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焦糖色中副產(chǎn)物4-甲基咪唑和2-乙?；?4-羥基-丁基咪唑的檢測(cè)方法
【專(zhuān)利摘要】一種焦糖色中副產(chǎn)物4-甲基咪唑和2-乙?；?4-羥基-丁基咪唑的檢測(cè)方法，該方法包括如下步驟：(1)待測(cè)樣品溶液的制備；(2)樣品檢測(cè)；和(3)結(jié)果分析。該方法具有快速檢測(cè)，高靈敏度、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】焦糖色中副產(chǎn)物4-甲基咪唑和2-乙酰基-4-羥基-丁基 咪唑的檢測(cè)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種焦糖色中副產(chǎn)物4-甲基咪唑和2-乙?；?4-羥基-丁基咪唑的 檢測(cè)方法，屬于食品安全檢測(cè)的檢驗(yàn)方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 4-甲基咪唑（4-Methylimidazole，4-MEI)是III和IV類(lèi)焦糖色生產(chǎn)加工過(guò)程中 美拉德反應(yīng)（Maillard browning model systems)產(chǎn)生的一種副產(chǎn)物，有研究顯示，其能夠 誘發(fā)腫瘤。歐洲食品安全局（EFSA)報(bào)道稱(chēng)，III類(lèi)焦糖色在生產(chǎn)加工過(guò)程中還會(huì)產(chǎn)生2-乙 ?；?4-輕基-丁基咪唾（2-acetyl-4-tetrahydroxy-butylimidazole，THI)，該物質(zhì)具有 免疫毒性。
[0003]目前，對(duì)焦糖色素中4-MEI含量的測(cè)定，我國(guó)唯有食品添加劑焦糖色國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) GBS817-2〇01，焦糖色素中THI的測(cè)定沒(méi)有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。國(guó)際上，世界糧農(nóng)組織/WT0食品添加 劑聯(lián)合專(zhuān)家委員會(huì)（JECFA)焦糖色質(zhì)量規(guī)格JECFA_ 2〇ll中4-MEI和THI分別采用氣相色 譜和液相色譜的衍生化方法分別檢測(cè)。根據(jù)文獻(xiàn)檢索，現(xiàn)有的焦糖色素中副產(chǎn)物4-MEI和 THI的測(cè)定方法大約有以下幾種：薄層色譜法、氣相色譜法、液相色譜法、離子色譜法、毛細(xì) 管電泳法、氣-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)、液-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)。其中前幾種技術(shù)大都需要較復(fù)雜的前處理技 術(shù)，這對(duì)于大量的樣品分析是十分不利的。液相色譜法紫外檢測(cè)器可同時(shí)檢測(cè)兩種物質(zhì)，由 于靈敏度的限制，如此復(fù)雜的樣品基質(zhì)相對(duì)較大的取樣量對(duì)前處理技術(shù)的要求非常高。因 此，當(dāng)前迫切需要建立能夠快速準(zhǔn)確測(cè)定焦糖色中副產(chǎn)物4-MEI和THI的檢測(cè)方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 1·本發(fā)明的目的在于提供一種焦糖色中副產(chǎn)物4-MEI和THI同時(shí)檢測(cè)的方法，該 方法包括如下步驟：（1)待測(cè)樣品溶液的制備；（2)樣品檢測(cè)；和（3)結(jié)果分析。
[0005] (1)待測(cè)樣品溶液的制備包括如下具體步驟：
[0006] (a)制備固相萃取上樣溶液：稱(chēng)取焦糖色素樣品lg(準(zhǔn)確至〇· 001g)，置于100mL 容量瓶中，加水定容至刻度。取0. lmL上述樣品溶液，加入0. lmL鹽酸溶液（0.02m〇L/L)，力口 入 0.2mL 內(nèi)標(biāo)溶液 D6-4-甲基咪唑（D6-4_Methylimidazole, D6-4-MEI,l_0yg/mL)，加水 定容至2mL，混勻后待同相萃取凈化。
[0007] (b)固相萃取柱活化：選擇混合型陽(yáng)離子交換固相萃取柱，基質(zhì)為聚苯乙烯-二乙 烯基苯高聚物，60mg、3mL，使用前依次用2mL甲醇、2mL水活化。
