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專(zhuān)利名稱(chēng)：一種人胎盤(pán)成肌纖維母細(xì)胞的簡(jiǎn)易分離及鑒定方法
一種人胎盤(pán)成肌纖維母細(xì)胞的簡(jiǎn)易分離及鑒定方法發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明涉及從人胎盤(pán)蛻膜面分離成肌纖維母細(xì)胞并對(duì)成肌纖維母細(xì)胞進(jìn)行鑒定的方法。
背景技術(shù)：
胎盤(pán)被認(rèn)為是最具有吸引力的“成體干細(xì)胞”，能在適宜的體內(nèi)或體外環(huán)境下分化為肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等多種細(xì)胞。由于胎盤(pán)干細(xì)胞材料來(lái)源相對(duì)方便，易于分離和純化，多次傳代擴(kuò)增后仍具有干細(xì)胞特性，并且不存在免疫排斥的特性；因此近年來(lái)已成為干細(xì)胞研究中的熱點(diǎn)，在免疫疾病治療、造血干細(xì)胞移植、組織工程、基因工程等領(lǐng)域具有較好的應(yīng)用前景。
成肌纖維母細(xì)胞是指胞漿中含有肌絲的肌組織前體細(xì)胞，來(lái)源于中胚層干細(xì)胞，在胚胎發(fā)育過(guò)程中先由間充質(zhì)細(xì)胞分化而來(lái)，然后分裂、融合成多核肌纖維，形成肌小管，再進(jìn)一步分化為成熟的骨骼肌細(xì)胞。
Oliver C從胎盤(pán)蛻膜中分離得到一種細(xì)胞，該細(xì)胞能表達(dá)平滑肌肌動(dòng)蛋白并且有類(lèi)似于成肌纖維細(xì)胞的亞顯微結(jié)構(gòu)；Zuzana Strakova從胎盤(pán)中分離的成肌纖維細(xì)胞,在特定培養(yǎng)基誘導(dǎo)下，能夠分化為脂肪細(xì) 胞、成骨細(xì)胞，證明了胎盤(pán)成肌纖維細(xì)胞的多潛能性，為其在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究提供理論支持；Lud0ViC Micallef研究發(fā)現(xiàn)成肌纖維細(xì)胞在受傷組織傷痕修復(fù)及功能恢復(fù)方面起著重要的作用；而01^ Eyal在體外把胎盤(pán)肌纖維細(xì)胞于雌激素等誘導(dǎo)因子共同培養(yǎng)，證明了催乳素可通過(guò)自我分泌的機(jī)理阻止子宮細(xì)胞的蛻膜化。成肌纖維細(xì)胞獨(dú)有的特點(diǎn)和多潛能性，及其材料來(lái)源豐富，為細(xì)胞模型建立及再生醫(yī)學(xué)的研究提供了良好材料。
然而，目前國(guó)內(nèi)針對(duì)胎盤(pán)成纖維母細(xì)胞的分離鮮有報(bào)道，即使有報(bào)道，也主要集中在MSC或干細(xì)胞的分離方面，如CN 102586184 A(中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?01210044638.6，
公開(kāi)日期2012年7月18日)公開(kāi)題為“建立胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞庫(kù)的方法”的發(fā)明；CN 101395266 A(中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?00680053575.3，
公開(kāi)日期2009年3月25日)。
在國(guó)際上關(guān)于胎盤(pán)纖維母細(xì)胞的報(bào)道中，分離方法都集中于酶消化法，但在消化過(guò)程中有很多酶的參與:如美國(guó)伊利諾伊大學(xué)Zuzana Strakova在分離胎盤(pán)成纖維細(xì)胞時(shí),使用膠原酶、脫氧核糖核酸酶、透明質(zhì)酸酶、鏈霉蛋白酶四種酶混合反應(yīng)消化獲得成纖維細(xì)胞，多種酶的參與勢(shì)必會(huì)造成實(shí)驗(yàn)步驟上的復(fù)雜和資源的不必要浪費(fèi)。
成肌纖維母細(xì)胞由間充質(zhì)干細(xì)胞分化而來(lái)，那么其應(yīng)該保持著間充質(zhì)干細(xì)胞的一些特性，包含貼壁生長(zhǎng)特性，特定細(xì)胞表面抗原標(biāo)志物的表達(dá)，向成脂，成骨方向的分化的能力坐寸ο 成肌纖維母細(xì)胞是成體干細(xì)胞的一種，能夠自我更新并且能夠特化形成組成該類(lèi)型組織的細(xì)胞，其可能表達(dá)一種或者多種多能干細(xì)胞因子。
