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同時檢測兩種急性白血病標(biāo)志物電化學(xué)傳感器的制備方法及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種同時檢測兩種急性白血病標(biāo)志物電化學(xué)傳感器的制備方法，步驟如下：將溶菌酶報告探針和γ-干擾素報告探針分別在含有TCEP的溶液中靜置，以打開二硫鍵并分別與溶菌酶適體和γ-干擾素適體形成雙鏈結(jié)構(gòu)；對金電極進(jìn)行預(yù)處理，將處理好的金電極浸在預(yù)處理后的溶菌酶報告探針-適體雙鏈和γ-干擾素報告探針-適體雙鏈的混合液中，室溫靜置過夜，之后用二次蒸餾水和清洗液清洗；然后將電極浸在含有MCH的溶液中，以封閉電極，之后用二次蒸餾水和清洗液清洗；將上述步驟處理后的電極作為工作電極，和參比電極、對電極連接在化學(xué)工作站上，以得到電化學(xué)傳感器。該電化學(xué)傳感器可用于兩種急性白血病標(biāo)志物溶菌酶和γ-干擾素的同時檢測。
【專利說明】同時檢測兩種急性白血病標(biāo)志物電化學(xué)傳感器的制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種同時檢測兩種急性白血病標(biāo)志物電化學(xué)傳感器的制備方法及應(yīng)用，屬于臨床分析及生物電化學(xué)傳感【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]在當(dāng)今社會中，癌癥是嚴(yán)重威脅人類身體健康的疾病之一。癌癥患者的死亡率很高的最主要的原因是，不能進(jìn)行早期診斷，如果能早期診斷及時治療，1/3的癌癥可以治愈。而血清腫瘤標(biāo)志物的測定對癌癥的早期診斷起著重要的作用。因此，建立準(zhǔn)確、快速檢測血清中腫瘤標(biāo)志物的分析方法及相應(yīng)的設(shè)備引起了人們的高度重視。
[0003]急性白血病是兒童和青年中最常見的一種惡性腫瘤，對兒童身體健康的危害極大，其早期診斷對有效治療具有十分重要的意義。傳統(tǒng)診斷方法多依靠腫瘤組織或細(xì)胞形態(tài)上的變化來進(jìn)行的，但判斷難度大、準(zhǔn)確率低，而且一旦在組織及細(xì)胞形態(tài)上確定癌癥發(fā)生，往往已進(jìn)入中晚期，難以進(jìn)行有效治療。由于癌細(xì)胞變化的過程主要是由復(fù)雜的分子水平的變化所誘導(dǎo)的，因此研究分子水平上的差異，對此水平的標(biāo)志性物質(zhì)進(jìn)行靈敏及特異性識別和檢測，有望實現(xiàn)癌癥的高效早期診斷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目 的在于提供一種同時檢測兩種急性白血病標(biāo)志物電化學(xué)傳感器的制備方法及應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明所采用的技術(shù)解決方案是:
[0006]一種同時檢測兩種急性白血病標(biāo)志物電化學(xué)傳感器的制備方法，包括以下步驟:
[0007](I)將溶菌酶報告探針和Y -干擾素報告探針分別在含有三(2-氯乙基)磷酸酯的溶液中靜置，以打開二硫鍵；再向溶液中添加溶菌酶適體和Y-干擾素適體，溶菌酶報告探針和溶菌酶適體形成溶菌酶報告探針-適體雙鏈結(jié)構(gòu)，Y-干擾素報告探針和Y-干擾素適體形成Y-干擾素報告探針-適體雙鏈結(jié)構(gòu)；
[0008](2)對金電極進(jìn)行預(yù)處理，將處理好的金電極浸在經(jīng)過步驟(1)預(yù)處理后的溶菌酶報告探針-適體雙鏈和Y -干擾素報告探針-適體雙鏈混合液中，室溫靜置過夜，之后用二次蒸餾水和清洗液清洗；
[0009](3)將步驟⑵處理后的電極浸在含有6-巰基-1-己醇的溶液中，以封閉電極，之后用二次蒸餾水和清洗液清洗；
[0010](4)將步驟(3)處理后的電極作為工作電極，和參比電極、對電極連接在化學(xué)工作站上，以得到可同時檢測兩種急性白血病標(biāo)志物的電化學(xué)傳感器。
[0011]優(yōu)選的，步驟⑴中:所述溶菌酶報告探針為5’ -巰基-06-6了6046460^46了4八(:1'(^604(:-亞甲基藍(lán)-3’，所述溶菌酶適體為5’-41^ AGG GCT AMGAG TGC AGA GTT ACT TAG-3’，所述 Y -干擾素報告探針為 5’-巰基-C6-TTCAACCAACTTTTTTTTTTCAACACCCAT-二茂鐵-3’，所述 Y -干擾素適體為 5’-GGG GTT GGT TGT GTT GGG TGTTGT GT-3’。