[0008] (c)固相萃?。簩ⅲ╝)制備好的樣品溶液加入（b)中剛活化好的小柱中，控制流速 小于0· 5mL/min,抽干，加入lmL水和lmL甲醇淋洗，控制流速小于1. OmL/min,抽干，用洗脫 液（氨水+甲醇=5+95(v/v))2mL洗脫收集，控制流速小于0· 5mL/min，抽干。將收集液在 低于50°C條件下，氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)茅? 5mL溶液（氨水+乙腈+水=0· 05+5+94. 95(v/v)) 定容，渦旋混合lmin，過(guò)0. 22 μ m水系微孔濾膜，即制得待測(cè)樣品溶液，內(nèi)標(biāo)法定量。
[0009] 本發(fā)明的實(shí)施方案中，步驟（a)中稱(chēng)量lg樣品定容到lOOmL水中，取ο. 1?〇. 2眺 樣品溶液準(zhǔn)備固相萃取，優(yōu)選〇· lmL，上樣溶液加水定容至2?3mL,優(yōu)選2mL。
[0010] 本發(fā)明的實(shí)施方案中，步驟（C)中1?2mL水和1?2mL甲醇淋洗，優(yōu)選imL水和 lmL甲醇淋洗，優(yōu)選2mL洗脫液洗脫。收集液可以在低于sot：條件下吹干或者旋轉(zhuǎn)濃縮揮 千，殘?jiān)尤攵ㄈ萑芤汉笮枰獪u旋lmin或者超聲波30秒溶解并過(guò)0· 22 μ m水系微孔濾膜。
[0011] ⑵樣品檢測(cè)包括如下具體步驟：
[0012] (a)標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備：分別準(zhǔn)確稱(chēng)取4-MEI、THI和D6-4-MEI標(biāo)準(zhǔn)品，用水溶解， 分別配成〇· 5mg/mL的儲(chǔ)備溶液，使用時(shí)，用水稀釋成標(biāo)準(zhǔn)使用溶液。
[0013] (b)用液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜（LC-MS/MS)儀，配有電噴霧離子源（ESI)測(cè)定待測(cè) 樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)品溶液。儀器參考條件如下：
[0014] 液相色譜條件
[0015] 色譜柱：P〇larisC18-A 柱（2. lmmX150mm，3ym)。
[0016]流動(dòng)相：A為0· 〇5%氨水溶液；b為乙腈。梯度洗脫條件見(jiàn)表丄
[0017] 柱溫：30 °C
[0018] 進(jìn)樣量：10 μ L
[0019] 流速：0· 4mL/min
[0020] 表1液相梯度洗脫條件
[0021]

【權(quán)利要求】
1. 一種焦糖色中副產(chǎn)物4-甲基咪唑和2-乙?；?4-羥基-丁基咪唑的檢測(cè)方法，該 方法包括如下步驟：（1)待測(cè)樣品溶液的制備；（2)樣品檢測(cè)；和（3)結(jié)果分析。其特征在 于，其中步驟（1)待測(cè)樣品溶液的制備包括如下具體步驟： (a) 制備固相萃取上樣溶液：稱(chēng)取焦糖色素樣品lg (準(zhǔn)確至0. OOlg),置于lOOmL容量 瓶中，加水定容至刻度。取〇. lmL上述樣品溶液，加入0. lmL鹽酸溶液（0.02m〇L/L)，加入 0. 2mL內(nèi)標(biāo)溶液（D6-4-MEI，1. 0 μ g/mL)，加水定容至2mL，混勻后待固相萃取凈化。 (b) 固相萃取柱活化：選擇混合型陽(yáng)離子交換固相萃取柱，基質(zhì)為聚苯乙烯-二乙烯基 苯高聚物，60mg、3mL。使用前依次用2mL甲醇、2mL水活化。 (c) 固相萃?。簩ⅲ╝)制備好的樣品溶液加入（b)中剛活化好的小柱中，控制流速小 于0. 5mL/min，抽干，加入lmL水和lmL甲醇淋洗，控制流速小于1. OmL/min，抽干，用洗脫液 (氨水+甲醇=5+95(v/v))2mL洗脫收集，控制流速小于0. 5mL/min，抽干。將收集液在低 于50°C條件下，氮?dú)獯蹈桑瑲堅(jiān)?.5mL溶液（氨水+乙腈+水=0.05+5+94.5(v/v))定 容，渦旋混合lmin，過(guò)0. 22 μ m水系微孔濾膜，即制得待測(cè)樣品溶液，內(nèi)標(biāo)法定量。 步驟（2)樣品檢測(cè)包括如下具體步驟： (a) 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備：分別準(zhǔn)確稱(chēng)取4-甲基咪唑（4-Methylimidazole，4_MEI)、 2_ 乙醜基 _4_ 輕基-丁 基咪唑（2-acetyl-4_tetrahydroxy-butylimidazole，THI)和 D6-4-甲基咪唑（D6-4-Methylimidazole，D6-4_MEI)標(biāo)準(zhǔn)品，用水溶解，分別配成 0. 5mg/mL 的儲(chǔ)備溶液，使用時(shí)，用水稀釋成標(biāo)準(zhǔn)使用溶液。 (b) 用液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜（LC-MS/MS)儀，配有電噴霧離子源（ESI)測(cè)定待測(cè)樣品 溶液和標(biāo)準(zhǔn)品溶液。儀器參考條件如下： 液相色譜條件 色譜柱：P〇laris C18-A 柱（2. ImmX 150mm，3 μ m)。 流動(dòng)相：A為0. 05%氨水溶液；B為乙腈。梯度洗脫條件見(jiàn)表1 柱溫：30°C 進(jìn)樣量：10 μ L 流速：〇· 4mL/min 表1液相梯度洗脫條件
