久久一区二区免费播放,国产在线欧美日韩一区二区,国产综合色在线视频,精品伊人久久久香线蕉,精品视频麻豆网站,玖玖国产,国内精品久久久久影,在线观看精品视频一区二区三区,午夜久久影院,国产精品一区久久

一種高效分離和測定草坪草內(nèi)源細(xì)胞分裂素的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種高效分離和測定草坪草內(nèi)源細(xì)胞分裂素的方法，涉及植物內(nèi)源細(xì)胞分裂素的測定領(lǐng)域。本發(fā)明包括以下步驟：①內(nèi)源細(xì)胞分裂素的提?。和ㄟ^加提取液浸提，然后離心，過濾，脫色，最后進行真空濃縮，完成內(nèi)源細(xì)胞分裂素的提取；②固相萃取洗脫：溶解內(nèi)源細(xì)胞分裂素并獲得溶解液，將洗脫液真空濃縮，得固相萃取洗脫物；③高效液相色譜-質(zhì)譜分析。本發(fā)明前處理簡單，化學(xué)試劑用量少，有效節(jié)約成本，雜質(zhì)干擾?。粰z測靈敏度高、選擇性好，不需要衍生；實現(xiàn)了在植物樣品的粗提取液中直接進行多種內(nèi)源細(xì)胞分裂素的檢測；其分離提取方法、色譜分離條件和質(zhì)譜檢測方法適用于草坪草內(nèi)源細(xì)胞分裂素，回收率高，達(dá)93～96%。
【專利說明】一種高效分離和測定草坪草內(nèi)源細(xì)胞分裂素的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及植物內(nèi)源細(xì)胞分裂素的測定領(lǐng)域，具體涉及一種高效分離和測定草坪草內(nèi)源細(xì)胞分裂素的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]草坪業(yè)基于其獨特的生態(tài)、社會、景觀、美學(xué)和經(jīng)濟等功能，越來越受到重視并顯示出巨大的發(fā)展勢頭和潛力。草坪作為城市生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，不僅具有很強的觀賞性和娛樂性，同時也在防治污染和改善生態(tài)環(huán)境中發(fā)揮了巨大的作用，鑒于此，社會對草坪草的需求不斷增大，草坪業(yè)的發(fā)展也迎來了良好的機遇。在霧霾頻發(fā)的今天，如何改善我們的居住生活環(huán)境任重而道遠(yuǎn)，草坪草在環(huán)境改善方面的作用也顯得舉足輕重。
[0003]植物內(nèi)源細(xì)胞分裂素作為一種以促進細(xì)胞分裂為主的植物激素，普遍存在于高等植物中，可顯著調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育，對細(xì)胞分裂和分化具有重要作用。雖然內(nèi)源細(xì)胞分裂素在植物體內(nèi)的含量低，但對植物的新陳代謝、生長發(fā)育等生理過程起到重要的調(diào)節(jié)作用，包括促進細(xì)胞分裂、促進芽的分化、促進細(xì)胞擴大、促進側(cè)芽發(fā)育、消除頂端優(yōu)勢、延緩葉片衰老、打破種子休眠和種子發(fā)芽等。近年來，關(guān)于內(nèi)源細(xì)胞分裂素在提高植物抗逆性中的作用也受到了重視。如何精確、實時和可靠地對不同物種中微量的內(nèi)源細(xì)胞分裂素進行定性定量分析，是目前植物激素研究中的熱點之一。
