VcLp15變體在基于TpN17的檢測抗密螺旋體抗體的免疫測定中作為抗干擾添加劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于檢測分離的樣品中的抗蒼白密螺旋體的TpN17抗原的抗體的方法，其中用霍亂弧菌脂蛋白15(VcLp15)的肽序列或其部分序列作為用于減少干擾(即用于最少化假陽性結(jié)果)的試劑。此外，本發(fā)明涉及包含VcLp15肽序列和分子伴侶的融合多肽，它們在免疫測定中作為用于減少干擾和用于最少化假陽性結(jié)果的添加劑的用途，及包含TpN17抗原和該VcLp15分子伴侶融合多肽的用于檢測分離的樣品中的抗蒼白密螺旋體抗原的抗體的試劑盒。
【專利說明】VcLp15變體在基于TpN17的檢測抗密螺旋體抗體的免疫測 定中作為抗干擾添加劑
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及用于檢測分離的樣品中的抗蒼白密螺旋體（Treponema pallidum)的 TpN17抗原的抗體的方法，其中用霍亂弧菌脂蛋白15(VcLpl5)的肽序列作為用于減少干擾 和用于最少化假陽性結(jié)果的試劑。此外，本發(fā)明涉及包含VcLpl5肽序列和分子伴侶的融合 多肽，它們在免疫測定中作為用于減少干擾和用于最少化假陽性結(jié)果的添加劑的用途，及 包含TpN17抗原和該VcLpl5分子伴侶融合多肽的用于檢測分離的樣品中的抗蒼白密螺旋 體抗原的抗體的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 梅毒（Syphilis，又名Lues)是由隸屬于螺旋體細(xì)菌家族的蒼白密螺旋體引起的 嚴(yán)重感染性疾病。它主要通過性接觸傳播，但也可以在妊娠期間從孕婦傳至胎兒。該疾病 表征為不同的臨床階段和長的潛伏、無癥狀感染期。許多感染個體未注意到癥狀，因此多年 未意識到其梅毒感染。初次感染有限，且通常引起小的無痛潰瘍（第一階段，"梅毒I (Lues I)"）。如果不進(jìn)行青霉素治療，則該疾病進(jìn)展至第二階段梅毒II (Lues II)(感染后約8 周），其產(chǎn)生流感樣癥狀、非發(fā)癢性皮疹和腫脹淋巴結(jié)。幾年后，在梅毒IlKLues III)階 段，全身出現(xiàn)梅毒結(jié)節(jié)（syphilitic node)。最后的階段（梅毒IV(Lues IV))表征為中樞 神經(jīng)系統(tǒng)的破壞，最終導(dǎo)致神經(jīng)和心臟障礙、全身麻搏（general paralysis)、共濟(jì)失調(diào)、癡 呆和失明。
[0003] 雖然由于在20世紀(jì)中葉引入了青霉素而有有效的療法可用，但梅毒仍是重要的 全球性健康問題，估計全世界每年有一千二百萬例新的感染。必須可靠地鑒別密螺旋體感 染患者，以起始抗生素療法，從而預(yù)防梅毒的進(jìn)一步傳播。因此，有必要提供可靠的診斷工 具（如免疫測定）來檢測抗蒼白密螺旋體的抗體。但是，為了在血清學(xué)應(yīng)用中用作特異性 化合物，重組衍生的蛋白質(zhì)必須滿足幾點要求，如溶解性、穩(wěn)定性和抗原性。
[0004] TpN17(蒼白密螺旋體菌株Nichols，17KDa)(其成熟形式是由134個氨基酸殘基組 成的小蛋白質(zhì)）是蒼白密螺旋體（梅毒的病原體）的免疫顯性抗原（1(：1111.1^1^11111111111〇1· (1998)，50, 27-44 ;Folia Microbial. (2003)48(4)，549-553)?？?TpN17 的抗體在密螺旋體 感染的個體中常見且豐富，有必要在旨在敏感和可靠地檢測密螺旋體感染的免疫測定中使 用 TpN17。
[0005] 但是，我們觀察到，用TpN17作為抗原的免疫測定傾向于顯示假陽性結(jié)果，即它提 供表面看來為陽性的信號，但實際上樣品中不存在抗密螺旋體的抗體。這些干擾是罕見但 顯著的現(xiàn)象。它們損害了免疫測定的特異性，且它們顯然是由梅毒免疫測定中實際上不可 或缺的蒼白密螺旋體抗原TpN17的使用引起。
[0006] 因此，本發(fā)明潛在的問題可以視為提供用于檢測抗密螺旋體抗體時避免假陽性結(jié) 果和提高基于TpN17的免疫測定的特異性的工具和方法。
[0007] 發(fā)明概述
[0008] 通過權(quán)利要求所表征的本發(fā)明來解決該問題。具體而言，本發(fā)明涉及用于檢 測分離的樣品中抗蒼白密螺旋體的TpN 17抗原的抗體的方法，其中用霍亂弧菌脂蛋白 15 (VcLpl5)的肽序列或其部分序列作為用于減少干擾，即用于最少化假陽性結(jié)果的試劑。 該VcLpl5多肽序列的部分序列可以包含SEQ ID NO. 1的氨基酸26-163。在另一實施方案 中，該VcLpl5肽序列或其部分序列與分子伴侶融合。
[0009] 本發(fā)明還涉及包含SEQ ID NO. 1的VcLpl5肽序列或其部分序列和分子伴侶的融 合多肽。在優(yōu)選實施方案中，與VcLpl5肽序列融合的分子伴侶選自SlyD、SlpA、FkpA和 Skp〇
[0010] 在另一優(yōu)選實施方案中，該融合多肽包含SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 3是大腸桿菌 (E. coli) SlyD 和 VcLpl5 的融合多肽（EcSlyD-VcLpl5)。
[0011] 本發(fā)明還涵蓋包含VcLpl5肽和可選的分子伴侶的融合多肽作為添加劑在免疫測 定中減少干擾和最少化假陽性結(jié)果中的用途。
[0012] 在另一實施方案中，本發(fā)明涉及用于通過免疫測定檢測分離的樣品中抗蒼白密螺 旋體抗原的抗體的試劑盒，其包含TpN17抗原、及含有VcLpl5肽和可選的分子伴侶的融合 多肽。
