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一種草果與草豆蔻的指紋圖譜鑒別方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種可用于快速鑒別草果與草豆蔻的指紋圖譜鑒別方法。該法以乙酸乙酯、石油醚或二氯甲烷為萃取溶劑，采用超聲輔助萃取或冷浸法提取制備供試液，應(yīng)用GC-MS方法在一定條件下測得指紋圖譜并用于草果與草豆蔻的鑒別?？茖W試驗證明，該法操作簡便、快速；測得的指紋圖譜重復性高，特征性強，可用于草果和草豆蔻的快速鑒別與質(zhì)量控制。
【專利說明】一種草果與草豆蔻的指紋圖譜鑒別方法

【技術(shù)領(lǐng)域】 _
[0001] 本發(fā)明涉及中藥鑒別領(lǐng)域，具體涉及一種草果與草豆蔻藥材的指紋圖譜鑒別方 法。

【背景技術(shù)】
[0002] 草果別名草果子，草果仁，始載于《本草綱目》，2〇1〇年版《中國藥典》記載草果為 姜科植物草果Amomum tsao-ko Crevost et Lemaire的干燥成熟果實，具燥濕溫中，除痰截 皰的功效；而草豆蔻為姜科植物Alpinia Katsumadai Hayata的干燥近成熟的種子，具燥濕 行氣，溫中止嘔的功效；草果與草豆蘧功效不同，臨床應(yīng)用也有差異，但由于兩者同為姜科 藥材，其外形、氣味非常相似，常常容易混淆使用。為區(qū)別鑒定草果與草豆蔻，余南才等人從 性狀，來源，顯微，薄層色譜等方面對草果與草豆蘧進行了鑒別比較。
[0003] 目前草果與草豆蔻藥材的鑒別主要是根據(jù)外觀氣味及顯微形態(tài)特征等傳統(tǒng)方法 來進行，這些方法有的比較繁瑣，有的不夠客觀，有時仍不容易準確鑒別；因此，建立一種與 國際接軌的、客觀先進、快速準確的草果與草豆蔻藥材的指紋圖譜鑒別方法，具有重要的意 義。
[0004] 近年來，色譜指紋圖譜已成為國際公認的用于鑒別與控制中藥材質(zhì)量的最有效的 手段，它是現(xiàn)代分析科學的優(yōu)秀成果與中醫(yī)藥整體綜合觀的有機融合，是一種到目前為止 在國際上較為認可的利用現(xiàn)代科學技術(shù)手段所能達到的用于表現(xiàn)中藥復雜體系特性的最 好方法。GC-MS指紋圖譜是近年來發(fā)展起來的用于中藥揮發(fā)油成分分析與鑒別的一種方法， 與普通色譜指紋圖譜相比，它不僅可給出類似普通色譜指紋圖譜的峰型特征，還可同時對 各色譜峰的多個組份同時進行快速定性，給出各個特征指紋峰的成分以及結(jié)構(gòu)。因此，在中 藥定性與鑒別方面，GC-MS指紋圖譜比普通色譜指紋圖譜的選擇性更強，具有更多的優(yōu)勢。 最近曾有應(yīng)用水蒸汽蒸餾或超臨界流體提取草果或草豆蔻揮發(fā)油，然后用GC-MS方法測定 其揮發(fā)油指紋圖譜的報道，但由于這些方法通常所需的藥材量較多，提取過程比較麻煩，提 取時間一般都比較長；而且水蒸汽蒸餾法因為溫度高、提取時間長，可能還會造成部分有效 成分的破壞及損失，均不適用于作為藥材的快速鑒別方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] f發(fā)明的目的是提供一種可用于準確快速鑒別草果與草豆蔻的指紋圖譜鑒別方 法。該法采用乙酸乙酯、二氯甲烷或石油醚為萃取溶劑，采用超聲輔助萃取或冷浸提取制備 供試品溶液，用GC-MS方法在一定條件下測得指紋圖譜并用于草果與草豆蔻的鑒別。科學 試驗證明，該法簡便、快速；所需藥材量少，測得的指紋圖譜特征及差異明顯，重復性高，可 用于草果和草豆蔻的準確快速鑒別與質(zhì)量控制。