[0004]細(xì)胞分裂素在大多數(shù)組織中的含量都很低，通常在10-6?10_9g之間，因此，對分析靈敏度的要求較高。七十年代初Pool首先利用高效液相色譜(HPLC)分離鑒定細(xì)胞分裂素，高效液相色譜技術(shù)滿足了植物細(xì)胞分裂素測定的靈敏度要求，且具有高選擇性、分析快速、兼具分析和制備的優(yōu)點在植物內(nèi)源細(xì)胞分裂素的分離和測定中得到廣泛的應(yīng)用。但在樣品的提取、純化等前處理過程仍有很多問題難以解決，樣品的前處理是一個耗時耗力的過程，特別是雜質(zhì)的干擾，一直是HPLC法測定細(xì)胞分裂素的瓶頸。因此改進細(xì)胞分裂素測定過程中的前處理及純化方法，對準(zhǔn)確測定細(xì)胞分裂素尤為關(guān)鍵。
[0005]近年來，質(zhì)譜技術(shù)的快速發(fā)展，推動了植物內(nèi)源細(xì)胞分裂素的精確分析測定。質(zhì)譜法具有高選擇性、高靈敏度、能提供相對分子量和結(jié)構(gòu)信息的優(yōu)點，國外已有學(xué)者將液相色譜與質(zhì)譜相結(jié)合應(yīng)用于植物激素的檢測，雖然此項技術(shù)剛剛起步，但可預(yù)見其在植物激素的檢測中將發(fā)揮重要的作用。
[0006]液相色譜-質(zhì)譜(HPLC-MS)技術(shù)具有如下優(yōu)點:
[0007]①檢測限低、靈敏度高、選擇性好，不需要衍生，化學(xué)試劑用量少；
[0008]②實現(xiàn)了在植物樣品的粗提取液中直接進行生理水平植物激素的檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的目的主要是針對植物內(nèi)源細(xì)胞分裂素檢測的操作復(fù)雜、耗時長、純化難度大、檢測種類少和回收率低等問題，提供一種高效分離和測定草坪草內(nèi)源細(xì)胞分裂素的方法。本發(fā)明的特色是前處理簡單，不需要衍生，節(jié)約成本，尤其適用于草坪草內(nèi)源細(xì)胞分裂素的測定，可快速、準(zhǔn)確測定草坪草的多種內(nèi)源細(xì)胞分裂素。
[0010]本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的:
[0011]一種高效分離和測定草坪草內(nèi)源細(xì)胞分裂素的方法，主要包括以下步驟:
[0012]①內(nèi)源細(xì)胞分裂素的提取:
[0013]通過加提取液浸提，然后離心，過濾，脫色，最后進行真空濃縮，完成內(nèi)源細(xì)胞分裂素的提取；
[0014]②固相萃取洗脫:
[0015]溶解內(nèi)源細(xì)胞分裂素并獲得溶解液，過96孔的固相萃取小柱(Oasis MCX column)逐步洗脫，獲得內(nèi)源細(xì)胞分裂素洗脫液，將洗脫液真空濃縮，得固相萃取洗脫物；
[0016]③高效液相色譜-質(zhì)譜分析:
[0017]將固相萃取洗脫物用流動相溶解，將流動相溶解液過濾后上高效液相色譜-質(zhì)譜(HPLC-MS)進樣分析。
[0018]本發(fā)明具有下列優(yōu)點和積極效果:
[0019]①前處理簡單，化學(xué)試劑用量少，有效節(jié)約成本，雜質(zhì)干擾小；
[0020]②檢測靈敏度高、選擇性好，不需要衍生；
[0021]③實現(xiàn)了在植物樣品的粗提取液中直接進行多種內(nèi)源細(xì)胞分裂素的檢測；
`[0022]④其分離提取方法、色譜分離條件和質(zhì)譜檢測方法適用于草坪草內(nèi)源細(xì)胞分裂素，回收率高，達(dá)93~96%。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1是細(xì)胞分裂素(iP、Z、DHZ、iPA、ZR、DHZR)混合標(biāo)樣質(zhì)譜圖；
