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比色法測(cè)定血清中脂肪酶含量的檢測(cè)試劑盒的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供了一種比色法測(cè)定血清中脂肪酶含量的檢測(cè)試劑盒，由試劑R1和試劑R2組成，所述試劑R1含有1～200mmol/L?pH＝7.6～9.0的緩沖液、1～20mmol/L脫氧膽酸鹽、1～10mg/L共脂肪酶和0.5～2g/L防腐劑；所述試劑R2含有1～200mmol/L?pH＝4.0～6.0的緩沖液、1～20mmol/L脂肪酶底物、0.2～10mmol/L膽酸鹽、1～10ml/L二甲亞砜和防腐劑。本發(fā)明的試劑盒底物為脂肪酶的人工合成底物，穩(wěn)定性佳，有較大的臨床應(yīng)用價(jià)值；通過(guò)該試劑盒來(lái)檢測(cè)血清中的LPS含量，可達(dá)到操作簡(jiǎn)便、穩(wěn)定性佳、特異性好，快速、測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠的目的。
【專(zhuān)利說(shuō)明】比色法測(cè)定血清中脂肪酶含量的檢測(cè)試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明具體涉及一種比色法測(cè)定血清中的脂肪酶(LPS)含量的檢測(cè)試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002]脂肪酶(甘油三酯?；饷?是一種糖蛋白，含有420?449個(gè)氨基酸殘基，其特異的底物是含長(zhǎng)鏈脂肪酸的甘油三酯。血清脂肪酶主要從胰腺細(xì)咆分泌而來(lái)，胰腺中脂肪酶濃度比肝、十二指腸及小腸中高10倍，比血清中高20000倍，十二指腸與血清間差500-800倍，正常胰腺中脂肪酶活性相當(dāng)于淀粉酶活性的4.5倍。目前由于選擇用于診斷胰腺炎的脂肪酶測(cè)定閾值較低，所有脂肪酶的測(cè)定方法臨床靈敏度都很高，而診斷的特異性變化卻很大。在胰腺炎診斷中脂肪酶測(cè)定的特異性?xún)?yōu)于淀粉酶。
[0003]脂肪酶測(cè)定是1932年Cherry和CrandalI首先提出的。之后對(duì)測(cè)定時(shí)間、特異性、重復(fù)性和靈敏度進(jìn)行了大量改進(jìn)。通過(guò)改進(jìn)底物及加入膽酸鹽和共脂肪酶可使血清中非特異性的脂解反應(yīng)降至最低。比如，用含長(zhǎng)鏈脂肪酸的甘油三酯作為底物可增加反應(yīng)的特異性，減少非特異性酯酶的反應(yīng)。膽酸鹽可使胰腺脂肪酶固定于底物乳狀液的油水界面上，但過(guò)量的膽酸鹽可抑制脂肪酶活性，此抑制過(guò)程可被共脂肪酶特異性地逆轉(zhuǎn)。由于患胰腺炎病人常缺乏共脂肪酶或其活力低于正常值，因此在過(guò)量膽酸鹽存在時(shí)測(cè)定脂肪酶而額外加入共脂肪酶是很重要的，這樣可提高胰腺脂肪酶的特異性。脂肪酶在臨床的意義:正常人血液LPS含量極少，但在急性胰腺炎時(shí)，2?12h血液LPS顯著升高，24h至峰值，可達(dá)正常值上限的10倍，甚至50倍，至48?72h可能恢復(fù)正常但隨后又可持續(xù)升高8?15天。由于血液LPS在急性胰腺炎時(shí)活性升高的時(shí)間早，上升的幅度的大，持續(xù)的時(shí)間長(zhǎng)，故其診斷價(jià)值優(yōu)于淀粉酶。臨床觀察發(fā)現(xiàn)，凡血液AMY升高的病例，其LPS均升高；而LPS升高者AMY不一定升高，約有2/3AMY正常的胰腺炎病人，其LPS正常；非胰腺炎的急腹癥有血液AMY升高而LPS不升高。酗酒、乙醇性胰腺炎、慢性胰腺炎、胰腺癌、肝膽疾患等血液LPS可有不同程度的升高。