[0006]本發(fā)明的草果與草豆蔻藥材的指紋圖譜鑒別方法具體包括以下步驟：
[0007] ⑴供試品溶液的制備：取草果和草豆蔻藥材粉末4-6克，精密稱定，分置于兩個 錐形瓶中，分別加入乙酸乙酯、二氯甲烷或石油醚20-30ml，冷浸24小時或超聲輔助提取 30-40分鐘，放冷，加相應(yīng)溶劑補足失去的重量，過濾，取續(xù)濾液置離心管中，用無水硫酸鈉 千燥去除水分，以l3〇〇〇r/min離心10分鐘，取上清液，即得草果和草豆蔻藥材的供試品溶 液；
[0008] (2)色譜分析條件：彈性石英毛細管色譜柱，以高純He為載氣，流量1. 〇ml/min ; 進樣口溫度230°C -25〇°C ;不分流進樣；采用程序升溫進行分析；
[0009] (3)質(zhì)譜分析條件：電離方式為EI，電子能量70eV，檢測器溫度250? -280°c，離 子源溫度230Γ，四級桿溫度150°C，倍增電壓1782v，發(fā)射電流34. 6μΑ，掃描質(zhì)量范圍： 50-500amu ;溶劑延遲 3. Omin ;
[0010] ⑷測定方法：分別取草果和草豆蔻的供試液各1 μ 1，注入GC-MS聯(lián)用儀，測定草 果和草豆蔻的總離子流圖，即得兩藥材的鑒別用指紋圖譜。
[0011] 經(jīng)過研究，本發(fā)明優(yōu)化的草果與草豆蓮藥材的指紋圖譜鑒別方法按以下步驟實 施：
[0012] (1)供試品溶液的制備：取草果和草豆蔻藥材粉末5克，精密稱定，分置于兩個錐 形瓶中，分別加入乙酸乙酯20ml，超聲輔助提取30分鐘，放冷，加乙酸乙酯補足失去的重 量，過濾，取續(xù)濾液置離心管中，用無水硫酸鈉干燥去除水分，以13〇〇〇r/min離心10分鐘， 取上清液，即得草果和草豆蔻藥材的供試品溶液；
[0013] (2)色譜分析條件：HP-5MS UI彈性石英毛細管色譜柱，其規(guī)格為 3〇111\0.2511111^0.254111;載氣為高純拖，純度彡 99.99%，流量1.〇1111/1^11;進樣口溫度 250°C ;不分流進樣；程序升溫程序為：初始溫度80°C，保持3min，以6°C /min升至180°C， 保持3min ;
[0014] ⑶質(zhì)譜分析條件：電離方式為EI，電子能量70eV，檢測器溫度280°C，離子源溫度 2 3〇°C，四級桿溫度l5〇°C，倍增電壓1782v，發(fā)射電流34. 6μ A，掃描質(zhì)量范圍：50-500amu ; 溶劑延遲3. Omin ;
[0015] (4)測定方法：分別取草果和草豆蔻的供試液各1 μ 1，注入GC-MS聯(lián)用儀，測定草 果和草豆蘧的總離子流圖，即得兩藥材的鑒別用指紋圖譜；
[0016] (5)標準指紋圖譜的建立：測定10批不同產(chǎn)地草果與草豆蔻的GC-MS指紋圖譜， 應(yīng)用計算機對指紋圖譜的數(shù)據(jù)進行分析對比，計算得出草果與草豆蔻的GC-MS指紋圖譜的 共有模式，作為草果與草豆蔻藥材的鑒別用標準指紋圖譜；草果指紋圖譜共有模式中具有 16個共有特征指紋峰，各特征峰對應(yīng)的化學成分分別是1號峰： α -蒎烯；2號峰：β -菠 烯；3號峰：α -水芹烯；4號峰：桉油精；5號峰：α -松油醇；6號峰：順式-檸檬醛；7號 峰：香葉醇；9 號峰：反式-抒檬醛；10 號峰：trans-2,3,3α，7a-tetr-ahydro-lH-indene -4-carbaldehyde ;11 號峰：cis-2,3,3a，7a -tetr-ahydro-lH-indene-4-carbaldehyde ; l2號峰：2,3-二氫-1H-茚-4-甲醛；13號峰：乙酸香葉酯；14號峰：順式-環(huán)癸烯；15號 峰：反式-2-十二烯醛；16號峰：橙花叔醇。