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一種蛋白質(zhì)傳感膜及其制備方法和用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種蛋白質(zhì)傳感膜及其制備方法和用途，所述蛋白質(zhì)傳感膜由三層結(jié)構(gòu)組成：底層是基片，中間層是納米銀粒子層，上層是無熒光基團(tuán)的聚合物薄膜；蛋白質(zhì)傳感膜的制備方法如下：利用巰基硅烷偶聯(lián)劑使基片硅烷化；將硅烷化的基片置于納米銀溶膠中浸泡，形成納米銀基底；將無熒光基團(tuán)的聚合物溶解后旋涂在納米銀粒子層表面形成聚合物層，即得到基于自組裝納米銀粒子的蛋白質(zhì)傳感膜，對某些具有熒光特性的蛋白質(zhì)等物質(zhì)的檢測信號可增強(qiáng)到數(shù)倍，應(yīng)用于具有熒光特性蛋白質(zhì)的快速檢測；本發(fā)明所提供的制備方法簡單，易于實施，可操作性強(qiáng)。
【專利說明】一種蛋白質(zhì)傳感膜及其制備方法和用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種基于自組裝納米銀粒子的蛋白質(zhì)傳感膜及其制備方法和用途。
【背景技術(shù)】
[0002]傳感技術(shù)作為現(xiàn)代信息技術(shù)的三大支柱之一，在國家安全、科學(xué)試驗、環(huán)境監(jiān)測及醫(yī)療衛(wèi)生等方面發(fā)揮著重要作用。生物傳感技術(shù)是傳感技術(shù)的一個重要分支，它與生物信息學(xué)、仿生學(xué)、生物計算機(jī)等學(xué)科一起，處在生命科學(xué)和信息科學(xué)的交叉領(lǐng)域。生物傳感技術(shù)的研究重點是將生物活性材料與傳感器有機(jī)結(jié)合，成為新型分析儀器和檢測技術(shù)的重點發(fā)展領(lǐng)域。
[0003]傳統(tǒng)的生物傳感技術(shù)通常需要標(biāo)記、靈敏度低、過程繁瑣、效率低，其中大部分的工作量用于標(biāo)記，使用放射性同位素、熒光基團(tuán)做標(biāo)示物，安全性和穩(wěn)定性差，不能滿足快速、靈敏、低污染的需求，迫切需要新型的高靈敏度、高效、方便、經(jīng)濟(jì)的生化分子檢測方法和技術(shù)。因此，近年來橢圓偏振光、石英晶振微天平、表面等離子共振技術(shù)等無標(biāo)記傳感技術(shù)得到迅速發(fā)展。
[0004]金、銀等金屬納米粒子具有高度活躍的外層電子，當(dāng)光波輻射到粒徑遠(yuǎn)小于其激發(fā)波長的金屬納米粒子時，產(chǎn)生的表面等離子體波被限域在納米結(jié)構(gòu)的附近，當(dāng)入射光頻率與自由電子集體震蕩頻率相當(dāng)時則產(chǎn)生共振。當(dāng)金屬粒子與熒光體間距離在一定范圍內(nèi)時，金屬粒子會使熒光體的輻射衰減速率增加或發(fā)生共振能量轉(zhuǎn)移，使熒光體的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，大大提高了對目標(biāo)物檢測的靈敏度。以其方便快捷、靈敏度高等多項特點，深受研究人員的青睞。目前的研究大多將蛋白質(zhì)等熒光生物大分子直接附著在金屬粒子層表面，存在金屬粒子裸露于空氣中、且生物大分子與金屬粒子之間距離不可調(diào)等問題，導(dǎo)致許多技術(shù)問題還沒有解決，限制了其應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種蛋白質(zhì)傳感膜及其制備方法和用途。主要技術(shù)方案是在納米銀粒子層上覆蓋一層無熒光基團(tuán)的隔離層，通過納米銀的局域表面等離子體共振效應(yīng)，利用隔離層吸附蛋白質(zhì)，通過蛋白質(zhì)等熒光物質(zhì)的熒光光譜增強(qiáng)實現(xiàn)這些蛋白質(zhì)的快速、靈敏檢測。