[0004]目前測(cè)定脂肪酶的方法有比濁法、pH-Stat法、免疫測(cè)定法和酶偶聯(lián)顯色比色法。比濁法是基于三油酸甘油酯轉(zhuǎn)變?yōu)楦视投r(shí)甘油三酯乳濁液濁度在340或365nm處降低。該方法有某些缺陷，主要與一些樣品早期反應(yīng)階段的非線(xiàn)性及其線(xiàn)性范圍有關(guān)。早期反應(yīng)階段吸收率的增加常與患者的類(lèi)風(fēng)濕因子有關(guān)，甘油三酯濃度> 5.5g/L干擾測(cè)定，血紅蛋白濃度> 2g/L引起酶活性降低。pH-Stat法是基于脂肪酶水解釋放脂肪酸導(dǎo)致反應(yīng)液PH降低，采用一支pH電極或一種指示劑如酚酞，進(jìn)行連續(xù)滴定檢測(cè)。該方法與免疫化學(xué)法相關(guān)性很好，但因其費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、難于自動(dòng)化及需要特殊的儀器，而在一個(gè)時(shí)期未被廣泛采用。免疫測(cè)定法是將脂肪酶特異性抗體固定于試管壁上，使其與脂肪酶結(jié)合，連著過(guò)氧化物酶及分離的脂肪酶抗原的二抗結(jié)合于脂肪酶上，形成一個(gè)夾心“三明治”，用一種色素原溶液鏡頭培養(yǎng)，在492nm下測(cè)定吸光度的增加率。該法靈敏度高，故較適宜測(cè)定胰腺機(jī)能不全患者的脂肪酶，但該法較費(fèi)時(shí)，故不適用于急性胰腺炎的檢測(cè)。酶偶聯(lián)顯色比色法，多用1，
2-甘油二酯為底物，在LPS和單酸甘油酯脂肪酶的催化下，水解生成甘油和脂肪酸，甘油通過(guò)甘油激酶作用生成3-磷酸甘油，再通過(guò)甘油磷酸氧化酶/過(guò)氧化物酶體系和4-AAP色素原體系產(chǎn)生紫紅色。于550nm波長(zhǎng)連續(xù)監(jiān)測(cè)吸光度的變化即可計(jì)算LPS活性。此類(lèi)方法特異性高，通過(guò)雙試劑也基本可解決內(nèi)源性甘油的干擾問(wèn)題。但是酶偶聯(lián)顯色法，工具酶的價(jià)格昂貴，而且酶來(lái)源少且不穩(wěn)定。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有試劑盒存在的缺陷，提供一種比色法測(cè)定血清中的脂肪酶(LPS)含量的檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明通過(guò)該比色法測(cè)試試劑盒來(lái)檢測(cè)血清中的LPS含量，以達(dá)到操作簡(jiǎn)便、穩(wěn)定性佳、特異性好，快速、測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠的目的。
[0006]本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的:
[0007]本發(fā)明涉及一種比色法測(cè)定血清中的脂肪酶含量的檢測(cè)試劑盒，由試劑Rl和試劑R2組成，所述試劑Rl含有I?200mmol/L pH = 7.6?9.0的緩沖液、I?20mmol/L脫氧膽酸鹽、I?10mg/L共脂肪酶和0.5?2g/L防腐劑；所述試劑R2含有I?200mmol/LpH = 4.0?6.0的緩沖液、I?20mmol/L脂肪酶底物、0.2?10mmol/L膽酸鹽、I?1ml/L 二甲亞砜和0.5?2g/L防腐劑。
[0008]上述試劑Rl中的脫氧膽酸鹽可使胰腺脂肪酶固定于底物乳狀液的油水界面上；共脂肪酶可特異性地逆轉(zhuǎn)由于脫氧膽酸鹽過(guò)量所引起的脂肪酶活性被抑制的過(guò)程。試劑R2中一定濃度(I?10ml/L)的二甲亞砜對(duì)共脂肪酶有激活作用。
[0009]優(yōu)選的，所述試劑Rl含有50?150mmol/L pH = 7.0?8.0的緩沖液、I?1mmoI/L脫氧膽酸鹽、I?5mg/L共脂肪酶和0.5?1.0g/L防腐劑；所述試劑R2含有50?150mmol/L pH = 4.0?5.0的緩沖液、10?20mmol/L脂肪酶底物、0.2?5mmol/L膽酸鹽、3?8ml/L 二甲亞諷和0.5?lg/L防腐劑。