[0013] 本發(fā)明還涉及用于檢測分離的樣品中抗蒼白密螺旋體的TpN17抗原的抗體的方 法，該方法包括 ：
[0014] a)通過將體液樣品與存在于該樣品中的該抗體可以特異性結(jié)合的特異性結(jié)合配 偶體混合來形成免疫反應(yīng)混合物；
[0015] b)在向該樣品加入該特異性結(jié)合配偶體之前、同時或之后向該免疫反應(yīng)混合物加 入包含VcLpl5肽和可選的分子伴侶的融合多肽；
[0016] c)維持該免疫反應(yīng)混合物足以使存在于該體液樣品中的抗體與該特異性結(jié)合配 偶體進(jìn)行免疫反應(yīng)，以形成免疫反應(yīng)產(chǎn)物的時期；和
[0017] d)檢測該免疫反應(yīng)產(chǎn)物中的任一種的存在和/或濃度。
[0018] 附圖、附表和SEQ ID N0簡述
[0019] 圖1顯示本發(fā)明的融合多肽EcSlyD-VcLpl5的近UV⑶光譜（紫外圓二色譜）；更 多細(xì)節(jié)見實施例4,實施例4描述通過⑶光譜監(jiān)測的熱誘導(dǎo)的EcSlyD-VcLpl5的解折疊。
[0020] 圖2顯示通過近UV區(qū)中的⑶光譜監(jiān)測的本發(fā)明的融合多肽EcSlyD-VcLpl5的熔 解曲線。細(xì)節(jié)見實施例4。 圖3顯示具有與它的N端符合讀框地融合的兩個SlyD分子伴侶單位的密螺旋體TpN17 全長抗原23-156的示意圖。為了表示該SlyD融合配偶體的大腸桿菌來源，將所示融合多 肽命名為 EcSlyD-EcSlyD-TpN17(23-156);還見 SEQ ID N0.8。
[0021] 表1顯示用于本研究（實施例2)的融合多肽變體的蛋白質(zhì)參數(shù)。
[0022] 表2至5顯示按照實施例5對霍亂弧菌Lpl5在梅毒免疫測定中的抗干擾活性進(jìn) 行的實驗的結(jié)果。
[0023] 表2顯示寡聚TpN17作為密螺旋體特異性抗原的結(jié)果，其中加入單體VcLpl5(與 作為分子伴侶的SlyD融合）來減少干擾。
[0024] 表3顯示單體TpN17作為密螺旋體特異性抗原的結(jié)果，其中加入單體VcLpl5(與 作為分子伴侶的SlyD融合）來減少干擾。
[0025] 表4顯示寡聚TpN17作為密螺旋體特異性抗原的結(jié)果，其中加入寡聚VcLpl5(與 作為分子伴侶的Skp融合）來減少干擾。
[0026] 表5顯示單體TpN17作為密螺旋體特異性抗原的結(jié)果，其中加入寡聚VcLpl5(與 作為分子伴侶的Skp融合）來減少干擾。
[0027] SEQ ID NO. 1顯示可從公共數(shù)據(jù)庫UniProt檢索號Q9KQN6檢索到的霍亂弧菌脂 蛋白15 (VcLpl5)的完整氨基酸序列（163個殘基）。氨基酸殘基1-25組成信號序列；成熟 VcLpl5包含氨基酸殘基26-163 (下劃線）。
[0028] MMKKSIFALS ALTLILVGCD NQQDAKVEVE KVVDVAAAPA EQSAAQPSTA
[0029] SVDAAHNAQN SLDffAGIYQG TLPCADCGGI ETELTLNADG TYALTEKYLD
[0030] KEGEPFASQG TFVWNEAGNI VTLQTCDQTG RQFMVGENTL· SHLDMEGKVI
[0031] EGELAEFYVL SKQ
[0032] SEQ ID NO. 2顯示用于與不同分子伴侶組件融合的VcLpl5序列（26-163)。成熟 VcLpl5序列（氨基酸殘基26-163)缺乏N端信號序列（氨基酸殘基1-25)，且缺乏半胱氨 酸殘基。用丙氨酸殘基（下劃線）取代VcLpl5的74和77位（前體蛋白的編號）的兩個 真實的半胱氨酸殘基，以便于重折疊過程，并抑制二硫鍵加合物形成。VcLpl5在C端具有六 組氨酸標(biāo)記（下劃線），以便于純化，并使得能夠通過金屬柱（Ni、Zn、Cu)進(jìn)行基質(zhì)偶聯(lián)的 重折疊。
[0033] KVEVEKVVDV AAAPAEQSAA QPSTASVDAA HNAQNSLDWA GIYQGTLPAA
[0034] DAGGIETELT LNADGTYALT EKYLDKEGEP FASQGTFVWN EAGNIVTLQT
[0035] ⑶QTGRQFMV GENTLSHLDM EGKVIEGELA EFYVLSKQLE HHHHHH
[0036] SEQ ID N0. 3顯示本發(fā)明的融合多肽EcSlyD_VcLpl5,其包含作為分子伴侶的一分 子大腸桿菌SlyD和成熟VcLpl5序列（26-163,下劃線）。
[0037] MKVAKDLVVS LAYQVRTEDG VLVDESPVSA PLDYLHGHGS LISGLETALE GHEVGDKFDV
[0038] AVGANDAYGQ YDENLVQRVP KDVFMGVDEL QVGMRFLAET DQGPVPVEIT AVEDDHVVVD
[0039] GNHMLAGQNL KFNVEVVAIR EATEEELAHG HVHGAHDHHH DHDHDGGGSG GGSGGGSGGG
[0040] SGGGSGGGKV EVEKVVDVAA APAEQSAAQP STASVDAAHN AQNSLDffAGI YQGTLPAADA
[0041] GGIETELTLN ADGTYALTEK YLDKEGEPFA SQGTFVWNEA GNIVTLQTCD QTGRQFMVGE
[0042] NTLSHLDMEG KVIEGELAEF YVLSKQLEHH HHHH
[0043] SEQ ID NO. 4顯示本發(fā)明的融合多肽EcSkp-VcLpl5,其包含作為分子伴侶的一分 子大腸桿菌Skp和成熟VcLpl5序列（26-163,下劃線）。