其中以桉油精的相對含量為最高。草豆蔻指紋 圖譜共有模式有13個共有特征峰，各特征峰對應(yīng)的化學成分分別是1號峰： α -蔽烯；2號 峰：莰烯；3號峰：α -水芹烯；4號峰：對-聚傘花烴；5號峰：桉油精；6號峰：樟腦；7號峰： L-(-)-龍腦；8號峰：(-)-4-萜品醇；9號峰：4-苯基-2-丁酮；10號峰：反式-桂皮醛；11 5峰：α -石竹痛；I2號峰：δ -杜松烯；I3號峰：金合歡醇。其中以金合歡醇的相對含量為 最高。
[0017] (6)應(yīng)用：將待測藥材樣品的GC-MS指紋圖譜分別與草果與草豆蔻藥材的標準指 紋圖譜進行對比，根據(jù)特征指紋峰位及主要特征峰面積的大小，即可確定藥材的品種與質(zhì) 量。
[0018] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其主要優(yōu)點及積極效果在于：
[0019] ⑴本發(fā)明草果和草豆蔻藥材GC-MS指紋圖譜的鑒別方法，系采用超聲輔助提取 的方法制備供試品溶液，與現(xiàn)有水蒸汽蒸餾法或超臨界流體法提取草果和草豆蘧揮發(fā)油測 定指紋圖譜的技術(shù)相比，所需藥材量要少得多，提取分析過程更加簡單快捷，從供試品制備 到完成指紋圖譜分析所需時間不到1個小時，并可避免水蒸汽蒸餾提取揮發(fā)油過程中由于 提取溫度高、提取時間長所造成的部分化學成分的破壞與損失，方法重復性及穩(wěn)定性更好。
[0020] ⑵與傳統(tǒng)鑒別方法相比，本法操作簡便，過程簡單且易于控制，方法重復性及與 準確性好，特征性強，只需通過視覺直觀辨識待測圖譜與標準圖譜的異同便可進行藥材的 快速鑒別，結(jié)果更加客觀準確。
[0021] (3)本發(fā)明的草果和草豆蔻藥材的指紋圖譜鑒別方法，不僅可給出色譜指紋圖譜 的特征峰型，還可同時給出各特征指紋峰的成分以及結(jié)構(gòu)，方法特征性更好，具有更多的優(yōu) 勢。
[0022] ⑷本發(fā)明的指紋圖譜鑒別方法，通過觀察待測藥材特征指紋峰的有無及主要成 分特征峰面積的大小，可用于判斷藥材質(zhì)量的優(yōu)劣，保證藥材質(zhì)量的穩(wěn)定、均一和可控。 [0023]本發(fā)明的檢測方法，是通過大量實驗摸索得到的切實可行的方法，具有可重復性 和較好的穩(wěn)定性，根據(jù)本發(fā)明所公開的技術(shù)內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員將很清楚本發(fā)明的其它 實施方案，但只要使用本發(fā)明所述的檢測方法，均在本發(fā)明保護范圍之內(nèi)。

【專利附圖】

【附圖說明】：
[0024] 附圖1草果GC-MS指紋圖譜共有模式
[0025] 附圖2草豆蔻GC-MS指紋圖譜共有模式
[0026] 附圖3石油醚超聲輔助萃取測得的草果GC-MS指紋圖譜
[0027]附圖4二氯甲烷超聲輔助萃取測得的草果GC-MS指紋圖譜
[0028] 附圖5乙酸乙酯超聲輔助萃取測得的草果GC-MS指紋圖譜
[0029] 附圖6乙酸乙酯冷浸提取法測得的草果GC-MS指紋圖譜 [0030]附圖7乙酸乙酯回流提取法測得的草果 GC-MS指紋圖譜