結(jié)蛋白(Desmin)是一種中間絲蛋白，廣泛存在于大血管的平滑肌細(xì)胞，通過(guò)鑒定結(jié)蛋白的表達(dá)，可以驗(yàn)證細(xì)胞的肌原特性。且有文獻(xiàn)報(bào)道隨著成肌纖維母細(xì)胞的純化，結(jié)蛋白的表達(dá)也逐步增強(qiáng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種簡(jiǎn)單實(shí)用的從胎盤(pán)蛻膜層大量分離成肌纖維母細(xì)胞的方法和鑒定分離的成肌纖維母細(xì)胞的方法。
本發(fā)明的胎盤(pán)成纖維母細(xì)胞分離方法是，利用手術(shù)刀及鑷子剔除蛻膜面的輸血組織等組織，僅留取靠近胎兒的蛻面，只是用膠原酶消化組織，其具體步驟包括:
1、取新鮮胎盤(pán)組織，用手術(shù)刀在胎盤(pán)中央處取約5cm長(zhǎng)寬的組織；用生理鹽水清洗去除組織中血液；
2、用鑷子手術(shù)刀剝除羊膜和底蛻膜上的血管組織，留取胎兒面蛻膜組織；
3、胎盤(pán)嬰兒面蛻膜組織用75%酒精快速洗滌10秒；
4,75%酒精消毒洗滌后以生理鹽水洗滌兩次； 5、用手術(shù)刀把胎兒面蛻膜組織切割成0.5cm左右碎片；
6、以與組織碎片等體積的含1%膠原酶I的DMEM消化液37°C消化16-18 h， 消化溶液中無(wú)胎盤(pán)組織片后停止消化；
7、離心收集單個(gè)核細(xì)胞，用10%胎牛血清和200單位青鏈霉素雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細(xì)胞；
8、在37°C、5% CO2、飽和濕度下培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，誘導(dǎo)貼壁；
9、細(xì)胞形成單克隆后，挑取單克隆細(xì)胞培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)到90%時(shí)，0.25%胰酶消化，即得胎盤(pán)成肌纖維母細(xì)胞。
本發(fā)明還通過(guò)流式檢測(cè)細(xì)胞表面抗原和細(xì)胞周期、細(xì)胞多項(xiàng)分化潛能實(shí)驗(yàn)鑒定分離純化后所得細(xì)胞的間質(zhì)細(xì)胞特性，通過(guò)多能性干細(xì)胞因子的檢測(cè)鑒定細(xì)胞的干性，通過(guò)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及細(xì)胞結(jié)蛋白的表達(dá)鑒定細(xì)胞的肌原性。
10、正常條件下培養(yǎng)分離的成肌纖維細(xì)胞，培養(yǎng)過(guò)程中觀察細(xì)胞生長(zhǎng)特點(diǎn)及形態(tài)學(xué)變
化；
11、取培養(yǎng)的第三代細(xì)胞，流式檢測(cè)細(xì)胞表面抗原⑶90、⑶44、⑶29、⑶45、HLA-DR，同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞周期檢測(cè)；
12、取培養(yǎng)的第三代細(xì)胞進(jìn)行多能干細(xì)胞因子0CT4、S0X2、Nanog的表達(dá)檢測(cè)；
13、取培養(yǎng)的第三代細(xì)胞進(jìn)行肌原性結(jié)蛋白的表達(dá)檢測(cè)；
14、取培養(yǎng)的第三代細(xì)胞進(jìn)行向成骨，成脂肪分化的檢測(cè)。
本發(fā)明利用手術(shù)刀及鑷子剔除蛻膜面的輸血組織等組織，僅留取近胎兒的蛻面，只是用膠原酶消化組織，剔除不必要的組織，不僅能減少酶使用量、降低成本，減少消化時(shí)間，同時(shí)避免了大量雜細(xì)胞的引入，使細(xì)胞純化更為方便。可使所得原代細(xì)胞在較短的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)純化為目的細(xì)胞。
本發(fā)明采用機(jī)械分散法與一種酶消化的一步法，此法操作簡(jiǎn)單，耗時(shí)時(shí)間較短，使用少量的消化酶即可達(dá)到好的分離效果，有利于后期此類(lèi)分離方法的規(guī)模放大。同時(shí)采用特殊試劑前處理組織樣本，在樣本來(lái)源不確認(rèn)的情況下，大大降低污染的風(fēng)險(xiǎn)。
本發(fā)明提供的分離所得肌原纖維母細(xì)胞的鑒定方法組合，一站式解決細(xì)胞的鑒定問(wèn)題，且鑒定方法和結(jié)果可信、有效。


圖1:細(xì)胞形態(tài): A:單個(gè)細(xì)胞照片 B:細(xì)胞單克隆照片 C:細(xì)胞融合度達(dá)到90%照片 圖2:流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表型 圖3:流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 圖4:細(xì)胞成骨細(xì)胞鑒定檢測(cè) 圖5:細(xì)胞成脂肪細(xì)胞檢測(cè) 圖6:細(xì)胞多能干細(xì)胞因子檢測(cè)，從左至右分別為:0CT4、S0X2、Nanog的RT-PCR電泳照片 圖7:細(xì)胞結(jié)蛋白表達(dá)檢測(cè) 實(shí)施方式