[0044] MADKIAIVNM GSLFQQVAQK TGVSNTLENE FRGRASELQR METDLQAKMK KLQSMKAGSD
[0045] RTKLEKDVMA QRQTFAQKAQ AFEQDRARRS NEERGKLVTR IQTAVKSVAN SQDIDLVVDA
[0046] NAVAYNSSDV KDITADVLKQ VKGGGSGGGS GGGSGGGSGG GSGGGKVEVE KVVDVAAAPA
[0047] EQSAAQPSTA SVDAAHNAQN SLDffAGIYQG TLPAADAGGI ETELTLNADG TYALTEKYLD
[0048] KEGEPFASQG TFVWNEAGNI VTLQTCDQTG RQFMVGENTL· SHLDMEGKVI EGELAEFYVL
[0049] SKQLEHHHHH H
[0050] SEQ ID NO. 5顯示從公共數(shù)據(jù)庫UniProt檢索號UniProt ID P29722下檢索的蒼 白密螺旋體抗原的完整TpN17序列（氨基酸殘基1-156)。
[0051] MKGSVRALCA FLGVGALGSA LCVSCTTVCP HAGKAKAEKV ECALKGGIFR
[0052] GTLPAADCPG IDTTVTFNAD GTAQKVELAL EKKSAPSPLT YRGTWMVRED
[0053] GIVELSLVSS EQSKAPHEKE LYELIDSNSV RYMGAPGAGK PSKEMAPFYV
[0054] LKKTKK
[0055] SEQ ID NO. 6顯示實施例5中所用的TpN17序列。對于此免疫測定，使用了缺乏信 號序列（氨基酸殘基1-22)的成熟TpN17蛋白質(zhì)（氨基酸殘基23-156)。我們發(fā)現(xiàn)，TpN17 的四個真實的半胱氨酸殘基對蛋白質(zhì)的抗原性而言可有可無（數(shù)據(jù)未顯示）。因此，用丙氨 酸殘基（下劃線）取代了 25、29、42和58位（前體蛋白的編號）的半胱氨酸殘基，以便于 重折疊過程，并抑制有害的副反應(yīng)，如二硫鍵加合物形成。
[0056] VSATTVAPHA GKAKAEKVEA ALKGGIFRGT LPAADAPGID TTVTFNADGT
[0057] AQKVELALEK KSAPSPLTYR GTWMVREDGI VELSLVSSEQ SKAPHEKELY
[0058] ELIDSNSVRY MGAPGAGKPS KEMAPFYVLK KTKK
[0059] SEQ ID N0. 7顯示用于與不同分子伴侶組件融合的TpN17序列氨基酸殘基 23-156(還見SEQ ID N0. 6)。TpN17在C端具有六組氨酸標(biāo)記（下劃線），以便于純化，并 使得能夠通過金屬柱（Ni、Zn、Cu)進(jìn)行基質(zhì)偶聯(lián)的重折疊。省去了 TpN17的N端信號序列 (氨基酸殘基1-22)，以獲得處于其天然樣構(gòu)象的成熟（加工）形式的蛋白質(zhì)。
[0060] VSATTVAPHA GKAKAEKVEA ALKGGIFRGT LPAADAPGID TTVTFNADGT
[0061] AQKVELALEK KSAPSPLTYR GTWMVREDGI VELSLVSSEQ SKAPHEKELY
[0062] ELIDSNSVRY MGAPGAGKPS KEMAPFYVLK KTKKLEHHHH HH
[0063] SEQ ID NO. 8顯示已在N端融合了兩分子大腸桿菌SlyD( "串聯(lián)SlyD"）的TpN17 序列（下劃線）；此分子也稱為EcSlyD-EcSlyD-TpN17或EcSS-TpN17。
[0064] MKVAKDLVVS LAYQVRTEDG VLVDESPVSA PLDYLHGHGS LISGLETALE GHEVGDKFDV
[0065] AVGANDAYGQ YDENLVQRVP KDVFMGVDEL QVGMRFLAET DQGPVPVEIT AVEDDHVVVD
[0066] GNHMLAGQNL KFNVEVVAIR EATEEELAHG HVHGAHDHHH DHDHDGGGSG GGSGGGSGGG
[0067] SGGGSGGGKV AKDLVVSLAY QVRTEDGVLV DESPVSAPLD YLHGHGSLIS GLETALEGHE
[0068] VGDKFDVAVG ANDAYGQYDE NLVQRVPKDV FMGVDELQVG MRFLAETDQG PVPVEITAVE
[0069] DDHVVVDGNH MLAGQNLKFN VEVVAIREAT EEELAHGHVH GAHDHHHDHD HDGGGSGGGS
[0070] GGGSGGGSGG GSGGGVSATT VAPHAGKAKA EKVEAALKGG IFRGTLPAAD APGIDTTVTF
[0071] NADGTAQKVE LALEKKSAPS PLTYRGTWMV REDGIVELSL VSSEQSKAPH EKELYELIDS
[0072] NSVRYMGAPG AGKPSKEMAP FYVLKKTKKL EHHHHHH
[0073] SEQ ID NO. 9顯不已在N端融合了兩分子多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida)SlyD( "串聯(lián)SlyD"）的TpN17序列（下劃線）；此分子也稱為 PmSlyD-PmSlyD-TpN17 或 PmSS-TpN17。
[0074] MKIAKNVVVS IAYQVRTEDG VLVDEAPVNQ PLEYLQGHNN LVIGLENALE GKAVGDKFEV
