專利名稱:25羥維生素d檢測試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及臨床體外診斷及醫(yī)學(xué)免疫學(xué)領(lǐng)域;具體地涉及一種免疫檢測試劑;更進(jìn)一步地,本發(fā)明涉及一種25羥維生素D檢測試劑盒及其制備方法。
背景技術(shù):
維生素D也稱抗佝僂病維生素,又可分為維生素D2和維生素D3。維生素D2多含于植物性食物中,它是由植物的麥角固醇經(jīng)陽光照射而合成的,維生素D3可由人體皮膚和脂肪組織在7-脫氫膽固醇經(jīng)過陽光照射合成。維生素D2屬脂溶性維生素,來自食物中的維生素D與脂肪一起經(jīng)小腸吸收,在膽汁協(xié)助下形成乳糜微粒,由淋巴管進(jìn)入血液,與自身合成的維生素D3 —起轉(zhuǎn)運(yùn)入肝臟。在肝臟中經(jīng)肝細(xì)胞微粒體中的單氧酶系統(tǒng)(25-羥化酶)的作用,形成25羥維生素D。25羥維生素D在腎近端小管上皮細(xì)胞線粒體內(nèi)α羥化酶系統(tǒng)的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)?,25 (OH)2D3,它是維生素D最大的生物作用形式,可以促進(jìn)腸道鈣結(jié)合蛋白的合成。而25羥維生素D是代謝中的主要循環(huán)形式,能夠反映機(jī)體的維生素D水平。維生素D缺乏又稱維生素D缺乏性佝僂病。常見于嬰幼兒,多見于膳食中缺乏維生素D,或者是人體缺乏陽光的照射。由于體內(nèi)維生素D不足而引起鈣、磷代謝障礙,鈣鹽不能正常地沉積于骨骼的生長部分,以致出現(xiàn)生長骨發(fā)生病變?yōu)樘卣鞯囊环N慢性營養(yǎng)性疾病,稱為佝僂病。如果該病發(fā)生于成人,則出現(xiàn)發(fā)育成熟骨骼的鈣化不全,稱為骨軟化癥。研究還表明,維生素D缺乏可能使某些癌癥、心血管疾病、自身免疫性疾病和感染性疾病的發(fā)病風(fēng)險升聞。根據(jù)當(dāng)前糖尿病報告雜志上發(fā)表的結(jié)果,3,262例年齡50-70歲之間的中國人參加的一項(xiàng)研究表明94%的人維生素D缺乏或不足,這些人中有42%還有代謝綜合征。其它一些研究表明,維生素D缺乏和不足在中國的孕婦以及6-16歲的兒童中也很常見。而長期攝入過多的維生素D(5000IU),將引起高血鈣和高尿鈣。特征為食欲減退,過度口渴、惡心、嘔吐、煩躁、體弱、便泌腹瀉交替出現(xiàn),嚴(yán)重者將因腎鈣化、心臟和大動脈鈣化而死亡。隨著醫(yī)療專業(yè)人員和患者意識到維生素D缺乏的潛在健康風(fēng)險,實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)量激增,需要我們提供更快、更準(zhǔn)、更有效的檢測方法,幫助醫(yī)生和患者更早的得到檢測結(jié)果。目前25羥維生素D的測定方法主要有酶聯(lián)免疫法(如CN102628872A中公開的方法和試劑盒,以及DRG提供的25-0H維他命D (總)檢測試劑盒EIA5396)、放射免疫法(如Hollis BW等人,1985)、液相色譜-質(zhì)譜檢測法(如鄭曉艷等人,2012)以及化學(xué)發(fā)光法(如單詠梅等人,2011 ;索靈生產(chǎn)的25-羥基總維生素D定量測定試劑盒(化學(xué)發(fā)光法))。酶聯(lián)免疫法自動化程度不高,且受人為因素影響較大。放射免疫法存在著環(huán)境污染問題;液相色譜質(zhì)譜操作復(fù)雜,用時較長;而化學(xué)發(fā)光法靈敏度雖高,但檢測成本較高,需要特定化學(xué)發(fā)光儀,這些原因?qū)е缕鋺?yīng)用范圍較小。本發(fā)明采用膠乳增強(qiáng)免疫透射比濁法測定人樣本中25羥維生素D濃度,該方法對儀器設(shè)備要求不高,沒有環(huán)保和操作人員自身防護(hù)等問題。而目前市場上還未出現(xiàn)膠乳增強(qiáng)免疫透射比濁法測定人樣本中25羥維生素D濃度的試劑盒,與其它測定方法比較,本方法簡便快速、靈敏可靠,普通自動或半自動生化分析儀就可,有較大應(yīng)用范圍和實(shí)用價值。