[0010]優(yōu)選的，所述脂肪酶底物為1，2-鄰二月桂基-消旋-甘油-3-戊二酸-(6-甲基試鹵靈)酯。該脂肪酶底物為人工合成，穩(wěn)定性好。
[0011]優(yōu)選的，所述試劑Rl、R2中包含的緩沖液分別選自三羥甲基氨基甲烷(TRIS)J磺酸(MOPS)、4_羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、酒石酸、2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)、三乙醇胺(TEA)和檸檬酸鈉中的一種或幾種。
[0012]優(yōu)選的，所述試劑R1、R2中包含的防腐劑分別選自疊氮化鈉、Proclin300、聚賴(lài)氨酸、山梨酸鉀和乙酸鈉中的一種或幾種。
[0013]本發(fā)明還涉及一種上述的檢測(cè)試劑盒的使用方法，試劑Rl加入樣本后37°C孵育3分鐘，再加入試劑R2，37°C孵育I分鐘，連續(xù)監(jiān)測(cè)3分鐘的吸光度變化率，與LPS標(biāo)準(zhǔn)品的脂肪酶含量與吸光度關(guān)系曲線(xiàn)進(jìn)行比較，得到樣本的脂肪酶含量。
[0014]優(yōu)選的，所述試劑Rl和試劑R2的體積比為2:1或4:1。
[0015]本發(fā)明試劑盒的檢測(cè)原理為:以1，2_鄰二月桂基-消旋-甘油-3-戊二酸-(6-甲基試鹵靈)酯為底物，在堿性環(huán)境并有膽酸和共脂肪酶參與下被脂肪酶水解，生成1，2_鄰二月桂基-消旋-甘油和一個(gè)不穩(wěn)定的中間體戊二酸-?-甲基試鹵靈)酯；該中間體在堿性條件下，繼續(xù)水解，產(chǎn)生戊二酸和甲基試齒靈。甲基試齒靈顯示紅色，顯色強(qiáng)度和脂肪酶活力成正比。
[0016]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果:
[0017]1、R1試劑中加入了脫氧膽酸鹽和共脂肪酶，可使血清中非特異性的脂解反應(yīng)降至最低，脫氧膽酸鹽可使胰腺脂肪酶固定于底物乳狀液的油水界面上，但過(guò)量的膽酸鹽可抑制脂肪酶活性，而共脂肪酶可特異性地逆轉(zhuǎn)該抑制過(guò)程。
[0018]2、現(xiàn)在市售LPS試劑所使用的樣本和試劑Rl、R2的比例多數(shù)為2: 200: 100，而本發(fā)明試劑除了能用以上參數(shù)進(jìn)行檢測(cè)，還可以用4: 200: 50的參數(shù)來(lái)進(jìn)行檢測(cè)；而且對(duì)于本發(fā)明的試劑而言，這兩種方法的檢測(cè)結(jié)果類(lèi)似，這樣有效節(jié)省了試劑，從而降低成本。
[0019]3、R2試劑中的脂肪酶底物為人工合成，性質(zhì)穩(wěn)定，有利于提高試劑37°C穩(wěn)定性以及效期穩(wěn)定性；且R2試劑中的二甲亞砜可激活共脂肪酶活性。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0020]通過(guò)閱讀參照以下附圖對(duì)非限制性實(shí)施例所作的詳細(xì)描述，本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點(diǎn)將會(huì)變得更明顯:
[0021]圖1為L(zhǎng)PS參考標(biāo)準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，其中X軸表示LPS的含量，Y軸表示吸光度。
[0022]圖2為分別采用本發(fā)明試劑和美國(guó)貝克曼公司的LPS試劑，采用日立全自動(dòng)生化分析儀對(duì)50份人血清(包含正常和異常標(biāo)本)按各自參數(shù)同時(shí)進(jìn)行測(cè)定，對(duì)測(cè)定值進(jìn)行相關(guān)分析的示意圖；其中，X軸表示的是本發(fā)明試劑測(cè)定的病人血清結(jié)果，Y軸表示的是美國(guó)貝克曼公司試劑測(cè)定的病人血清結(jié)果，相關(guān)系數(shù)R2 = 0.9921，回歸方程為y =