【具體實施方式】
[0031]下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步說明，本發(fā)明的實施例僅作為示例，旨在說 明本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。
[0032]實施例1草果與草豆蔻藥材的指紋圖譜共有模式的測定 [0033] 1實驗材料
[0034] 1.1實驗藥材：實驗用草果、草豆蔻藥材購于全國各省市的大藥房。草果藥材經(jīng) 廣西中醫(yī)藥大學中藥鑒定教研室蔡毅教授鑒定為姜科豆蔻屬植物草果（Amomum tsao-ko Crevost et Lemaire)的干燥成熟果實；草豆蔻為姜科山姜屬植物草豆蔻（Alpinia Katsumadai Hayata)的干燥成熟果實。
[0035] 1· 2實驗藥材的前處理：取各產(chǎn)地草果、草豆蘧果仁，用粉碎機粉碎，過40目篩網(wǎng)， 備用。
[0036] 1.3實驗試劑：乙酸乙酯（分析純，國藥集團化學試劑有限公司），無水硫酸鈉（分 析純，天津市大茂化學試劑廠）。
[0037] 2.實驗儀器：美國安捷倫公司6890Ν-5973Ν氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀；HP-5MS UI彈性 石英毛細管色譜柱（30mX0_25mmX0_25ym) :LG16_WA臺式高速離心機（北京醫(yī)用尚心機 廠）；離心管；KQ5200B型超聲波清洗器（250W,頻率50KHz)，40目篩網(wǎng)，G1701DA MSD化學 工作站。
[0038] 3. GC-MS 分析條件
[0039] 3. 1色譜條件：載氣He (彡99· 99% )流量（1. Oml/min);進樣口溫度25〇°C ;不分 流進樣；氣化溫度250? ;進樣量1 μ 1 ;溶劑延遲3. Omin ;程序升溫：初始溫度8〇°C,保持 3min，以 6°C /min 升至 180°C保持 3min。
[0040] 3.2質(zhì)譜條件：電離方式EI，電子能量70eV，檢測器溫度：280°C，離子源溫度 230°C，四級桿溫度150°C，倍增電壓1782v，發(fā)射電流34.6μΑ，掃描質(zhì)量范圍：50-500amu。
[0041] 4.供試品溶液的制備：取草果，草豆蘧藥材粉末5g，精密稱定，置錐形瓶中，加入 20ml乙酸乙酯，超聲提取 3〇min，提取液補足失重后用濾紙過濾，取續(xù)濾液置離心管中，用 無水硫酸鈉干燥去除水分，以13〇〇〇r/min離心10分鐘，取上清液備測。
[0042] 5.測定方法：分別取草果和草豆蔻的供試液各1 μ 1，注入GC-MS聯(lián)用儀，測定草果 和草豆蘧的總離子流圖，即得。
[0043] 6.草果與草豆蔻GC-MS特征指紋峰的確定
[0044] 通過對10批不同產(chǎn)地草果藥材測得的指紋圖譜進行分析比對，確定了草果藥材 具有16個特征指紋峰，分別為1號峰：α -菔烯；2號峰：β -蔽痛；3號峰：α -水芳^希；4號 峰：桉油精；5號峰：α -松油醇；6號峰：順式-檸檬醛；7號峰：香葉醇；8號峰：未知；9號 峰：反式-梓檬醛；1〇 號峰：trans_2,3,3a，7α -tetr-ahydro-lH-indene-4-carbaldehyd e ;11 號峰：cis-2,3,3α，7α -tetr-ahydro-lH-indene-4-carbaldehyde ;12 號峰：2,3-二 氫-1H-茚-4-甲醛；13號峰：乙酸香葉酯；14號峰：順式-環(huán)癸烯；15號峰：反式-2-十二 烯醛；16號峰：橙花叔醇。