發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)本發(fā)明的第一方面,提供了一種25羥維生素D檢測試劑盒,其包含第一試劑,和第二試劑。第一試劑包含25羥維生素D抗體、維生素D結(jié)合蛋白抗體和緩沖液,第二試劑包含結(jié)合有25羥維生素D抗原的微球和緩沖液。在一些實(shí)施方式中,第一試劑和第二試劑中的緩沖液選自磷酸緩沖液、甘氨酸緩沖液、MES緩沖液、硼酸緩沖液、醋酸鹽緩沖液、2-嗎啉乙磺酸緩沖液或氯化銨緩沖液中的一種或幾種;緩沖液濃度為10-500mM。在一些實(shí)施方式中,第一試劑和第二試劑中的緩沖液類型可以相同也可以不同;第一試劑和第二試劑中的緩沖液濃度可以相同也可以不同。在一些優(yōu)選實(shí)施方式中,第一試劑和第二試劑中的緩沖液類型相同;第一試劑和第二試劑中的緩沖液濃度不同。在一個具體實(shí)施方式
中,第一試劑的緩沖液是50mM MES緩沖液;第二試劑的緩沖液是20mM MES緩沖液。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解,隨著緩沖液類型、濃度等因素的改變,緩沖液的PH值可以有所不同。在一些實(shí)施方式中,25羥維生素D抗體為多克隆抗體或單克隆抗體;維生素D結(jié)合蛋白抗體為多克隆抗體或單克隆抗體;其中多克隆抗體源自兔、羊或雞,單克隆抗體源自鼠或兔。在一些實(shí)施方式中,所述25羥維生素D抗原為自然抗原或人工合成抗原。在一些實(shí)施方式中,所述微球是由聚苯乙烯、丙烯酸、丙烯酸相關(guān)酯類中的一種或幾種聚合而成的膠乳顆粒;微球直徑在150-500nm之間。在一個具體實(shí)施方式
中,所述微球是聚苯乙烯膠乳顆粒,微球直徑為223nm。根據(jù)需要,根據(jù)本發(fā)明的25羥維生素D檢測試劑盒還包括校準(zhǔn)品,校準(zhǔn)品主要用于校準(zhǔn)測量系統(tǒng)、評價測量程序或?yàn)榇郎y樣本賦值。因此,所述校準(zhǔn)品包含已知濃度的25羥維生素D,校準(zhǔn)品的值甚至可以追溯至參考物質(zhì)或者追溯至參考方法(IS017511:2003)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)待測物質(zhì)的濃度范圍,采用本領(lǐng)域常用的方法自行制備適當(dāng)濃度的校準(zhǔn)品,也可以使用市售校準(zhǔn)品、或制造商提供的工作校準(zhǔn)品等。在一些具體實(shí)施方式
中,根據(jù)本發(fā)明的25羥維生素D檢測試劑盒還包括若干不同濃度的校準(zhǔn)品,例如2個、3個、4個、5個甚至更多濃度的校準(zhǔn)品。在一個實(shí)施方式中,本發(fā)明的25羥維生素D檢測試劑盒包括5個不同濃度的校準(zhǔn)品。校準(zhǔn)品含有25輕維生素D(分別為,但不限于,20ng/ml、45ng/ml、65ng/ml、100ng/ml和150ng/ml)、緩沖液,適當(dāng)時還含有穩(wěn)定劑、或防腐劑等。校準(zhǔn)品可制備成液體形式、干粉或凍干粉形式。根據(jù)本發(fā)明的另一方面,提供了一種結(jié)合有25羥維生素D抗原的微球的制備方法,包括步驟:活化25羥維生素D抗原;活化微球;將活化的25羥維生素D抗原與活化的微球連接,從而獲得結(jié)合有25羥維生素D抗原的微球。其中活化25羥維生素D抗原的步驟與活化微球的步驟的操作順序是可互換的。在一些實(shí)施方式中,活化25羥維生素D抗原的步驟所用的試劑選自羰基二咪唑、無水丙酮、二氨基二丙基亞胺、乙基二甲基胺丙基碳化二亞胺和2-嗎啉乙磺酸中的一種或多種。在一些實(shí)施方式中,所述微球?yàn)轸然揎椀奈⑶?。采用本發(fā)明的試劑盒,第一試劑包含足夠多的維生素D結(jié)合蛋白抗體,其能夠?qū)⒕S生素D與維生素結(jié)合蛋白分開;還包含足夠多的25羥維生素D抗體,受試者樣本(如全血、血漿、血清)中的25羥維生素D可以和該抗體發(fā)生特異性結(jié)合;第二試劑含有結(jié)合有25羥維生素D抗原的微球,微球上的25羥維生素D抗原和未結(jié)合樣本中25羥維生素D的剩余抗體可以發(fā)生特異性反應(yīng);利用膠乳增強(qiáng)免疫比濁的方法原理,檢測微球與剩余抗體反應(yīng)產(chǎn)生的吸光度,可以推算出樣本中25羥維生素D的含量。
圖1:25羥維生素D試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖2:本發(fā)明方法和對照方法所制備的試劑之間標(biāo)準(zhǔn)曲線的比較。 本發(fā)明方法;■對照方法。圖3:本發(fā)明的試劑盒與酶聯(lián)免疫分析法的血清測值的相關(guān)性。