[0075] RVKPEEAYGE YNENMVQRVP KDVFQGVDEL VVGMRFIADT DIGPLPVVIT EVAENDVVVD
[0076] GNHMLAGQEL LFSVEVVATR EATLEEIAHG HIHQEGGGGS GGGSGGGGGS GGGSGGGKIA
[0077] KNVWSIAYQ VRTEDGVLVD EAPVNQPLEY LQGHNNLVIG LENALEGKAV ⑶KFEVRVKP
[0078] EEAYGEYNEN MVQRVPKDVF QGVDELVVGM RFIADTDIGP LPVVITEVAE NDVVVDGNHM
[0079] LAGQELLFSV EVVATREATL EEIAHGHIHQ EGGGGSGGGS GGGSGGGSGG GSGGGVSATT
[0080] VAPHAGKAKA EKVEAALKGG IFRGTLPAAD APGIDTTVTF NADGTAQKVE LALEKKSAPS
[0081] PLTYRGTWMV REDGIVELSL VSSEQSKAPH EKELYELIDS NSVRYMGAPG AGKPSKEMAP
[0082] FYVLKKTKKL EHHHHHH
[0083] SEQ ID NO. 10顯示已在N端融合了一分子大腸桿菌FkpA的TpN17序列（下劃 線）；此分子也稱為EcFkpA-TpN17。
[0084] MAEAAKPATT ADSKAAFKND DQKSAYALGA SLGRYMENSL KEQEKLGIKL DKDQLIAGVQ
[0085] DAFADKSKLS DQEIEQTLQA FEARVKSSAQ AKMEKDAADN EAKGKEYREK FAKEKGVKTS
[0086] STGLVYQVVE AGKGEAPKDS DTVVVNYKGT LIDGKEFDNS YTRGEPLSFR LDGVIPGWTE
[0087] GLKNIKKGGK IKLVIPPELA YGKAGVPGIP PNSTLVFDVE LLDVKPAPKA DAKPEADAKA
[0088] ADSAKKGGGS GGGSGGGSGG GSGGGSGGGV SATTVAPHAG KAKAEKVEAA LKGGIFRGTL
[0089] PAADAPGIDT TVTFNADGTA QKVELALEKK SAPSPLTYRG TWMVREDGIV ELSLVSSEQS
[0090] KAPHEKELYE LIDSNSVRYM GAPGAGKPSK EMAPFYVLKK TKKLEHHHHH Η
[0091] SEQ ID NO. 11顯示已在Ν端融合了一分子大腸桿菌Skp的ΤρΝ17序列（下劃線）； 此分子也稱為EcSkp-TpN17。
[0092] MADKIAIVNM GSLFQQVAQK TGVSNTLENE FRGRASELQR METDLQAKMK KLQSMKAGSD
[0093] RTKLEKDVMA QRQTFAQKAQ AFEQDRARRS NEERGKLVTR IQTAVKSVAN SQDIDLVVDA
[0094] NAVAYNSSDV KDITADVLKQ VKGGGSGGGS GGGSGGGSGG GSGGGVSATT VAPHAGKAKA
[0095] EKVEAALKGG IFRGTLPAAD APGIDTTVTF NADGTAQKVE LALEKKSAPS PLTYRGTWMV
[0096] REDGIVELSL VSSEQSKAPH EKELYELIDS NSVRYMGAPG AGKPSKEMAP FYVLKKTKKL
[0097] EHHHHHH
[0098] SEQ ID NO. 12顯示可以用作幾個分子伴侶部分之間的柔性、可溶和蛋白酶抗性間 隔區(qū)或接頭的富含甘氨酸的間隔區(qū)（包含由絲氨酸分開的三甘氨酸單位）的氨基酸序列。
[0099] GGGSGGGSGG GSGGGSGGGS GGG
[0100] 發(fā)明詳述
[0101] 如本發(fā)明人可以證明，用于檢測抗蒼白密螺旋體的抗體的免疫測定傾向于顯示假 陽性結(jié)果。具體而言，在使用密螺旋體抗原TpN17時，假陽性信號的數(shù)目顯著提高。已用明 確表征為抗密螺旋體陰性的人血清觀察到了這種現(xiàn)象：在使用TpN17抗原時，發(fā)現(xiàn)了顯著 數(shù)目的假陽性（見實施例5)。但是，TpN17是密螺旋體感染中極其重要的免疫原和梅毒血 清學(xué)中最重要的抗原。因此，通過簡單地舍棄TpN17抗原來避免此干擾問題不是可行的選 擇。
[0102] 我們因此開始設(shè)計能夠可靠和靈敏地檢測抗TpN17抗體的重組TpN17變體。更確 切地說，我們通過富含甘氨酸和絲氨酸殘基的柔性接頭將TpN17與賦予溶解性的分子伴侶 (串聯(lián)SlyD，即EcSlyD-EcSlyD和PmSlyD-PmSlyD)融合。由于所融合的助折疊蛋白的有益 作用，得到的融合多肽符合用于血清學(xué)目的（即用于免疫測定）良好抗原的所有物理化學(xué) 和免疫學(xué)要求。
[0103] 我們設(shè)計用于自動梅毒免疫測定的分子伴侶-TpN17融合蛋白質(zhì)具有高度可溶和 反應(yīng)性，并有利地用于雙抗原夾心形式。如上文所提到，在梅毒免疫測定的可行性研究期 間，結(jié)果證明TpN17確實是具有杰出診斷意義的免疫顯性密螺旋體抗原。換言之，為了保證 所希望的靈敏度，有必要在梅毒免疫測定中使用TpN17變體。但是，當(dāng)在雙抗原夾心（DAGS) 形式中使用TpN17的分子伴侶多肽融合構(gòu)建體時，此問題變得明顯：即使已以不對稱方式 (即通過在生物素一側(cè)和釕一側(cè)使用不同的融合配偶體來有意地去除DAGS形式的對稱性） 設(shè)計了 TpN17融合構(gòu)建體，且盡管用分子伴侶聚合物作為抗干擾添加劑，在一系列良好表 征的抗密螺旋體陰性人血清中還是出現(xiàn)了相當(dāng)多的陽性結(jié)果，導(dǎo)致測定特異性的實質(zhì)性惡 化。顯然，一些抗密螺旋體陰性人血清包含至少一種能夠與TpN17抗原特異性相互作用的 未知因子。