本發(fā)明公開(kāi)了一種人胎盤(pán)成肌纖維母細(xì)胞的分離和鑒定方法，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類(lèi)似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的，它們都被視為包括在本發(fā)明中。
為了使本領(lǐng)域技術(shù)人員更好的理解本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合具體具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。 實(shí)施例一胎盤(pán)成肌纖維母細(xì)胞分離培養(yǎng) 在無(wú)菌生物安全柜中取順產(chǎn)嬰兒的新鮮胎盤(pán)組織(12小時(shí)以?xún)?nèi))，用手術(shù)刀在胎盤(pán)中央處取約5 cm長(zhǎng)寬的組織，250 mL生理鹽水洗滌2次，使勁擠壓胎盤(pán)組織，使組織中的血液充分洗出，用鑷子和手術(shù)刀剝除羊膜和底蛻膜上的輸血組織；留取胎兒面蛻膜組織，250 mL生理鹽水洗滌I次，用手術(shù)刀把胎兒面蛻膜組織切割成1.5 cm長(zhǎng)、0.5 cm寬的大小；75%酒精快速清洗消毒10秒，再以250 mL生理鹽水洗滌2次；以與組織碎片等體積的含1%膠原酶I的DMEM消化液37 °C消化16-18 h,消化溶液中無(wú)胎盤(pán)組織片后停止消化；將消化后的組織液平均分裝于2個(gè)50 mL離心管中，添加生理鹽水到50 mL, 2300 rpm,離心10 min離心收集單個(gè)核細(xì)胞；生理鹽水洗滌2次，2000 rpm，離心10 min，用含10%胎牛血清和200單位青鏈霉素雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)基中重懸單個(gè)核細(xì)胞；在37 °C、5% CO2、飽和濕度下培養(yǎng)。
原代細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)后全量換液，去除非貼壁細(xì)胞，添加新鮮培養(yǎng)基，待散在貼壁細(xì)胞形成單克隆后，挑取單克隆細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)，獲得胎盤(pán)成纖維母細(xì)胞，待細(xì)胞融合度達(dá)到90%時(shí)，胰酶消化傳代。
實(shí)施例二胎盤(pán)成肌纖維母細(xì)胞形態(tài)學(xué)鑒定 培養(yǎng)按照實(shí)施例一方法分離的成肌纖維細(xì)胞，誘導(dǎo)貼壁2天后，顯微鏡下可見(jiàn)散在的梭形貼壁細(xì)胞，將培養(yǎng)上清液全部倒掉，同時(shí)去除不貼壁的雜質(zhì)細(xì)胞，培養(yǎng)5-7天后，可見(jiàn)成放射狀的單克隆細(xì)胞形成，用細(xì)胞刮刀刮取單克隆細(xì)胞于12孔板中培養(yǎng)，待細(xì)胞數(shù)量達(dá)到5X106左右時(shí)，用于后續(xù)其它鑒定。
顯微鏡下觀察可見(jiàn)(圖1)細(xì)胞呈梭形或紡錘形，有兩極，體積小，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增力口，細(xì)胞體積變大，融合生長(zhǎng)，這些特點(diǎn)符合成肌纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)特點(diǎn)和形態(tài)學(xué)特點(diǎn)。
實(shí)施例三胎盤(pán)成肌纖維母細(xì)胞表面標(biāo)志物鑒定
分別取不同胎盤(pán)來(lái)源按照實(shí)施例一培養(yǎng)的第3代細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志，觀察不同胎盤(pán)來(lái)源細(xì)胞表面標(biāo)志的變化。消化收集細(xì)胞，計(jì)數(shù)后取I X IO6個(gè)，PBS洗滌一次，1500 rpm，離心10 min ;棄上清，殘留200 uL，吹打混勻細(xì)胞，加入FITC標(biāo)記的CD90、⑶45和APC標(biāo)記的⑶29、HLA-DR及PE標(biāo)記的⑶44抗體各10 uL，并設(shè)I管為空白對(duì)照，在4 °C下避光反應(yīng)30 min, PBS洗漆一次，1500 rpm,離心10 min,棄上清,殘留200 uL,上機(jī)檢測(cè)。