具體實(shí)施例方式為了使本發(fā)明易于理解,下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。除非另有指明,“%”表示質(zhì)量/體積。以下提供了本發(fā)明實(shí)施方式中所使用的具體材料及其來源。但是,應(yīng)當(dāng)理解的是,這些僅僅是示例性的,并不意圖限制本發(fā)明,與如下試劑和儀器的類型、型號、品質(zhì)、性質(zhì)或功能相同或相 似的材料均可以用于實(shí)施本發(fā)明。以下實(shí)施例以血清為例進(jìn)行了測試,但是本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解,血漿和全血同樣可用作根據(jù)本發(fā)明的方法和試劑盒的受試樣本,因?yàn)槠錂z測對象均為樣本中的25羥維生素D,血清、血漿和全血的采集、保存、預(yù)處理等操作可以按照臨床檢驗(yàn)領(lǐng)域中的常規(guī)方法進(jìn)行。實(shí)施例實(shí)施例1:25羥維生素D檢測試劑盒的制備1.第一試劑制備過程如下:第一試劑組成:
pH7.3
MES50 mM
NaCl0.1 SM
NaN30.1%
BSA0.1%
維生素D結(jié)合蛋白單克隆抗體(鼠源)0.2%
抗25羥維生素D抗體多克隆抗體(兔源)0.2%用含有0.15M NaCU0.l%NaN3、0.1%BSA的50mM MES溶液,在室溫下稀釋維生素D結(jié)合蛋白抗體和25羥維生素D抗體,至抗體終濃度為0.2%。2.第二試劑制備過程如下:a)用無水丙酮在室溫下稀釋4ml人25輕維生素D抗原(10mg/ml),至抗原終濃度為 2mg/ml ;b)稱取20mg羰基二咪唑加入到上述溶液中,混勻,在30°C 150rpm搖床中反應(yīng)0.5-2小時,例如I小時;c)用20mM MES溶液(pH5.0)在室溫下稀釋lml223nm聚苯乙烯膠乳顆粒,至膠乳濃度為4% ;d)稱取IOmg 二氨基二丙基亞胺溶于7.5ml無水丙酮中,加入1.5mg乙基二甲基胺丙基碳化二亞胺攪拌10至60min,例如30min ;e)將c)獲得的聚苯乙烯膠乳顆粒滴加進(jìn)d),混勻,30°C 150rpm搖床中反應(yīng)1_3小時,例如2小時;f )將e)獲得的活化的聚苯乙烯膠乳顆粒滴加進(jìn)b)中,混勻,30°C 150rpm搖床中反應(yīng)1-4小時,例如3小時;g)將f)獲得的液體離心, 并用去離子水清洗2-3遍,去上清,獲得膠乳顆粒沉淀;h)用20mM MES溶液(pH5.0)稀釋g)獲得的膠乳顆粒至1.25%,根據(jù)需要可以加入0.1%防腐劑;i)超聲分散后,獲得第二試劑。3.校準(zhǔn)品的制備過程:校準(zhǔn)品組成:
M ES50mM NaCi0.15M
NaN30.1%
BSA0.5%
無水乙醇10%
蔗糖5%
25 輕維生素 D 純品 20ng/mi; 45ng/ml; 65 ng/ml ; I OOng/mi; 150ng/ml其余為去離子水按參考校準(zhǔn)品所需要濃度,將25羥維生素D純品加入含有0.15MNaCl、0.l%NaN3、
0.5%BSA、10% 無水乙醇、5% 鹿糖的 50mM MES 溶液中,制得 20ng/ml、45ng/ml、65ng/ml、100ng/ml、150ng/ml濃度的25輕維生素D參考校準(zhǔn)品。盡管上述方法中提供了具體的實(shí)驗(yàn)條件,但是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解,其可以在本發(fā)明的精神范圍內(nèi),針對實(shí)驗(yàn)規(guī)模等因素進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。例如,當(dāng)制備規(guī)模不同時,可以改變上述試劑的用量,并選擇適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)設(shè)備以匹配規(guī)模的需求;再比如,攪拌速度不同時,攪拌時間可以適當(dāng)?shù)匮娱L或縮短。實(shí)施例2:對照制備方法1.第一試劑的制備同實(shí)施例1。