[0104] 令我們驚奇的是，如在實施例5和表2-5中可見，結(jié)果證明，向免疫測定混合物中 加入重組衍生的來自人病原體霍亂弧菌（盡管存在某些序列同源性，但其是與蒼白密螺旋 體極不相關(guān)的生物）的蛋白質(zhì)Lpl5(VcLpl5)將提高的假陽性信號降低至陰性血清的信號 水平。我們得出結(jié)論，VcLpl5(在以非標(biāo)記形式加入時）能夠識別、結(jié)合和猝滅（quench)抗 TpN17的一種或多種未知的干擾因子。結(jié)果確實證明，VcLpl5是用于減少基于密螺旋體抗 原TpN17的梅毒免疫測定的假陽性結(jié)果和改善其特異性的非常寶貴的工具。
[0105] 具體而言，本發(fā)明涉及用于檢測分離的樣品中抗蒼白密螺旋體的TpN17抗原的抗 體的方法，其中用霍亂弧菌脂蛋白15(VcLpl5)的肽序列或其部分序列作為用于減少干擾 和用于最少化假陽性結(jié)果的試劑。
[0106] 可以使用任意TpN17抗原或其變體，只要該抗原的構(gòu)象足夠像天然構(gòu)象，以被存 在于樣品中的抗體識別。在其天然宿主蒼白密螺旋體中，TpN17的N端信號序列（殘基 1-22)從前體蛋白切下，以允許成熟TpN17部分折疊為其天然構(gòu)象。換言之，在諸如大腸桿 菌的原核宿主中重組產(chǎn)生TpN17時，信號序列可有可無。它反而妨礙靶分子的正確折疊，因 此將它省去。優(yōu)選地，使用UniProt ID P29722(SEQ ID N0. 5)或SEQ ID N0. 6的肽序列或 SEQ ID NO. 5或6的部分序列。該部分序列包含SEQ ID NO. 5或6的至少約100個氨基酸。 最優(yōu)選的是包含SEQ ID N0. 5的氨基酸殘基23-156或SEQ ID N0. 6的氨基酸殘基1-134 的氨基酸序列。
[0107] 優(yōu)選的TpN17抗原是SEQ ID N0. 7至11的多肽，其中已將TpN17與多種分子伴侶 肽序列融合。為了便于純化后的重折疊過程，并抑制二硫鍵加合物形成，可以用其他氨基酸 殘基（如丙氨酸或絲氨酸）取代所設(shè)想的所有TpN17抗體中的半胱氨酸殘基。這些殘基取 代半胱氨酸側(cè)鏈的對氧化敏感的巰基部分，但大小與半胱氨酸殘基幾乎相同。因此，它們通 常適于嵌入整體三維蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)而不嚴(yán)重?fù)p害無半胱氨酸的蛋白質(zhì)變體的折疊和穩(wěn)定性。
[0108] 根據(jù)本發(fā)明的方法，用霍亂弧菌脂蛋白15(VcLpl5)的肽序列或其部分序列作為 用于減少干擾，即用于最少化假陽性結(jié)果的試劑。優(yōu)選地，該VcLpl5的部分序列包含SEQ ID NO. 1或2的氨基酸殘基26-163。包含SEQ ID NO. 1的殘基1-25的N端信號序列可有 可無。在本發(fā)明的另一模式中，SEQ ID NO. 1或2的氨基酸殘基26-163的該VcLpl5部分 序列可以在其N端或C端或兩端截短1至5個氨基酸。在另一實施方案中，可以以這樣的 方式修飾SEQ ID NO. 1或2的氨基酸殘基26-163的該VcLpl5部分序列，使得可以引入保 守氨基酸取代，如，例如用絲氨酸殘基或半胱氨酸取代丙氨酸殘基?？梢杂昧硗鈨煞N氨基酸 取代這三種氨基酸中的任一種。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的保守氨基酸取代的其他實例是絲氨 酸/半胱氨酸/丙氨酸、異亮氨酸/纈氨酸或苯丙氨酸/酪氨酸。對于這些修飾中的任一 種，保持霍亂弧菌脂蛋白15(VcLpl5)的三維結(jié)構(gòu)不變很重要。
[0109] 優(yōu)選地，將用于上述方法中的VcLpl5肽序列或其部分序列與分子伴侶融合來提 供高表達(dá)產(chǎn)率和便于純化后的重折疊過程。
[0110] 本發(fā)明的另一方面是包含SEQ ID NO. 1或2的VcLp 15肽序列或SEQ ID NO. 1或 2的部分序列和分子伴侶的融合多肽。
[0111] 通過將分子伴侶與難溶的靶抗原序列融合來使其增溶并變得更為良性的多肽融 合蛋白質(zhì)的用途為本領(lǐng)域公知，并在之前詳細(xì)描述于如國際專利申請W0 2003/000878中。 有用的融合分子伴侶的已知和充分記載的實例是SlyD、FkpA、Skp和SlpA，還見歐洲專利申 請EP2127678A1。
[0112] 因此，本發(fā)明的另一方面是包含VcLpl5肽序列和分子伴侶的融合多肽。在優(yōu)選實 施方案中，該分子伴侶選自SlyD、SlpA、FkpA和Skp。這些分子伴侶可以源自多種生物，優(yōu) 選衍生自大腸桿菌的分子伴侶序列。
[0113] 在本發(fā)明的另一實施方案中，該包含VcLpl5肽序列的融合多肽含有SEQ ID NO. 3(EcSlyD-VcLpl5) 〇
[0114] 包含VcLpl5肽序列和分子伴侶的融合多肽作為免疫測定中的添加劑在減少干擾 和最少化假陽性結(jié)果中的用途也是本發(fā)明的一個方面。
[0115] 本發(fā)明的另一方面是用于通過免疫測定來檢測分離的樣品中抗蒼白密螺旋體抗 原的抗體的試劑盒，其包含TpN17抗原及上文進(jìn)一步詳述的含有VcLpl5肽序列和分子伴侶 的融合多肽。
[0116] 此外，本發(fā)明涵蓋用于檢測分離的樣品中抗蒼白密螺旋體的TpN17抗原的抗體的 方法，該方法包括步驟：
