèi)消旋肌醇 Myo - inositoll. 1 ?3. 3mg ; Biotin 維生素 Η 0· 3 ?0· 5mg ; L -蘇氨酸9?2. 8g ; 硫酸銅5?9mg ; 葡萄糖18?22g ; 通過(guò)震蕩使先加入的成分溶解后，再加入后一成分，直至最后成分溶解，混勻，再加入 顯色底物β -D半乳糖苷氯酚紅（CPRG)lOOmg，即得到酵母菌增殖培養(yǎng)基，酵母菌增殖培養(yǎng) 基配制完畢后應(yīng)過(guò)濾除菌； ② 酵母菌液的制備:將雌激素夸體重纟目酵母菌株接種至酵母菌增葙培養(yǎng)某后，30°C振 蕩培養(yǎng)24h?48h得到酵母菌液，在此酵母菌液加入甘油，酵母菌液與甘油的體積比85 : 15,混勻后每2mL分裝于1支無(wú)菌EP管中，保存于-80°C低溫冰箱； ③ 測(cè)試培養(yǎng)基的配制：取50mL酵母菌增殖培養(yǎng)基加至無(wú)菌三角瓶中，從一 80°C冰箱取 含酵母菌液的EP管一支，將其解凍后取0. 2mL加入到酵母菌增殖培養(yǎng)基中，30°C搖床中培 養(yǎng)12?36h ;在每升新配制的酵母菌增殖培養(yǎng)基中加入15?25mL培養(yǎng)了 12?36h的酵母 菌液，形成測(cè)試培養(yǎng)基，所加酵母菌液濃度需至少滿足以下一條：①顯微鏡下計(jì)數(shù)約4X 107 個(gè)/mL ;②波長(zhǎng)640nm吸光度值為0· 8?1. 2 ; 步驟三：以17β -雌二醇作為陽(yáng)性對(duì)照物，將雌二醇、濃縮有機(jī)物樣本分別與重組酵母 菌共同培養(yǎng)；即每次試驗(yàn)以17β -雌二醇為陽(yáng)性對(duì)照，以丙酮或無(wú)水乙醇為陰性對(duì)照，每個(gè) 受試水樣至少設(shè)置三組平行對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和受試水樣均由所設(shè)置的濃度梯度 進(jìn)行倍比稀釋，然后將其置于無(wú)菌環(huán)境中，待溶劑揮發(fā)干燥后各加入200 μ L測(cè)試培養(yǎng)基， 于30°C培養(yǎng)72h后，測(cè)量波長(zhǎng)540nm和640nm吸光度值； 步驟四：以陽(yáng)性對(duì)照物17β -雌二醇濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度值為縱坐標(biāo)繪制陽(yáng)性 對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到擬合曲線及其方程，各測(cè)試水樣的吸光度值則帶入所得方程計(jì)算得出 17 β -雌二醇當(dāng)量水平； 步驟五：對(duì)于具有雌激素活性的水樣，采用水樣量評(píng)價(jià)法或/和陽(yáng)性物當(dāng)量法來(lái)評(píng)價(jià) 和比較水樣中有機(jī)物雌激素活性的強(qiáng)度。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的采用水樣量評(píng)價(jià)法來(lái)評(píng)價(jià)和比較 水樣中有機(jī)物雌激素活性的強(qiáng)度的具體方法是：用EC25 -Ε2表示各水樣中非揮發(fā)性有機(jī)物 的雌激素活性相當(dāng)于陽(yáng)性對(duì)照物17 β -雌二醇產(chǎn)生效應(yīng)最大值1/4 (l/4E2max)時(shí)所需要的 水樣量（mL)，其值越小，表示水樣中非揮發(fā)性有機(jī)化合物的雌激素活性越高。將540nm下的 吸光度與640nm下的吸光度相除以消除菌液濃度的影響，取校正后的吸光度與水樣量進(jìn)行 曲線擬合，從所得的方程中求出產(chǎn)生與陽(yáng)性對(duì)照物17β -雌二醇最大效應(yīng)相當(dāng)?shù)?5%活性 的水樣量，即EC25 - Ε2,以mL表示。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的采用陽(yáng)性物當(dāng)量法來(lái)評(píng)價(jià)和比較 水樣中有機(jī)物雌激素活性的強(qiáng)度的具體方法是：雌二醇當(dāng)量（EEQs)表示一定體積水樣的 雌激素活性水平所對(duì)應(yīng)的相當(dāng)效應(yīng)的陽(yáng)性對(duì)照物17 β -雌二醇濃度，值越大其雌激素活性 越強(qiáng)，將540nm下的吸光度減去640nm下的吸光度以消除菌液濃度的影響，取校正后的陽(yáng) 性對(duì)照組陽(yáng)性對(duì)照物17 β -雌二醇吸光度最大值作為100%雌激素效應(yīng)，對(duì)校正后的陽(yáng)性 對(duì)照吸光度系列進(jìn)行曲線擬合，從所得的方程中求出50%雌激素效應(yīng)的對(duì)應(yīng)的陽(yáng)性對(duì)照物 17β -雌二醇濃度（ng)，再對(duì)校正后的樣品吸光度系列進(jìn)行曲線擬合，求出50%雌激素效 應(yīng)的水樣的量（L)，由此計(jì)算得出各水樣的EEQs，結(jié)果以ng/L表示。
【文檔編號(hào)】G01N21/78GK104267025SQ201410476553
【公開(kāi)日】2015年1月7日 申請(qǐng)日期:2014年9月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月18日
【發(fā)明者】唐非, 魯翌, 呂學(xué)敏 申請(qǐng)人:華中科技大學(xué)