2.第二試劑制備過程如下:a)用20mM MES溶液(ρΗ5.0)在室溫下稀釋4ml人25羥維生素D抗原(10mg/ml),至抗原終濃度為2mg/ml ;b)用20mM MES溶液(pH5.0)在室溫下稀釋lml223nm聚苯乙烯膠乳顆粒,至膠乳濃度為4% ;c)稱取1.5mg 二氨基二丙基亞胺加入b)中攪拌10至60min,例如30min ;d)將c)獲得的聚苯乙烯膠乳顆粒滴加進(jìn)a),混勻,30°C 150rpm搖床中反應(yīng)1_4小時,例如3小時;e)將d)獲得的液體離心,并用去離子水清洗2-3遍,去上清,獲得膠乳顆粒沉淀;f)用20mM MES溶液(pH5.0)稀釋e)獲得的膠乳顆粒至1.25%,根據(jù)需要可以加入0.1%防腐劑;g)超聲分散后,獲得第二試劑。3.校準(zhǔn)品的制備過程同實(shí)施例1。實(shí)施例3:25羥維生素D校準(zhǔn)曲線的繪制本發(fā)明試劑盒的測定步驟如下:
權(quán)利要求
1.一種25羥維生素D檢測試劑盒,其包含: 第一試劑,和 第二試劑; 其中, 第一試劑包含25羥維生素D抗體、維生素D結(jié)合蛋白抗體和緩沖液, 第二試劑包含結(jié)合有25羥維生素D抗原的微球和緩沖液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的25羥維生素D檢測試劑盒,其中 所述緩沖液選自磷酸緩沖液、甘氨酸緩沖液、MES緩沖液、硼酸緩沖液、醋酸鹽緩沖液、2-嗎啉乙磺酸緩沖液或氯化銨緩沖液中的一種或幾種; 所述緩沖液濃度為10-500mM。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的25羥維生素D檢測試劑盒,其中 所述維生素D結(jié)合蛋白抗體為多克隆抗體或單克隆抗體; 所述25羥維生素D抗體為多克隆抗體或單克隆抗體; 其中多克隆抗體源自兔、羊或雞,單克隆抗體源自鼠或兔。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的25羥維生素D檢測試劑盒,其中 所述25羥維生素D抗原為自然抗原或人工合成抗原。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的25羥維生素D檢測試劑盒,其中 所述微球是由聚苯乙烯、丙烯酸、丙烯酸相關(guān)酯類中的一種或幾種聚合而成的膠乳顆粒;微球直徑在150-500nm之間。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的25羥維生素D檢測試劑盒,其還包括校準(zhǔn)品,所述校準(zhǔn)品包含已知濃度的25羥維生素D。
7.一種結(jié)合有25羥維生素D抗原的微球的制備方法,所述方法包括步驟: 活化25羥維生素D抗原; 活化微球; 將活化的25羥維生素D抗原與活化的微球連接,從而獲得結(jié)合有25羥維生素D抗原的微球。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法,其中所述活化25羥維生素D抗原的步驟所用的試劑選自羰基二咪唑、無水丙酮、二氨基二丙基亞胺、乙基二甲基胺丙基碳化二亞胺和2-嗎啉乙磺酸中的一種或多種。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法,其中所述微球?yàn)轸然揎椀奈⑶颉?br>
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法,其中所述活化25羥維生素D抗原的步驟與所述活化微球的步驟的操作順序是可互換的。
全文摘要
本發(fā)明涉及25羥維生素D檢測試劑盒及其制備方法。該試劑包括第一試劑、第二試劑,可選地還可以包括校準(zhǔn)品。第一試劑包含25羥維生素D抗體、維生素D結(jié)合蛋白抗體和緩沖液;第二試劑含有結(jié)合有25羥維生素D抗原的微球和緩沖液。該試劑盒利用樣本中的25羥維生素D與結(jié)合在微球表面的抗原競爭結(jié)合25羥維生素D抗體,使得結(jié)合有25羥維生素D的微球與25羥維生素D抗體反應(yīng)形成的濁度下降,通過該濁度的下降程度推算樣本中25羥維生素D的含量。
文檔編號G01N33/82GK103163306SQ20131004564
公開日2013年6月19日 申請日期2013年2月5日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月5日
發(fā)明者劉鶴, 張小銳, 蔡華雅, 劉希 申請人:北京九強(qiáng)生物技術(shù)股份有限公司