[0117] a)通過將體液樣品與存在于該樣品中的該抗體可以特異性結(jié)合的特異性結(jié)合配 偶體混合來形成免疫反應(yīng)混合物；
[0118] b)在向該樣品加入該特異性結(jié)合配偶體之前、同時或之后向該免疫反應(yīng)混合物加 入上文定義的包含VcLp 15肽序列的融合多肽；
[0119] c)維持該免疫反應(yīng)混合物足以使存在于該體液樣品中的抗體與該特異性結(jié)合配 偶體免疫反應(yīng)，以形成免疫反應(yīng)產(chǎn)物的時期；和
[0120] d)檢測該免疫反應(yīng)產(chǎn)物中的任一種的存在和/或濃度。
[0121] 可以在向該樣品加入該特異性結(jié)合配偶體之前、同時或之后向該免疫測定混合物 (包含樣品和特異性結(jié)合該樣品中的分析物抗體的結(jié)合配偶體）加入本發(fā)明的融合多肽。 優(yōu)選地，在使包含分析物抗體的體液樣品與該特異性結(jié)合配偶體接觸之前向該測試試劑加 入該融合多肽。
[0122] 在本發(fā)明的一個實施方案中，按照所謂的雙抗原夾心概念（DAGS)進(jìn)行用于檢測 分離的樣品中的抗密螺旋體抗體的免疫測定。此測定概念有時也稱為雙抗原橋概念，因為 兩種抗原通過抗體分析物橋接。在這種測定中，需要和使用抗體用它的兩個（IgG、IgE)、四 個（IgA)或十/十二個（IgM)抗體配位結(jié)合給定抗原的至少兩個不同分子的能力。
[0123] 更具體而言，通過將包含抗密螺旋體抗體的樣品與兩種不同的TpN17抗原（即第 一（"固相"）TpN17抗原和第二（"檢測"）TpN17抗原）孵育來進(jìn)行按照雙抗原橋形式測 定抗密螺旋體抗體的免疫測定，其中該抗原中的每一種特異性結(jié)合該抗密螺旋體抗體。該 第一抗原與固相直接或間接結(jié)合或可以直接或間接結(jié)合，且通常攜帶效應(yīng)基團(tuán)，該效應(yīng)基 團(tuán)是如生物素/抗生物素蛋白的生物親和性（bioaffine)結(jié)合對。例如，如果該第一抗原綴 合至生物素，則用抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白包被固相。該第二抗原攜帶可檢測標(biāo) 記。然后形成包含第一抗原、樣品抗體和第二抗原的免疫反應(yīng)混合物。然后在向該抗原加 入樣品之前或在形成免疫反應(yīng)混合物之后加入該第一抗原可以與之結(jié)合的固相。維持此免 疫反應(yīng)混合物足以使體液樣品中抗該TpN17抗原的抗密螺旋體抗體與該TpN17抗原免疫反 應(yīng)形成免疫反應(yīng)產(chǎn)物的時期。下一步是分離步驟，其中將液相從固相分離。最后，在固相或 液相或二者中檢測該免疫反應(yīng)產(chǎn)物中的任一種的存在。
[0124] 在該DAGS免疫測定中，"固相抗原"和"檢測抗原"的基本結(jié)構(gòu)相同。還可能使用 相似但不同的TpN17抗原，該抗原在雙抗原橋測定中在免疫學(xué)上交叉反應(yīng)。進(jìn)行這類測定 的基本要求是兩種抗原上存在一個或多個相關(guān)表位。根據(jù)本發(fā)明，希望將不同的融合部分 用于各TpN17抗原（例如，EcFkpA與固相一側(cè)的TpN17融合，EcSkp與檢測一側(cè)的TpN17融 合），因為這類區(qū)別打破了 DAGS形式的對稱性，從而減少了抗體介導(dǎo)的融合分子伴侶橋接 的問題，該問題可以導(dǎo)致免疫測定的假陽性結(jié)果。簡言之，在DAGS形式的兩側(cè)使用結(jié)構(gòu)上 差距大的融合配偶體減少了不想要的免疫學(xué)交叉反應(yīng)，從而改善特異性。
[0125] 因此，本發(fā)明涉及用于檢測分離的樣品中抗蒼白密螺旋體的TpN17抗原的抗體的 方法，其中用VcLpl5的肽序列作為用于減少干擾和用于最少化假陽性結(jié)果的試劑。該方 法進(jìn)一步表征為以雙抗原夾心形式（DAGS)進(jìn)行該測定。此外，該測定使用兩種TpN17抗原 融合多肽（第一和第二TpN17抗原），其中兩種TpN17抗原相同、或至少在免疫學(xué)上與同一 抗體交叉反應(yīng)，使得可能通過存在于樣品中的抗體來在兩種抗原之間橋接。此外，如前一段 落中所述，該第一和第二抗原與不同分子伴侶融合。
[0126] 此外，如Skp和FkpA的特異性分子伴侶融合配偶體的使用可以便于顯著改善的 IgM識別和檢測。由于其結(jié)合的親合力模式，IgM分子僅可以與具有中至高表位密度的聚合 抗原反應(yīng)。Skp和FkpA都是在革蘭氏陰性菌的周質(zhì)（periplasm)中作為助折疊物發(fā)揮作 用的寡聚分子伴侶。令我們驚奇地，我們發(fā)現(xiàn)，在將大的靶分子與分子伴侶的C端融合時， 保持了 Skp和FkpA的四級結(jié)構(gòu)。因此，F(xiàn)kpA-TpN17和Skp-TpN17融合蛋白質(zhì)可再現(xiàn)地形 成具有足以檢測IgM分子的確定的表位密度的天然寡聚物。靈敏和特異的IgM檢測是保 證早期和原發(fā)性梅毒感染的可靠檢測的非常重要的特征。由于我們旨在發(fā)展用于全免疫 球蛋白檢測（即檢測IgG和IgM二者）的免疫測定，可以將寡聚抗原組件FkpA-TpN17和 Skp-TpN17有利地用作DAGS形式兩側(cè)的指定成分（specifier)(例如FkpA-TpN17-生物素和 Skp-TpN17-釕）。由于FkpA和Skp就結(jié)構(gòu)而言彼此非常不同，不想要的免疫學(xué)交叉反應(yīng)和 通過融合配偶體橋接的風(fēng)險非常低。通過向該測定加入化學(xué)聚合的FkpA和Skp抗干擾添 加劑來進(jìn)一步降低該風(fēng)險。