通過對測得的各產(chǎn)地草豆蔻藥材指紋圖譜的分析對比，確定了 草豆蓮藥材具有13個特征指紋峰，各特征峰對應(yīng)的化學成分分別是1號峰：α -蒎烯；2號 峰：茨??；3號峰：α -水斧燥；4號峰：對-聚傘花烴；5號峰：桉油精；6號峰：樟腦；7號峰： L-龍腦；8號峰：(-)-4-萜品醇；9號峰：4_苯基-2-丁酮；10號峰：反式-桂皮醛；11 號峰：α -石竹烯；12號峰：δ -杜松烯；13號峰：金合歡醇。
[0045] 7.指紋圖譜方法學考察及結(jié)果
[0046] 草果指紋圖譜中13號峰為乙酸香葉酯，是草果的主要成分之一，且此峰在指紋圖 譜中位置居中，峰面積穩(wěn)定，分離度良好，故選取乙酸香葉酯作為草果指紋圖譜的參照峰 (S)，用來計算各特征峰與參比峰的保留時間比值（相對保留時間）和各特征峰與參比峰的 峰面積比值（相對峰面積）。在儀器精密度考察中各特征峰與參照峰的相對保留時間RSD 值在0· 01%?0· 04%之間，相對峰面積的RSD值在0. 95%?2. 8%之間；在方法重復性考 察中各特征峰與參比峰的相對保留時間RSD值在0· 01%?0. 07%之間，相對峰面積的RSD 值在1. 2%?2. 9%之間；在穩(wěn)定性考察中各特征峰與參比峰在24小時內(nèi)其相對保留時間 RSD值在0· 02%?0· 11 %之間，相對峰面積的RSD值在1. 1 %?2. 8%之間，符合指紋圖譜 測定的相關(guān)技術(shù)要求。
[0047] 8.草果及草豆蘧藥材GC-MS指紋圖譜共有模式的測定
[0048] 分別取10批不同產(chǎn)地的草果與草豆蘧按"供試品溶液的制備"方法制備供試品溶 液，按"GC-MS分析條件"注入儀器檢測分析，用峰面積歸一化法計算各特征指紋峰成分的相 對百分含量。
[0049] 應(yīng)用計算機對測得的10批草果與草豆蔻的GC-MS指紋圖譜的數(shù)據(jù)進行分析對比， 計算得出草果與草豆蔻的GC-MS指紋圖譜的共有模式，分別見附圖1與附圖2。
[0050]將草果與草豆蔻的GC-MS指紋圖譜中各特征指紋峰相應(yīng)的質(zhì)譜圖通過用伩器配 置的化學工作站NIST〇8標準譜庫進行檢索，并結(jié)合相關(guān)質(zhì)譜文獻進行分析比對，鑒定得出 草果與草豆蔻GC-MS指紋圖譜共有模式中各特征指紋峰所對應(yīng)的化學成分名稱，分別見表 1和表2。
[0051] 表1草果GC-MS指紋圖譜中16個特征指紋峰特征成分表
[0052]

【權(quán)利要求】
1. 一種草果與草豆蘧的指紋圖譜鑒別方法，其特征在于該法是一種采用溶劑超聲輔助 萃取或冷浸提取制備供試液，采用GC-MS方法在一定條件下測得指紋圖譜并用于鑒別的方 法，具體包括以下測定條件及步驟： (1)供試品溶液的制備：取草果和草豆蘧藥材粉末4-6克，精密稱定，分置于兩個錐形 瓶中，分別加入萃取溶劑20-30ml，冷浸24小時或超聲輔助萃取30-40分鐘，放冷，加萃取 溶劑補足失去的重量，過濾，取續(xù)濾液置離心管中，用無水硫酸鈉干燥去除水分，以13000r/ min離心10分鐘，取上清液，即得草果和草豆蘧藥材的供試品溶液； ⑵色譜分析條件：HP-5MS Π 彈性石英毛細管色譜柱，其規(guī)格為 30mX0. 25mmX0. 