流式檢測(cè)結(jié)果圖2顯示不同胎盤(pán)來(lái)源細(xì)胞⑶90 (99%左右)、⑶44 (98%左右)、⑶29(97%左右)三種抗原的表達(dá)均高于95%以上，⑶45 (0.7%左右)、HLA-DR (0.4%左右)兩種抗原的表達(dá)均低于2%。細(xì)胞表面標(biāo)志物結(jié)果表明細(xì)胞具有間質(zhì)纖維細(xì)胞特性。
實(shí)施例四胎盤(pán)成肌纖維母細(xì)胞細(xì)胞周期檢測(cè)
按照實(shí)施例一培養(yǎng)細(xì)胞，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合度為90%時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞周期檢測(cè)。消化收集細(xì)胞，計(jì)數(shù)后取I X IO6個(gè)，PBS洗滌一次，棄上清，加入70%的乙醇-20 °C固定2 h，離心去除乙醇，用PBS洗滌一次，加入RNaseI 5 uL(20 mg/mL), 37 °C反應(yīng)30 min，PBS洗滌一次，力口入碘化丙啶(PI，50 ug/mL) 0.5 uL，4 1:避光反應(yīng)30 min，上機(jī)檢測(cè)DNA含量。
細(xì)胞周期分析結(jié)果圖3顯示，處于G0/G1期、S期、G2M期細(xì)胞比例平均為93.72%、3.7%、
2.57%。證明培養(yǎng)中的胎盤(pán)成肌纖維母細(xì)胞大部分細(xì)胞處于G0/G1靜息期，只有少數(shù)細(xì)胞處于活躍的S增殖期，具有典型的干細(xì)胞增長(zhǎng)特點(diǎn)。
實(shí)施例五胎盤(pán)成肌纖維母細(xì)胞成骨分化潛能鑒定
按照實(shí)施例一培養(yǎng)3代以上細(xì)胞，消化制成`單細(xì)胞懸液，按照2 X IO4個(gè)/cm2的密度使用含10%胎牛血清和200單位青鏈霉素雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)基接種于預(yù)鋪了 I型鼠尾膠原6孔板中，在37 °C、5% CO2、飽和濕度下培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)到50%后，更換含地塞米松
0.1 u M、抗壞血酸磷酸鹽50 u g/mL、^ -磷酸甘油10 mM的新鮮培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)，3天換液一次，共誘導(dǎo)3周，使用95%乙醇固定細(xì)胞，茜素紅染色，顯微鏡下觀察胞外鈣基質(zhì)沉淀的形成。
觀察圖4結(jié)果顯示,細(xì)胞基質(zhì)明顯有I丐基質(zhì)沉淀,表明細(xì)胞已向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化,具有間質(zhì)干細(xì)胞的特性。
實(shí)施例六胎盤(pán)成肌纖維母細(xì)胞成脂分化潛能鑒定
按照實(shí)施例一培養(yǎng)3代以上細(xì)胞，消化制成單細(xì)胞懸液，按照I X IO5個(gè)/cm2的密度使用含10%胎牛血清和200單位青鏈霉素雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)基接種于預(yù)鋪了 I型鼠尾膠原6孔板中，在37 °C、5% CO2、飽和濕度下培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%后，更換含地塞米松IU M、消炎痛0.1 mM、IBMX 0.5 mM、胰島素5 u g/ml的新鮮培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)，3天換液一次，共誘導(dǎo)3周，10%多聚甲醛固定細(xì)胞，油紅染色。
觀察圖5結(jié)果顯示，細(xì)胞產(chǎn)生的脂肪被特異性染成紅色，表明細(xì)胞已向脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)化，具有間質(zhì)干細(xì)胞的特性。
實(shí)施例七胎盤(pán)成肌纖維母細(xì)胞多能干細(xì)胞因子表達(dá)鑒定
取不同胎盤(pán)來(lái)源按照實(shí)施例一培養(yǎng)的第3代細(xì)胞，細(xì)胞量達(dá)到5X IO6個(gè)，提取細(xì)胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以cDNA為模板，使用下述引物進(jìn)行RT-PCR，檢測(cè)0CT4、S0X2和Nanog基因的表達(dá)狀況，該操作以試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，引物序列如表I所示。
表I =RT-PCR引物序列及其特性
權(quán)利要求