[0127] 用于檢測分析物的多種其他形式和原理的免疫測定及不同的檢測模式已被廣泛 描述，且為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。
[0128] 根據(jù)本發(fā)明，可以使用可能檢測到其中的密螺旋體抗體的任意分離的生物樣品。 具體而言，人血液、血清、血漿或唾液適合作為樣品材料。
[0129] 在實施例部分中進(jìn)一步說明本發(fā)明。
[0130] 實施例1
[0131] TpN17和VcLpl5分子伴侶融合多肽的克隆和純化
[0132] 表達(dá)盒的克隆
[0133] 以Novagen (Madison, WI,美國）的pET24a表達(dá)質(zhì)粒為基礎(chǔ)，基本上按Scholz, C. 等，J. Mol. Biol. (2005) 345, 1229-1241 所述獲得 了編碼 TpN17 和 VcLpl5 融合蛋白的 表達(dá)盒。TpN17和VcLpl5抗原的序列檢索自SwissProt數(shù)據(jù)庫（分別為SwissProt ID P29722和Q9KQN6)。編碼具有符合讀框地與N端融合的富含甘氨酸的接頭區(qū)域 的成熟TpN17 aa23-156(省去了跨越氨基酸殘基1-22的信號肽）的合成基因購自 Medigenomix(Martinsried,德國）。將TpN17的25、29、42和58位的半胱氨酸殘基變?yōu)楸?氨酸殘基，以防止不想要的副作用，如氧化或分子間二硫鍵橋接。BamHI和Xhol限制位點分 別位于TpN17編碼區(qū)的5'和3'端。另一編碼通過富含甘氨酸的接頭區(qū)連接的兩個EcSlyD 單位（SEQ ID NO. 1的殘基1-165, SwissProt檢索號P0A9K9)且在C端包含另一接頭區(qū)部 分的合成基因同樣購自Medigenomix。Ndel和BamHI限制位點分別位于此表達(dá)盒的5'和 3'端。設(shè)計基因和限制位點來使得能夠通過簡單的連接來符合讀框地融合分子伴侶部分 EcSlyD-EcSlyD和TpN17抗原部分。為了避免無意的重組過程和提高表達(dá)盒在大腸桿菌宿 主中的遺傳穩(wěn)定性，簡并化編碼EcSlyD單位的核苷酸序列，同樣對編碼延長的接頭區(qū)的核 苷酸序列進(jìn)行簡并，即用不同的密碼子組合來編碼相同的氨基酸序列。
[0134] 用Ndel和Xhol消化pET24a載體，并插入包含與密螺旋體TpN1723_156符合讀框 地融合的串聯(lián)SlyD的表達(dá)盒。相應(yīng)地構(gòu)建包含多殺性巴氏桿菌SlyD (1-156, SwissProt ID Q9CKP2)或大腸桿菌 Skp (21-161，SwissProt ID P0AEU7)或 FkpA (26-270, SwissProt ID P45523)的表達(dá)盒，以及包含不同于TpN17的靶多肽，尤其是霍亂弧菌脂蛋白Lpl5 (26-163， SwissProt ID Q9KQN6)的表達(dá)盒。與 TpN17-樣，將 VcLpl5 的 74 和 77 位（前體 Lpl5 編 號）的真實的半胱氨酸殘基變?yōu)楸彼釟埢苑乐共幌胍母弊饔?，如氧化或分子間二 硫鍵橋接。所有重組融合多肽變體都包含C端六組氨酸標(biāo)記，以便于Ni-NTA輔助的純化和 重折疊。用QuikChange(Stratagene，La ]〇1]^，04，1134)和標(biāo)準(zhǔn)？0?技術(shù)來在各表達(dá)盒中 產(chǎn)生點突變、缺失、插入和延長變體或限制位點。
[0135] 圖3顯示具有與它的N端符合讀框地融合的兩個SlyD分子伴侶單位的密螺旋體 TpN17全長抗原23-156的示意圖。為了表示該SlyD融合配偶體的大腸桿菌來源，將所示融 合多肽命名為 EcSlyD-EcSlyD-TpN17(23-156);還見 SEQ ID N0.8。
[0136]
[0137] 對所得到的質(zhì)粒的插入片段進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)它編碼希望的融合蛋白質(zhì)。SEQ ID NO. 2至4(VcLpl5)和7至11(ΤρΝ17)中顯示TpN17和VcLpl5融合多肽的完整氨基酸序列。 SEQ ID N0. 12中顯示接頭L的氨基酸序列。
[0138] 包含TpN17或VcLpl5的融合蛋白的純化
[0139] 通過使用基本相同的流程來純化所有TpN17和VcLpl5融合蛋白變體。在加入了 卡那霉素（30μ g/ml)的LB培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)包含具體的pET24a表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌 BL21 (DE3)細(xì)胞至0D6(?為1. 5,通過加入ImM異丙基-β -D-硫代半乳糖苷來誘導(dǎo)胞質(zhì)過表 達(dá)。誘導(dǎo)3小時后，通過離心（5000g20分鐘）收集細(xì)胞，冷凍，并保存在-20°C。對于細(xì)胞 裂解，將冷凍的沉淀重懸在預(yù)冷的50mM磷酸鈉 pH8. 0、7. 0M GdmCl、5mM咪唑中，冰上攪拌 懸液2小時至細(xì)胞完全裂解。離心和過濾（0. 45 μ m/0. 2 μ m)后，將粗裂解物上樣至用含 5. OmM TCEP的裂解緩沖液平衡的Ni-NTA柱上。隨后的洗滌步驟調(diào)整適應(yīng)于各靶蛋白，且在 5至15mM咪唑（在50mM磷酸鈉 ρΗ8· 0、7· 0M GdmCl、5. OmM TCEP中）的范圍內(nèi)。應(yīng)用至少 10-15體積的洗滌緩沖液。