[0006]本發(fā)明提供的一種蛋白質(zhì)傳感膜，其由三層結(jié)構(gòu)組成:底層是基片，中間層是納米銀粒子層，上層是無熒光基團(tuán)的聚合物薄膜，所述基片為玻璃片或石英片。
[0007]本發(fā)明還提供一種所述的蛋白質(zhì)傳感膜的制備方法，包括如下步驟:
(1)將納米銀前驅(qū)體、還原劑分別溶于蒸餾水，得到納米銀前驅(qū)體溶液和還原劑溶液；將納米銀前驅(qū)體溶液加熱煮沸一段時間，然后邊攪拌，邊向其中滴加入還原劑溶液，繼續(xù)加熱一段時間后停止加熱，冰水浴降至室溫，離心除去上層清液，得到納米銀溶膠；
(2)將偶聯(lián)劑溶于甲醇形成偶聯(lián)劑溶液，將干凈的基片通過等離子表面處理30min，然后常溫下置于偶聯(lián)劑溶液中浸泡一段時間，使基片表面硅烷化，自然風(fēng)干后得到硅烷化基片;
(3)將步驟(2)中得到的硅烷化基片浸泡在步驟(1)得到的納米銀溶膠中一段時間，然后取出，真空干燥后在硅烷化基片表面形成納米銀粒子層，得到納米銀基片；
(4)將無熒光基團(tuán)的聚合物溶解于有機(jī)溶劑得到旋涂液，進(jìn)而采用旋涂法在步驟(3)得到的納米銀基片上制備聚合物薄膜，自然風(fēng)干后即得到蛋白質(zhì)傳感膜。
[0008]步驟(1)中所述納米銀前驅(qū)體為硝酸銀、醋酸銀中的一種，前驅(qū)體溶液中，前驅(qū)體與蒸餾水的質(zhì)量比為0.1-0.5:500 ;前驅(qū)體溶液加熱煮沸溫度為120°C~140°C，加熱煮沸時間為0.5^1h ;所述還原劑為檸檬酸鈉，還原劑溶液中，還原劑與蒸餾水的質(zhì)量比為f 10:500，向前驅(qū)體溶液滴加入還原劑溶液后保持溫度不變，繼續(xù)加熱時間為5~20min ;前驅(qū)體溶液與還原劑溶液體積比1:1。
[0009]步驟(2)中所述偶聯(lián)劑為Y-巰丙基三甲氧基硅烷、Y-巰丙基三乙氧基硅烷中的一種，偶聯(lián)劑與甲醇的質(zhì)量比為I~2:100 ;基片為玻璃片或石英片，基片在偶聯(lián)劑溶液中浸泡時間為0.5~2h。
[0010]步驟(3)中所述的浸泡時間為0.5~lh。
[0011]步驟(4)旋涂液中，無熒光基團(tuán)聚合物與有機(jī)溶劑的質(zhì)量比為0.01-0.2:1000，所述無熒光基團(tuán)聚合物為聚甲基丙烯酸甲酯、聚乙烯醇中的一種，聚甲基丙烯酸甲酯數(shù)均分子量為1.0 X IO5~1.6 X 105，聚乙烯醇平均聚合度為1600~3000，醇解度≥98%，有機(jī)溶劑為四氫呋喃、乙醇中的一種；旋涂法制備聚合物薄膜的轉(zhuǎn)速為100(T3000rpm，時間為2(T60s。
[0012]本發(fā)明還提供一種蛋白質(zhì)傳感膜的用途，應(yīng)用于具有熒光特性蛋白質(zhì)的快速檢測，具體是應(yīng)用于骨形態(tài)發(fā)生蛋白或牛血清蛋白的快速檢測。
[0013]本發(fā)明的有益效果:
本發(fā)明利用巰基與銀的相互作用，采用自組裝法在載玻片或石英片上負(fù)載了一層具有一定有序性的納米銀粒子，使其成為具有局域表面等離子體共振效應(yīng)的基底。將親水性聚合物旋涂在納米銀基底表面成膜，與納米銀基底相比，不僅可調(diào)節(jié)納米銀粒子與熒光物質(zhì)之間的距離，進(jìn)而調(diào)整熒光增強(qiáng)效應(yīng)，而且還可以隔絕納米銀與空氣，阻礙納米銀被氧化。本發(fā)明制備工藝簡單，操作性強(qiáng)。