1.0244X+1.5184。

【具體實(shí)施方式】
[0023]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。以下實(shí)施例將有助于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)。這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。以下實(shí)施例中的原料均為現(xiàn)有常用原料，可以直接通過(guò)商家購(gòu)買(mǎi)獲得。本發(fā)明以下實(shí)施例中沒(méi)有特別說(shuō)明的操作，均可以采用現(xiàn)有常規(guī)技術(shù)手段。
[0024]實(shí)施例1
[0025]測(cè)定試劑盒組成如下:
[0026]1.試劑 Rl 為:
[0027]

pH8.0 TRIS 緩沖液 50 mmol/L

脫氧膽酸鹽2 mmol/L
共脂肪酶2mg/L
聚賴(lài)氨酸lg/L
[0028]2.試劑 R2 為:
[0029]

【權(quán)利要求】
1.一種比色法測(cè)定血清中的脂肪酶含量的檢測(cè)試劑盒，由試劑Rl和試劑R2組成，其特征在于，所述試劑Rl含有I?200mmol/L pH = 7.0?9.0的緩沖液、I?20mmol/L脫氧膽酸鹽、I?10mg/L共脂肪酶和0.5?2g/L防腐劑；所述試劑R2含有I?200mmol/L pH =4.0?6.0的緩沖液、I?20mmol/L脂肪酶底物、0.2?10mmol/L膽酸鹽、I?10ml/L 二甲亞砜和0.5?2g/L防腐劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述試劑Rl含有50?150mmol/L pH = 7.0?8.0的緩沖液、I?10mmol/L脫氧膽酸鹽、I?5mg/L共脂肪酶和0.5?Ig/L防腐劑；所述試劑R2含有50?150mmol/L pH = 4.0?5.0的緩沖液、10?20mmol/L脂肪酶底物、0.2?5mmol/L膽酸鹽、3?8ml/L 二甲亞砜和0.5?lg/L防腐劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述脂肪酶底物為1，2_鄰二月桂基-消旋-甘油-3-戊二酸-(6-甲基試鹵靈)酯。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述試劑Rl、R2中包含的緩沖液分別選自TRIS、M0PS、HEPES、酒石酸、MES、TEA和檸檬酸鈉中的一種或幾種。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述試劑Rl、R2中包含的防腐劑分別選自疊氮化鈉、Proclin300、聚賴(lài)氨酸、山梨酸鉀和乙酸鈉中的一種或幾種。
6.一種根據(jù)權(quán)利要求1?5中任一項(xiàng)所述的檢測(cè)試劑盒的使用方法，其特征在于，試劑Rl加入樣本后37°C孵育3分鐘，再加入試劑R2，37°C孵育I分鐘，連續(xù)監(jiān)測(cè)3分鐘的吸光度變化率，與LPS標(biāo)準(zhǔn)品的脂肪酶含量與吸光度關(guān)系曲線(xiàn)進(jìn)行比較，得到樣本的脂肪酶含量。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測(cè)試劑盒的使用方法，其特征在于，所述試劑Rl和試劑R2的體積比為2:1或4:1。
【文檔編號(hào)】G01N21/78GK104198474SQ201410401510
【公開(kāi)日】2014年12月10日 申請(qǐng)日期:2014年8月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月14日
【發(fā)明者】李偉奇, 陳瑛, 房君江, 張秀文, 林清玉 申請(qǐng)人:上海睿康生物科技有限公司