質(zhì)譜檢測(cè)器條件： 電離方式：H-ESI電離，正離子 離子噴霧電壓：正離子4000v 揮發(fā)氣溫度：400°C 毛細(xì)管溫度：270°C 銷(xiāo)氣：60Arb 輔助氣：15Arb 碰撞氣：氦氣 掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM)，各離子參數(shù)詳見(jiàn)表2 表2多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM)
測(cè)定定量子離子峰面積，D6-4-MEI為內(nèi)標(biāo)，然后分別作4-ΜΕΙ0?Ι)與內(nèi)標(biāo)的峰面積 比-4-ΜΕΙ0?Ι)濃度（ng/mL)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，曲線(xiàn)方程見(jiàn)式（1): y = ax+b ......... (1) 式中：x--4-MEI或THI峰面積與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)D6-4-MEI峰面積的比值； y--4-MEI或THI的濃度，單位為鈉克每毫升（ng/mL)。 步驟（3)結(jié)果分析包括如下具體步驟： (a) 試樣溶液的測(cè)定：待測(cè)試樣溶液中4-MEI或THI的響應(yīng)值應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)線(xiàn)性范圍 內(nèi)，超過(guò)線(xiàn)性范圍則應(yīng)稀釋后再進(jìn)樣分析。 (b) 定性判定：按照上述條件測(cè)定試樣和標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，如果試樣中的質(zhì)量色譜峰保 留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)工作溶液一致（變化范圍在±2. 5%之內(nèi)）；樣品中目標(biāo)化合物的兩個(gè)子離子 的相對(duì)豐度與濃度相當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)溶液的相對(duì)豐度一致，相對(duì)豐度偏差不超過(guò)表3的規(guī)定，則可 判斷樣品中存在目標(biāo)化合物4-MEI或THI。 表3定性離子相對(duì)豐度的最大允許偏差
(c) 分析結(jié)果的表述： 試樣中4-ΜΕΙ0?Ι)含量按公式（2)計(jì)算：
X--試樣中4-MEI或THI的含量，單位為克每千克（mg/kg); C--由標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)查得試樣進(jìn)樣液中4-MEI或THI的濃度，單位為鈉克每毫升（ng/ mL)； C〇--由標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)查得空白試樣進(jìn)樣液中4-MEI或THI的濃度，單位為鈉克每毫升 (ng/mL)； V--試樣制備液總體積，單位為毫升（mL); m--試樣質(zhì)量，單位為克（g); 結(jié)果保留三位有效數(shù)字。
2. 權(quán)利要求1中一種焦糖色中副產(chǎn)物4-甲基咪唑和2-乙酰基-4-羥基-丁基咪唑的 檢測(cè)方法，其特征在于，lg樣品溶于l〇〇mL水，取0. lmL樣品溶液，加入0. 02moL/L鹽酸溶液 0. lmL，加入內(nèi)標(biāo)，加水定容至2mL，混勻后待固相萃取凈化。
3. 權(quán)利要求1中所述選擇混合型陽(yáng)離子交換固相萃取柱進(jìn)行凈化，使用前依次用2mL 甲醇、2mL水活化。
4. 權(quán)利要求1中固相萃取過(guò)程中樣品溶液加入剛活化好的小柱中，特征性在于控制上 樣流速小于〇. 5mL/min，抽干，加入lmL水和lmL甲醇淋洗，控制流速小于1. OmL/min，抽干， 用洗脫液比例為氨水+甲醇=5+95(v/v)2mL洗脫收集，控制流速小于0. 5mL/min，抽干。
5. 權(quán)利要求1中樣品檢測(cè)過(guò)程特征性在于使用Polaris C18-A柱檢測(cè)，流動(dòng)相：A為 0.05 %氨水溶液；B為乙腈。
【文檔編號(hào)】G01N30/06GK104297399SQ201410213812
【公開(kāi)日】2015年1月21日 申請(qǐng)日期:2014年5月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月21日
【發(fā)明者】榮維廣, 馬永建, 吉文亮, 劉華良 申請(qǐng)人:江蘇省疾病預(yù)防控制中心