[0014]
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1為本發(fā)明基于自組裝納米銀的蛋白質(zhì)傳感膜的結(jié)構(gòu)示意圖(其中:1為基片，2為納米銀粒子層，3為無熒光基團(tuán)的聚合物薄膜)。
[0016]圖2為本發(fā)明中實施例1硅烷化基片上納米銀粒子的掃描電鏡圖。
[0017]圖3為本發(fā)明中實施例2硅烷化基片上納米銀粒子的掃描電鏡圖。
[0018]圖4為本發(fā)明中實施例3硅烷化基片上納米銀粒子的掃描電鏡圖。
[0019]圖5為本發(fā)明實施例1傳感膜與石英基片上測定骨形態(tài)發(fā)生蛋白的熒光光譜對比圖(圖5a、b分別為石英基片與傳感膜上骨形態(tài)發(fā)生蛋白的熒光光譜曲線)。
[0020]圖6為本發(fā)明實施例2傳感膜與石英基片上測定牛血清蛋白的熒光光譜對比圖(圖6c、d分別為石英基片與傳感膜上牛血清蛋白的熒光光譜曲線)。
[0021]圖7為本發(fā)明實施例3傳感膜與石英基片上測定牛血清蛋白的熒光光譜對比圖(圖7e、f分別為石英基片與傳感膜上牛血清蛋白的熒光光譜曲線)。
[0022]
【具體實施方式】
[0023]下面結(jié)合具體的實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但并不局限于下列實施例，應(yīng)包括權(quán)利要求書中的全部內(nèi)容。
[0024]實施例1
(I)將納米銀前驅(qū)體硝酸銀、還原劑檸檬酸鈉分別溶于蒸餾水，得到納米銀前驅(qū)體溶液和還原劑溶液，前驅(qū)體溶液中質(zhì)量比硝酸銀:蒸餾水為0.5:500，還原劑溶液中質(zhì)量比檸檬酸鈉:蒸餾水為10:500 ;將前驅(qū)體溶液加熱至130°C煮沸l(wèi)h，然后邊攪拌，邊向其中滴加入還原劑溶液，保持溫度繼續(xù)加熱20min ;冰水浴降至室溫，離心除去上層清液，得到納米銀溶膠。前驅(qū)體溶液與還原劑溶液體積比1:1。
[0025](2)將偶聯(lián)劑Y-巰丙基三甲氧基硅烷溶于甲醇形成偶聯(lián)劑溶液，質(zhì)量比Y-巰丙基三甲氧基硅烷:甲醇為1:100 ;將干凈石英片通過等離子表面處理30min，然后常溫下置于偶聯(lián)劑溶液中浸泡2h，使石英片表面硅烷化，自然風(fēng)干后得到硅烷化基片。
[0026](3)將步驟(2)中得到的硅烷化基片在步驟(I)得到的納米銀溶膠中浸泡0.5h，然后取出，真空干燥后在硅烷化基片表面形成納米銀粒子層，得到納米銀基片。如附圖2所
/Jn ο
[0027](4)將聚甲基丙烯酸甲酯(數(shù)均分子量為1.0X IO5)溶解于四氫呋喃得到旋涂液，質(zhì)量比聚甲基丙烯酸甲酯:四氫呋喃為0.2:1000 ;進(jìn)而采用旋涂法在步驟(3)得到的納米銀基片上制備聚合物薄膜，自然風(fēng)干后即得到蛋白質(zhì)傳感膜。旋涂法制備聚合物薄膜的轉(zhuǎn)速為lOOOrpm，時間為30s。
[0028](5)分別在石英基片和上述制備的蛋白質(zhì)傳感膜上滴加骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP-2)的水溶液，真空干燥后測定熒光發(fā)射光譜，結(jié)果如附圖5 (a)、圖(b)所示。
[0029]實施例2