然后，用50mM磷酸鉀pH8. 0、100mM KCl、10mM咪唑、5. OmM TCEP 替換GdmCl溶液來誘導(dǎo)基質(zhì)結(jié)合的蛋白質(zhì)的構(gòu)象重折疊。為了避免共純化的蛋白酶的再激 活，在重折疊緩沖液中包含蛋白酶抑制劑混合物（Complete#無 EDTA，Roche)。在過夜反 應(yīng)中應(yīng)用了總計15-20柱體積的重折疊緩沖液。然后，通過用3-5個柱體積的50mM磷酸鉀 pH8·0、100mMKCl、10mM咪唑洗滌來去除TCEP和Comp丨ete?.無 EDTA抑制劑混合物二者。 隨后，將咪唑濃度（仍然在50mM磷酸鉀pH8. 0、100mM KC1中）升高至25-50mM(取決于各靶 蛋白），以去除非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)污染物。然后通過含500mM咪唑的相同緩沖液來洗脫 天然蛋白質(zhì)。通過N-[三（羥甲基）甲基]甘氨酸-SDS-PAGE來評估含蛋白質(zhì)的級分的純 度，并混合。最后，對蛋白質(zhì)進(jìn)行大小排阻層析（Superdex HiLoad，Amersham Pharmacia), 混合含蛋白質(zhì)的級分，并在Amicon池（YM10)中濃縮至10-20mg/ml。
[0140] 經(jīng)過偶聯(lián)的純化和重折疊流程之后，取決于各靶蛋白，可以從lg大腸桿菌濕細(xì)胞 獲得大約10_30mg的蛋白質(zhì)產(chǎn)率。
[0141] 實施例2
[0142] 光譜測量
[0143] 用Uvikon XL雙光束分光光度計進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度測量。通過使用 Pace(1995)，Protein Sci. 4, 2411-2423所述的方法來測定摩爾消光系數(shù)（ε28。）。用于不 同融合多肽的摩爾消光系數(shù)（ε 28(|)在表1中指出。
[0144] 表1 :用于本研究的融合多肽變體的蛋白質(zhì)參數(shù)。所有參數(shù)都指各蛋白質(zhì)單體。
[0145]
【權(quán)利要求】
1. 用于檢測分離的樣品中抗蒼白密螺旋體的TpN17抗原的抗體的方法，其中用霍亂弧 菌脂蛋白15 (VcLpl5)的肽序列作為用于減少干擾和用于最少化假陽性結(jié)果的試劑。
2. 權(quán)利要求 1 的方法，其中使用 UniProt ID Q9KQN6(SEQ ID NO. 1)或 SEQ ID NO. 2、 或SEQ ID NO. 1或2的部分序列的肽序列。
3. 權(quán)利要求2的方法，其中VcLpl5的部分序列包含SEQ ID NO. 1或2的氨基酸26-163。
4. 權(quán)利要求1至3中任一項的方法，其中VcLpl5肽序列或其部分序列與分子伴侶融 合。
5. 融合多肽，其包含SEQ ID NO. 1或2的VcLpl5肽序列或SEQ ID NO. 1或2的部分序 列和分子伴侶。
6. 權(quán)利要求5的融合多肽，其中分子伴侶選自SlyD、SlpA、FkpA和Skp。
7. 權(quán)利要求5或6的融合多肽，其包含SEQ ID NO. 3。
8. 權(quán)利要求5至7的融合多肽作為免疫測定中的添加劑的用途，用于減少干擾和用于 最少化假陽性結(jié)果。
9. 用于通過免疫測定檢測分離的樣品中抗蒼白密螺旋體抗原的抗體的試劑盒，其包含 TpN17抗原和權(quán)利要求5至7的融合多肽。
10. 用于檢測分離的樣品中抗蒼白密螺旋體的TpN17抗原的抗體的方法，所述方法包 括： a) 通過將體液樣品與存在于所述樣品中的所述抗體可以特異性結(jié)合的特異性結(jié)合配 偶體混合來形成免疫反應(yīng)混合物； b) 在向所述樣品加入所述特異性結(jié)合配偶體之前、同時或之后向所述免疫反應(yīng)混合物 加入權(quán)利要求5至7中任一項的融合多肽； c) 維持所述免疫反應(yīng)混合物足以使存在于所述體液樣品中的抗體與所述特異性結(jié)合 配偶體免疫反應(yīng)形成免疫反應(yīng)產(chǎn)物的時期；和 d) 檢測所述免疫反應(yīng)產(chǎn)物中的任一種的存在和/或濃度。
11. 權(quán)利要求10的方法，其中用兩種TpN17抗原作為將要在所述分離的樣品中檢測的 抗體的特異性結(jié)合配偶體： 包含TpN17序列和第一分子伴侶的第一 TpN17抗原，其中第一 TpN17抗原可以與固相 結(jié)合； 包含TpN17序列和第二分子伴侶的第二TpN17抗原，其中第二TpN17抗原攜帶可檢測 標(biāo)記； 其中兩種TpN17抗原相同或在免疫學(xué)上交叉反應(yīng)，使得存在于所述樣品中的抗體可以 特異性結(jié)合它們；且 其中第一和第二分子伴侶不同。
12. 權(quán)利要求11的方法，其中第一 TpN17抗原包含大腸桿菌FkpA作為分子伴侶，第二 TpN17抗原包含大腸桿菌Skp作為分子伴侶。
【文檔編號】G01N33/536GK104297477SQ201410344742
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年7月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月18日
【發(fā)明者】E·法特茲, P·沙爾施密特, U·施密特, C·舒爾茨 申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司
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