25μπι;載氣為高純He，純度彡99. 99 %，流量1. Oml/min ;進樣口溫度 250°C ;不分流進樣；程序升溫程序為：初始溫度80°C，保持3min，以6°C /min升至180°C， 保持3min ; (3)質(zhì)譜分析條件：電離方式為EI，電子能量70eV，檢測器溫度280°C，離子源溫度 230°C，四級桿溫度150°C，倍增電壓1782v，發(fā)射電流34. 6μΑ，掃描質(zhì)量范圍：50-500amu; 溶劑延遲3. Omin ; ⑷測定法：分別取草果和草豆蘧的供試液各1 μ 1，注入GC-MS聯(lián)用儀，測定草果和草 豆蘧的總離子流圖，即得兩藥材的GC-MS指紋圖譜； (5) 標準指紋圖譜的建立：測定10批不同產(chǎn)地草果與草豆蘧的GC-MS指紋圖譜，應(yīng)用 計算機對指紋圖譜的數(shù)據(jù)進行分析對比，計算得出草果與草豆蘧的GC-MS指紋圖譜的共有 模式，作為草果與草豆蘧藥材的鑒別用標準指紋圖譜； (6) 應(yīng)用：將待測樣品的GC-MS指紋圖譜分別與草果與草豆蘧藥材的標準指紋圖譜進 行對比，根據(jù)特征指紋峰位及主要特征峰面積的大小，即可確定藥材的品種與質(zhì)量。
2. 如權(quán)利要求1所述的指紋圖譜鑒別方法，其特征在于所述的萃取溶劑是乙酸乙酯、 二氯甲烷或石油醚。
3. 如權(quán)利要求1所述的指紋圖譜鑒別方法，其特征在于所述的最佳萃取溶劑為乙酸乙 酯，所需最佳萃取溶劑量為藥材的4-5倍，超聲萃取時間為30分鐘。
4. 如權(quán)利要求1所述的指紋圖譜鑒別方法，其特征在于：草果指紋圖譜共有模式中具 有16個共有特征峰，各特征峰對應(yīng)的化學成分分別是：1號峰：α -菔烯，2號峰：β -菔烯， 3號峰：α -水療烯，4號峰：桉油精，5號峰：α -松油醇，6號峰：順式-朽1檬醒，7號峰：香 葉醇，9 號峰：反式-朽1 樣醒，10 號峰：trans-2, 3, 3 α，7 α -tetr-ahydro-lH-indene-4-ca rbaldehyde，11 號峰：cis_2,3,3 α，7 a-tetr-ahydr〇-lH-indene-4-ca;rbaldehyde，12 號 峰：2, 3-二氫-1H-茚-4-甲醒，13號峰：乙酸香葉酯，14號峰：順式-環(huán)癸烯，15號峰：反 式-2-十二烯醛，16號峰：橙花叔醇，其中以桉油精的相對含量為最高；草豆蘧指紋圖譜共 有模式中具有13個共有特征峰，各特征峰對應(yīng)的化學成分分別是1號峰：α -菔烯，2號 峰：莰烯，3號峰：α -水芹烯，4號峰：對-聚傘花烴，5號峰：桉油精，6號峰：樟腦，7號峰： L-(-)_龍腦，8號峰：(-)-4-萜品醇，9號峰：4_苯基-2-丁酮，10號峰：反式-桂皮醛，11 號峰：α -石竹烯，12號峰：δ -杜松烯，13號峰：金合歡醇；其中以金合歡醇的相對含量為 最1?。
5. 權(quán)利要求1所述的指紋圖譜鑒別方法在草果和草豆蘧藥材的鑒別與質(zhì)量控制方面 的應(yīng)用。
【文檔編號】G01N30/06GK104297373SQ201410528048
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年10月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月10日
【發(fā)明者】覃潔萍, 何俏明, 李耀華, 梁臣艷 申請人:廣西中醫(yī)藥大學