1.一種人胎盤(pán)成肌纖維母細(xì)胞的簡(jiǎn)便分離方法，包括取胎盤(pán)，用鑷子手術(shù)刀剝除羊膜和底蛻膜上的血管組織，留取胎兒面蛻膜組織，使用75%酒精快速消毒洗滌組織10秒，然后以生理鹽水洗滌2次，用手術(shù)刀把胎兒面蛻膜組織割成1.5 cm長(zhǎng)、0.5 cm寬的大小碎片；加入與組織碎片等體積的含1%膠原酶I的DMEM消化液，37 °C消化16-18 h，消化溶液中無(wú)胎盤(pán)組織片后停止消化，離心收集單個(gè)核細(xì)胞；用含10%胎牛血清和200單位青鏈霉素雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)基在37°C、5%C02、飽和濕度下培養(yǎng)48h，誘導(dǎo)貼壁，細(xì)胞形成單克隆后，挑取單克隆細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)到90%時(shí)，胰酶消化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1，胎盤(pán)成肌纖維母細(xì)胞來(lái)自于在胎盤(pán)嬰兒面蛻膜組織。
3.根據(jù)權(quán)利要求1，以75%酒精快速洗滌胎盤(pán)組織10秒。
4.根據(jù)權(quán)利要求1，用手術(shù)刀把胎兒面蛻膜組織割成1.5 cm長(zhǎng)、0.5 cm寬的大小片段。
5.根據(jù)權(quán)利要求1，消化液為含膠原酶I的DMEM溶液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1,消化時(shí)間為16-18h0
7.根據(jù)權(quán)利要求1，細(xì)胞培養(yǎng)使用含10%胎牛血清和200單位青鏈霉素雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)基。
8.根據(jù)權(quán)利要求1，形成單克隆后，挑取單克隆細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)，來(lái)純化細(xì)胞。
9.一種鑒定人胎盤(pán)來(lái)源成纖維母細(xì)胞的鑒定方法組合，包含:細(xì)胞形態(tài)學(xué)，細(xì)胞周期，細(xì)胞表面標(biāo)志物檢測(cè)，細(xì)胞分化能力檢測(cè)，細(xì)胞多能干細(xì)胞因子檢測(cè)及細(xì)胞結(jié)蛋白表達(dá)檢測(cè)共6種方法。
10.根據(jù)權(quán)利要求9，細(xì)胞表面標(biāo)志物檢測(cè)包括表面抗原⑶90、⑶44、⑶29、⑶45、HLA-DR。
11.根據(jù)權(quán)利要求9，采用向成脂，成骨分化的方法檢測(cè)細(xì)胞的分化能力。
12.根據(jù)權(quán)利要求9，采用檢測(cè)0CT4、S0X2、Nanog3種因子進(jìn)行細(xì)胞多能性的鑒定。
13.根據(jù)權(quán)利要求9，采用結(jié)蛋白表達(dá)鑒定細(xì)胞的肌原性。
全文摘要
本發(fā)明涉及建立人胎盤(pán)成肌纖維母細(xì)胞的分離及鑒定方法。把胎盤(pán)胎兒面蛻膜組織機(jī)械破碎后，通過(guò)含膠原酶I的DMEM消化液消化，分離為單個(gè)核細(xì)胞，用含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基在37℃、5%CO2、飽和濕度下培養(yǎng)，誘導(dǎo)貼壁，48小時(shí)后全量換液，去除非貼壁細(xì)胞，添加新鮮培養(yǎng)基，待貼壁細(xì)胞形成單克隆后，分別培養(yǎng)各單克隆細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞融合90%左右時(shí)，胰酶?jìng)鞔吹贸杉±w維母細(xì)胞。本發(fā)明采用細(xì)胞形態(tài)學(xué)，細(xì)胞周期，細(xì)胞表面標(biāo)志物檢測(cè)，細(xì)胞成脂、成骨分化能力檢測(cè)，細(xì)胞多能干細(xì)胞因子檢測(cè)及細(xì)胞結(jié)蛋白表達(dá)檢測(cè)的組合方法鑒定所得成肌纖維母細(xì)胞。
文檔編號(hào)G01N15/14GK103173405SQ20131009074
公開(kāi)日2013年6月26日 申請(qǐng)日期2013年3月21日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月21日
發(fā)明者王云虹, 李志剛, 丁煒, 王穎穎, 高長(zhǎng)青, 楊海蓮, 武曉云, 黃芳蕾, 聶晨飛, 劉潔, 李大為, 安志達(dá), 吳蘭蘭, 馬瑞, 呂巖, 康會(huì)彥, 劉學(xué)敏, 柏小麗 申請(qǐng)人:北京京蒙高科干細(xì)胞技術(shù)有限公司