(I)將納米銀前驅(qū)體硝酸銀、還原劑檸檬酸鈉分別溶于蒸餾水，得到納米銀前驅(qū)體溶液和還原劑溶液，前驅(qū)體溶液中質(zhì)量比硝酸銀:蒸餾水為0.1:500，還原劑溶液中質(zhì)量比檸檬酸鈉:蒸餾水為1:500 ;將前驅(qū)體溶液加熱至120°C煮沸0.5h，然后邊攪拌，邊向其中滴加入還原劑溶液，保持溫度繼續(xù)加熱5min ;冰水浴降至室溫，離心除去上層清液，得到納米銀溶膠。前驅(qū)體溶液與還原劑溶液體積比1:1。
[0030](2)將Y-巰丙基三乙氧基硅烷溶于甲醇形成偶聯(lián)劑溶液，質(zhì)量比Y-巰丙基三乙氧基硅烷:甲醇為2:100 ;將干凈的玻璃片通過等離子表面處理30min，然后常溫下置于偶聯(lián)劑溶液中浸泡lh，使玻璃片表面硅烷化，自然風(fēng)干后得到硅烷化基片。
[0031](3)將步驟(2)中得到的硅烷化基片在步驟(I)得到的納米銀溶膠中浸泡lh，然后取出，真空干燥后在硅烷化基片表面形成納米銀粒子層，得到納米銀基片。如附圖3所示。
[0032](4)將聚乙烯醇(平均聚合度為2400，醇解度> 98%)溶解于有機(jī)溶劑乙醇得到旋涂液，質(zhì)量比聚乙烯醇:乙醇為0.01:1000 ;進(jìn)而采用旋涂法在步驟(3)得到的納米銀基片上制備聚合物薄膜，自然風(fēng)干后即得到蛋白質(zhì)傳感膜。旋涂法制備聚合物薄膜的轉(zhuǎn)速為2000rpm，時間為 60s。[0033](5)分別在石英基片和上述制備的蛋白質(zhì)傳感膜上滴加牛血清蛋白(BSA)的水溶液，真空干燥后測定熒光發(fā)射光譜，結(jié)果如附圖6 (C)、圖6 (d)所示。
[0034]實施例3
(I)將納米銀前驅(qū)體醋酸銀、還原劑檸檬酸鈉分別溶于蒸餾水，得到納米銀前驅(qū)體溶液和還原劑溶液，前驅(qū)體溶液中質(zhì)量比醋酸銀:蒸餾水為0.3:500，還原劑溶液中質(zhì)量比檸檬酸鈉:蒸餾水為5:500 ;將前驅(qū)體溶液加熱至120°C煮沸l(wèi)h，然后邊攪拌，邊向其中滴加入還原劑溶液，保持溫度繼續(xù)加熱20min ;冰水浴降至室溫，離心除去上層清液，得到納米銀溶膠。前驅(qū)體溶液與還原劑溶液體積比1:1。
[0035](2)將偶聯(lián)劑Y-巰丙基三甲氧基硅烷溶于甲醇形成偶聯(lián)劑溶液，質(zhì)量比Y-巰丙基三甲氧基硅烷:甲醇為1.5:100 ;將干凈的石英片通過等離子表面處理30min，然后常溫下置于偶聯(lián)劑溶液中浸泡lh，使石英片表面硅烷化，自然風(fēng)干后得到硅烷化基片。
[0036](3)將步驟(2)中得到的硅烷化基片在步驟(I)得到的納米銀溶膠中浸泡0.8h，然后取出，真空干燥后在硅烷化基片表面形成納米銀粒子層，得到納米銀基片。如附圖4所
/Jn ο
[0037](4)將聚乙烯醇(平均聚合度為1600，醇解度> 98%)溶解于乙醇得到旋涂液，質(zhì)量比聚乙烯醇:乙醇為0.2:1000 ;進(jìn)而采用旋涂法在步驟(3)得到的納米銀基片上制備聚合物薄膜，自然風(fēng)干后即得到蛋白質(zhì)傳感膜。旋涂法制備聚合物薄膜的轉(zhuǎn)速為2000rpm，時間為 40s。
[0038](5)分別在石英基片和上述制備的蛋白質(zhì)傳感膜上滴加牛血清蛋白(BSA)的水溶液，真空干燥后測定熒光發(fā)射光譜，結(jié)果如附圖7 (e)、圖7 (f)所示。
【權(quán)利要求】
1.一種蛋白質(zhì)傳感膜，其特征在于:其由三層結(jié)構(gòu)組成:底層是基片，中間層是納米銀粒子層，上層是無熒光基團(tuán)的聚合物薄膜，所述基片為玻璃片或石英片。