[0024]圖2是狗牙根葉片細(xì)胞分裂素(丨？、2、0!12、丨?4、21?、0!1210質(zhì)譜圖。
【具體實施方式】
[0025]下面結(jié)合實施例詳細(xì)說明:
[0026]1、試驗材料:經(jīng)鹽脅迫(處理濃度為200mmol/L NaCl)處理35d (天)的狗牙根材料(選用中國科學(xué)院武漢植物園種質(zhì)資源圃編號為C43的狗牙根)。
[0027]2、檢測步驟
[0028]I)內(nèi)源細(xì)胞裂素的提取
[0029]A、浸提:取0.5g鮮樣，用液氮研磨，然后加提取液5ml，_20°C提取過夜，得浸提液；
[0030]所述的提取液即甲醇:甲酸:水=15:1:4，按v/v，再加40mg/ml2，6_ 二叔丁基-4-甲基苯酚作為抗氧化劑；
[0031]B、離心:將浸提液在15000轉(zhuǎn)/min，4°C下離心10min，收集上清液置于新管并保存于-20°C，殘渣再用5ml提取液于_20°C提取lh，離心，收集上清液并混合于前一次的上清液，得離心液；
[0032]C、過濾:將收集的離心液過20 μ m濾膜以去除殘渣和較小的顆粒物，收集濾液，得過濾液；
[0033]D、脫色:先用lml100%甲醇和lmllmol/L甲酸平衡C18固相萃取柱(S^)-Pak PlusC18cartridge),然后將過濾液通過置于真空抽濾裝置上的96孔C18固相萃取小柱(載量為100mg/ml),并連接上真空泵，以lml/min的速度抽濾，以去除色素和脂類物質(zhì)；過小柱后，收集濾液，再用Iml的樣品提取液洗脫小柱中的樣品并收集濾液，得脫色濾液；
[0034]E、真空濃縮:
[0035]將收集的脫色濾液置于真空濃縮儀中，于40°C濃縮至完全干燥，即完成內(nèi)源細(xì)胞分素的提取。
[0036]2)固相萃取洗脫:
[0037]A、用2mllmol/L甲酸溶解沉淀，以獲得甲酸溶解液；
[0038]B、分別用lmllOO%甲醇和lmllmol/L甲酸平衡96孔的混合型陽離子交換反相固相萃取小柱(Oasis MCX column,載量為60mg/ml),然后將甲酸溶解液過小柱以吸附激素，棄濾液；
[0039]C、用2ml60%甲醇配制的0.35mol/L的氨水洗柱，收集濾液，該收集液中含有細(xì)胞分裂素 Z、ZR、DHZ、DHZR、iP 和 iPA ；
[0040]D、將洗脫液置于真空濃縮儀中40°C濃縮至完全干燥；
[0041]E、過程B和C需將96孔的混合型陽離子交換反相固相萃取柱置于真空抽濾裝置上并連接真空泵，以lml/min的速率進行抽濾，以提高洗脫效率。
[0042]3 )高效液相色譜-質(zhì)譜(HPLC-MS )連用分析:
[0043]A、將真空濃縮獲得的沉淀用200~500 μ I流動相溶解，得流動相溶解液；
[0044]B、用一次性醫(yī)用注射器吸取流動相溶解液過0.22 μ m濾膜后裝至進樣瓶中，上液相色譜-質(zhì)譜(HPLC-MS)進樣分析；
[0045]C、如樣品量過少，樣品裝入帶內(nèi)撐管的進樣瓶中進行上機分析；
[0046]D、液相色譜條件為:色譜柱為安捷倫Zorbax SB-C18液相色譜柱(3.5 μ m, 150X2.1mm)，柱溫為30°C，流速為200 μ 1/min，紫外檢測波長為265nm，進樣量為10 μ I ;流動相具體見下表:
[0047]表1細(xì)胞分裂素Ζ，ZR，DHZ, DHZR，iP，iPA的流動相
[0048]
【權(quán)利要求】
