作為抗結(jié)核病藥的吡啶并嘧啶化合物的制作方法
【專利摘要】一種作為抗結(jié)核病藥的吡啶并嘧啶化合物。本發(fā)明涉及小分子化合物及其在治療細(xì)菌感染、特別是肺結(jié)核中的應(yīng)用。
【專利說(shuō)明】作為抗結(jié)核病藥的吡啶并嘧啶化合物
[0001]本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2009年6月17日、申請(qǐng)?zhí)枮?00980128440.2、發(fā)明名稱為“作為抗結(jié)核病藥的吡啶并嘧啶化合物”的發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
[0002]本發(fā)明涉及小分子化合物及其在治療細(xì)菌感染、特別是肺結(jié)核中的應(yīng)用。
[0003]發(fā)明背景
[0004]肺結(jié)核(TB)作為疾病每年持續(xù)導(dǎo)致數(shù)以百萬(wàn)計(jì)的死亡?；煹牟怀浞謶?yīng)用已經(jīng)導(dǎo)致抗藥性病例的數(shù)量逐步增加。這種情況可能惡化對(duì)所有目前已知藥物的極端耐藥性株的出現(xiàn)(Van Rie和Enarson，2006)。國(guó)際上推薦的TB控制策略、也稱作直接觀察到的短程化療(DOTS)依賴于5種抗菌藥的組合服用超過(guò)6個(gè)月的延長(zhǎng)期限(http://www.wh0.1nt/tb/dots/en/)。由于使用了數(shù)學(xué)模型、考慮到了治療期限和TB動(dòng)力學(xué)，所以預(yù)測(cè)減少治療期限的有益性是顯著的并且能夠極大地促進(jìn)總體TB負(fù)擔(dān)下降(Salomon等人，2006)。
[0005]目前化療由通過(guò)中和一般信息途徑和關(guān)鍵過(guò)程(例如RNA聚合和蛋白質(zhì)合成抑制)或通過(guò)干擾分枝桿菌特異性細(xì)胞包膜合成直接祀向結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)桿狀菌的化合物組成。最廣泛使用的專用抗結(jié)核藥異煙肼、乙硫異煙胺和吡嗪酰胺是第一種需要活化的前體藥物。當(dāng)活性成分形成時(shí)，它們顯示對(duì)尚未完全得到表征的廣泛分枝桿菌靶標(biāo)的抑制活性。就其他慢性感染性疾病(如人免疫缺陷病毒)而言，迄今為止經(jīng)證實(shí)多-療法手段(包括靶向結(jié)核分枝桿菌廣泛關(guān)鍵特征的藥物)是最成功的策略。因此，可能的情況是具有對(duì)結(jié)核分枝桿菌不同作用機(jī)制的目前藥物抑制劑的組合會(huì)解決控制疾病的問(wèn)題。
[0006]用于研發(fā)新抗-TB藥的最具有挑戰(zhàn)性的手段依賴于篩選靶向桿狀菌存活必需的關(guān)鍵特征的活性化合物。盡管仍然缺乏對(duì)在人體中結(jié)核桿菌持久性后面的生物學(xué)機(jī)制即潛在菌的位置和狀態(tài)的理解，但是認(rèn)為結(jié)核分枝桿菌居留于低氧條件下的初期肉芽腫中(Lenaerts等人,2007)并且隱藏于各種類型的細(xì)胞內(nèi)(Houben等人,2006 ;Neyrolles等人，2006)。桿狀菌主要位于吞噬細(xì)胞例如巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞內(nèi)部，并且顯然已經(jīng)確立與胞外條件中的生長(zhǎng)相比，結(jié)核桿菌采取了宿主巨噬細(xì)胞吞噬體內(nèi)的不同表型(Rohde等人，2007 ;Schnappinger等人,2003)。在感染時(shí),誘導(dǎo)炎癥應(yīng)答，由此開始募集釋放白細(xì)胞介素和細(xì)胞因子的T淋巴細(xì)胞，由此活化感染的巨噬細(xì)胞以便能夠破壞病原體。在適合的觸發(fā)后，宿主巨噬細(xì)胞由此能夠消除侵入的桿狀菌。這一結(jié)果進(jìn)一步得到如下事實(shí)的支持:吸入結(jié)核分枝桿菌的人有95%以上不發(fā)病，從而啟示在大部分病例中人體宿主應(yīng)答足以阻止結(jié)核分枝桿菌誘導(dǎo)的發(fā)病機(jī)制。這產(chǎn)生如下推定:小分子化合物可以模擬免疫細(xì)胞應(yīng)答信號(hào)并且誘導(dǎo)宿主細(xì)胞清除分枝桿菌。
[0007]因此，本發(fā)明的一個(gè)目的在于研發(fā)適合于高流通量篩選的基于表型細(xì)胞的測(cè)定法，所述高流通量篩選能夠搜索到可以預(yù)防結(jié)核分枝桿菌在宿主巨噬細(xì)胞內(nèi)部繁殖的化合物。
[0008]迄今為止，這種類型的結(jié)核桿菌在宿主細(xì)胞內(nèi)的生長(zhǎng)研究依賴于宿主細(xì)胞裂解后的菌落形成單位(CFUs)測(cè)定、然后是系列稀釋和細(xì)菌在瓊脂板上生長(zhǎng)所需的3-周溫育期限。已經(jīng)證實(shí)表達(dá)熒光素酶的分枝桿菌有效減少實(shí)驗(yàn)期限，不過(guò)，仍然需要細(xì)胞裂解和熒光素底物添加步驟(Arain等人，1996)。此外，這些類型的實(shí)驗(yàn)不易于進(jìn)行大規(guī)模篩選。