2.—種權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)傳感膜的制備方法，其特征在于包括如下步驟: (1)將納米銀前驅(qū)體、還原劑分別溶于蒸餾水，得到納米銀前驅(qū)體溶液和還原劑溶液；將納米銀前驅(qū)體溶液加熱煮沸一段時間，然后邊攪拌，邊向其中滴加入還原劑溶液，繼續(xù)加熱一段時間后停止加熱，冰水浴降至室溫，離心除去上層清液，得到納米銀溶膠； (2)將偶聯(lián)劑溶于甲醇形成偶聯(lián)劑溶液，將干凈的基片通過等離子表面處理30min，然后常溫下置于偶聯(lián)劑溶液中浸泡一段時間，使基片表面硅烷化，自然風(fēng)干后得到硅烷化基片; (3)將步驟(2)中得到的硅烷化基片浸泡在步驟(1)得到的納米銀溶膠中一段時間，然后取出，真空干燥后在硅烷化基片表面形成納米銀粒子層，得到納米銀基片； (4)將無熒光基團(tuán)的聚合物溶解于有機(jī)溶劑得到旋涂液，進(jìn)而采用旋涂法在步驟(3)得到的納米銀基片上制備聚合物薄膜，自然風(fēng)干后即得到蛋白質(zhì)傳感膜。
3.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于:步驟(1)中所述納米銀前驅(qū)體為硝酸銀、醋酸銀中的一種，前驅(qū)體溶液中，前驅(qū)體與蒸餾水的質(zhì)量比為0.1-0.5:500 ;前驅(qū)體溶液加熱煮沸溫度為 120°C~140°C，加熱煮沸時間為0.5^1h ;所述還原劑為檸檬酸鈉，還原劑溶液中，還原劑與蒸懼水的質(zhì)量比為廣10:500,向前驅(qū)體溶液滴加入還原劑溶液后保持溫度不變，繼續(xù)加熱時間為5~20min ;前驅(qū)體溶液與還原劑溶液體積比1:1。
4.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于:步驟(2)中所述偶聯(lián)劑為Y-巰丙基三甲氧基硅烷、Y _疏丙基二乙氧基硅烷中的一種，偶聯(lián)劑與甲醇的質(zhì)量比為I~2:100 ;基片為玻璃片或石英片，基片在偶聯(lián)劑溶液中浸泡時間為0.5~2h。
5.權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于:步驟(3)中所述的浸泡時間為0.5~lh。
6.權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟(4)旋涂液中，無熒光基團(tuán)聚合物與有機(jī)溶劑的質(zhì)量比為0.01、.2:1000，所述無熒光基團(tuán)聚合物為聚甲基丙烯酸甲酯、聚乙烯醇中的一種，聚甲基丙烯酸甲酯數(shù)均分子量為1.0X IO5UXlO5,聚乙烯醇平均聚合度為1600-3000，醇解度> 98%，有機(jī)溶劑為四氫呋喃、乙醇中的一種；旋涂法制備聚合物薄膜的轉(zhuǎn)速為100(T3000rpm，時間為20~60s。
7.—種權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)傳感膜的用途，其特征在于:應(yīng)用于具有熒光特性蛋白質(zhì)的快速檢測，具體是應(yīng)用于骨形態(tài)發(fā)生蛋白或牛血清蛋白的快速檢測。
【文檔編號】G01N21/64GK103995104SQ201410153514
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2014年4月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月17日
【發(fā)明者】易國斌, 劉念, 梁真飛, 俎喜紅, 羅洪盛, 劉順彭 申請人:廣東工業(yè)大學(xué)