1.一種高效分離和測定草坪草內(nèi)源細(xì)胞分裂素的方法，其特征包括以下步驟: ①內(nèi)源細(xì)胞分裂素的提取:通過加提取液浸提，然后離心，過濾，脫色，最后進行真空濃縮，完成內(nèi)源細(xì)胞分裂素的提??； ②固相萃取洗脫:溶解內(nèi)源細(xì)胞分裂素并獲得溶解液，過96孔的固相萃取小柱逐步洗脫，獲得內(nèi)源細(xì)胞分裂素洗脫液，將洗脫液真空濃縮，得固相萃取洗脫物； ③高效液相色譜-質(zhì)譜分析:將固相萃取洗脫物用流動相溶解，將流動相溶解液過濾后上高效液相色譜-質(zhì)譜進樣分析。
2.按權(quán)利要求1所述的一種高效分離和測定草坪草內(nèi)源細(xì)胞分裂素的方法，其特征在于步驟①內(nèi)源細(xì)胞分裂素的提取: A、浸提:取0.5g鮮樣，用液氮研磨，然后加提取液5ml，-20°C提取過夜，得浸提液； 所述的提取液即甲醇:甲酸:水=15:1:4,按v/v,再加40mg/ml2, 6-二叔丁基-4-甲基苯酹作為抗氧化劑； B、離心:將浸提液在15000轉(zhuǎn)/min，4°C下離心10min，收集上清液置于新管并保存于-20°C，殘渣再用5ml提取液于_20°C提取lh，離心，收集上清液并混合于前一次的上清液，得離心液； C、過濾:將收集的離心液過20μ m濾膜以去除殘渣和較小的顆粒物，收集濾液,得過濾液； D、脫色:先用lml100%甲醇和lmllmol/L甲酸平衡C18固相萃取柱,然后將過濾液過置于真空抽濾裝置上的96孔C18固相萃取小柱，并連接上真空泵，以lml/min的速度抽濾，以去除色素和脂類物質(zhì)；過小柱后，收集 濾液，再用Iml的樣品提取液洗脫小柱中的樣品并收集濾液，得脫色濾液； E、真空濃縮: 將收集的脫色濾液置于真空濃縮儀中，于40°C濃縮至完全干燥，即完成內(nèi)源細(xì)胞分裂素的提取。
3.按權(quán)利要求1所述的一種高效分離和測定草坪草內(nèi)源細(xì)胞分裂素的方法，其特征在于步驟②固相萃取洗脫: A、用2mllmol/L甲酸溶解沉淀，以獲得甲酸溶解液； B、用lml100%甲醇和lmllmol/L甲酸平衡96孔的混合型陽離子交換反相固相萃取小柱，然后將甲酸溶解液過小柱以吸附激素，棄濾液； C、用Iml的lmol/L甲酸洗柱后，用2ml甲醇洗柱，棄濾液； D、用2ml0.35mol/L的氨水沖洗小柱，棄濾液； E、用2ml60%甲醇配制的0.35mol/L的氨水洗柱，收集濾液，該收集液中含有細(xì)胞分裂素(Z，ZR, DHZ, DHZR, iP, iPA)； F、將洗脫液置于真空濃縮儀中40°C濃縮至完全干燥； G、過程B至E需將96孔的混合型陽離子交換反相固相萃取柱置于真空抽濾裝置上并連接真空泵，以lml/min的速率進行抽濾，以提高洗脫效率。
4.按權(quán)利要求1所述的一種高效分離和測定草坪草內(nèi)源細(xì)胞分裂素的方法，其特征在于步驟③高效液相色譜-質(zhì)譜連用分析: A、將真空濃縮獲得的沉淀用200~500 μ I流動相溶解，得流動相溶解液；B、用一次性醫(yī)用注射器吸取流動相溶解液過0.22 μ m濾膜后裝至進樣瓶中，上效液相色譜-質(zhì)譜進樣分析； C、如樣品量過少，樣品裝入帶內(nèi)撐管的進樣瓶中進行上機分析； D、色譜柱為安捷倫ZorbaxSB-C18液相色譜柱，柱溫為30°C，流速為200 μ 1/min,紫外檢測波長為265nm，進樣量為10yL ;
【文檔編號】G01N30/06GK103884810SQ201410074317
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年3月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月3日
【發(fā)明者】傅金民, 胡龍興, 婁燕宏 申請人:中國科學(xué)院武漢植物園