[0009]本發(fā)明的另一個(gè)目的在于鑒定對(duì)細(xì)菌感染有效的化合物，特別是可以預(yù)防結(jié)核分枝桿菌在宿主巨噬細(xì)胞內(nèi)繁殖的化合物。
[0010]本發(fā)明的描述
[0011]本發(fā)明在一個(gè)方面中涉及具有通式VIII的化合物:
[0012]
【權(quán)利要求】
1.篩選方法，其包括下列步驟: (a)用經(jīng)熒光標(biāo)記的結(jié)核分枝桿菌分批感染宿主細(xì)胞； (b)除去游離的未結(jié)合的分枝桿菌； (c)將待測(cè)試的化合物添加到多孔板上； (d)將感染了經(jīng)熒光標(biāo)記的結(jié)核分枝桿菌的所述宿主細(xì)胞接種入包含所述化合物的所述多孔板； (e)溫育包含感染了經(jīng)熒光標(biāo)記的結(jié)核分枝桿菌的宿主細(xì)胞和所述化合物的所述多孔板； (f)熒光標(biāo)記所述宿主細(xì)胞； (g)使用自動(dòng)化共焦顯微鏡檢查分析所述多孔板。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述篩選方法尋找干擾在所述宿主細(xì)胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌繁殖的化合物。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述宿主細(xì)胞為巨噬細(xì)胞，優(yōu)選地活巨噬細(xì)胞。
4.權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的方法，其中所述自動(dòng)化共焦熒光顯微鏡檢查測(cè)量胞內(nèi)分枝桿菌生長(zhǎng)。
5.權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的方法，其中步驟(g)包括，對(duì)于每一種化合物，測(cè)量: -總宿主細(xì)胞數(shù)目，例如總巨噬細(xì)胞數(shù)目； -被感染的宿主細(xì)胞的百分比；和/或 -感染抑制百分比。
6.權(quán)利要求5的方法，其中: (i)低的(總)細(xì)胞數(shù)目表明了所述化合物的毒性和/或在巨噬細(xì)胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌的不受限制的生長(zhǎng)； (?)高的(總)細(xì)胞數(shù)目表明了所述化合物是非毒性的并且阻止分枝桿菌生長(zhǎng)。
7.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其包括使用選自下列中的至少一個(gè)的對(duì)照: -替代步驟(C)中的化合物，添加具有已知的抗結(jié)核病活性的化合物(作為陽(yáng)性對(duì)照)，例如異煙肼、利福平、乙硫異煙胺或莫西沙星； -替代步驟(c)中的化合物，添加DMSO或抗生素對(duì)照(作為陰性對(duì)照)。
8.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述結(jié)核分枝桿菌用GFP進(jìn)行標(biāo)記。
9.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述宿主細(xì)胞用SYT060進(jìn)行標(biāo)記。
10.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中在步驟(b)之后，用抗生素，優(yōu)選地阿米卡星進(jìn)行溫育。
11.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其用于大規(guī)?；瘜W(xué)品庫(kù)的高流通量篩選(HTS)。
12.在權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)的方法之中鑒定出的化合物，其干擾在宿主細(xì)胞內(nèi)，優(yōu)選地在宿主巨噬細(xì)胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌的繁殖。
13.權(quán)利要求12的化合物，其由下式所示:
N—Nο
【文檔編號(hào)】G01N21/64GK103983627SQ201410219962
【公開日】2014年8月13日 申請(qǐng)日期:2009年6月17日 優(yōu)先權(quán)日:2008年6月17日
【發(fā)明者】P·布羅丹, T·克里斯托夫, 盧載成, 金在昇, A·熱諾韋西奧, D·P·C·費(fèi)尼斯坦, 全希暻, F·A·埃旺, 姜善姬, 李世淵, 徐旼廷, 樸垠錚, M·孔特雷拉斯多明格斯, 南芝娟, 金恩惠 申請(qǐng)人:韓國(guó)巴斯德研究所, 國(guó)家健康與醫(yī)學(xué)研究院
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