[0012]優(yōu)選的，步驟(I)中:所述溶液中溶菌酶報告探針-適體雙鏈的濃度為I μ mol/L，Y -干擾素報告探針-適體雙鏈的濃度為I μ mo I/L ;所述溶液中含有0.5 μ L10mmol/L三(2-氯乙基)憐酸酯，還含有 20mmol/L Tris-HCl> 140mmol/L NaCl、20mmol/L MgCl2 以及20mmol/L KCl，溶液 pH 值為 7.4。
[0013]優(yōu)選的，步驟(I)中:所述靜置過程在室溫下進(jìn)行，靜置時間為2小時。
[0014]優(yōu)選的，步驟(2)中所述金電極的預(yù)處理過程如下:金電極用0.3μπι的Al2O3粉打磨成鏡面，二次蒸餾水清洗后，相繼在二次蒸餾水和乙醇溶液中超聲50s ;將清洗干凈的金電極在0.5mol/L的硫酸溶液中循環(huán)伏安掃描至穩(wěn)定,掃描電壓為0.2?1.65V,掃描速度為
0.lV/s，然后用二次蒸餾水沖洗干凈，室溫晾干。
[0015]優(yōu)選的，步驟(3)中:所述溶液中MCH的濃度為2mmol/L，溶液中還含有20mmol/LTris-HClU40mmol/L NaCl、20mmol/L MgCl2 以及 20mmol/L KC1，溶液 pH 值為 7.4。
[0016]優(yōu)選的，步驟(2)與步驟(3)中:所述清洗液為濃度lOmmol/L的Tris-HCl緩沖溶液，溶液PH值為7.4。
[0017]上述制備的電化學(xué)傳感器用于兩種急性白血病標(biāo)志物溶菌酶和Y-干擾素的同時檢測。
[0018]上述檢測方法具體包括以下步驟:
[0019](I)溶菌酶和Y-干擾素檢測溶液的制備:溶菌酶和Y-干擾素在溶液中配制成濃度分別為0.5?500nmol/L和0.5?500nmol/L，儲存在4°C下備用；所述溶液中包含有 20mmol/LTris-HCl、140mmol/L NaCl、20mmol/L MgCl2 以及 20mmol/L KC1，溶液 pH 值為7.4；
[0020](2)將所制備的傳感器工作電極浸泡在50 μ L步驟⑴配制的溶菌酶和Y -干擾素檢測溶液中，37°C下靜置lh，之后用二次蒸餾水和清洗液清洗，得到組裝的工作電極；
[0021](3)將參比電極、對電極和組裝的工作電極連接在電化學(xué)工作站上，在電解槽中加入 40 ?60 μ L 的溶液，溶液中含有 20mmol/L Tris-HClU40mmol/L NaCl、20mmol/L MgCl2以及20mmol/L KC1，溶液pH值為7.4，然后用差分脈沖伏安法檢測組裝的工作電極的電流響應(yīng)，根據(jù)所得電流響應(yīng)與兩種急性白血病標(biāo)志物的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度之間的關(guān)系，繪制工作曲線；
[0022](4)將待測樣品溶液代替兩種標(biāo)志物的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照所述兩種急性白血病標(biāo)志物的工作曲線的繪制方法進(jìn)項檢測。
[0023]優(yōu)選的，步驟⑵中，所述清洗液為濃度lOmmol/L的Tris-HCl緩沖溶液，溶液pH為 7.4。
[0024]本發(fā)明的工作原理及有益效果如下:
[0025]在患病初期，溶菌酶、Y干擾素等與急性白血病相關(guān)的標(biāo)志物會發(fā)生變化，對它們的同時檢測可輔助進(jìn)行早期診斷及分型，對急性白血病的早期診斷具有非常大的意義。本發(fā)明基于核酸適體識別技術(shù)，建立電化學(xué)生物傳感器實現(xiàn)溶菌酶(其濃度有助于區(qū)分急性早幼粒細(xì)胞白血病、急性粒單核細(xì)胞白血病等亞型)和Y干擾素(其濃度可反映急性白血病患者的細(xì)胞免疫水平及機體免疫功能)兩種急性白血病相關(guān)物質(zhì)的同時、高靈敏檢測，用于急性白血病早期診斷。
[0026]本發(fā)明首先在金電極上固定兩種分別修飾有電活性物質(zhì)(二茂鐵、亞甲基藍(lán))的標(biāo)志物的報告探針-適體雙鏈，在溶菌酶和Y -干擾素存在下兩者分別與雙鏈中的適體結(jié)合，兩報告探針的構(gòu)象分別發(fā)生變化從而引起相應(yīng)報告探針鏈上修飾的電活性物質(zhì)與電極之間的距離變化，從而電流響應(yīng)發(fā)生改變。本發(fā)明結(jié)合適體識別技術(shù)，所制備的傳感器具有極高的選擇性，可以同時實現(xiàn)溶菌酶和Y干擾素的高靈敏度檢測；檢測時僅需對樣品簡單處理，節(jié)省了檢測時間，降低了檢測成本，是一種快速、廉價且靈敏的檢測方法，將促進(jìn)急性白血病早起診斷及分型的發(fā)展。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0027]圖1為本發(fā)明的原理圖。
【具體實施方式】
[0028]結(jié)合附圖，一種同時檢測兩種急性白血病標(biāo)志物電化學(xué)傳感器的制備方法，包括以下步驟:
[0029](I)將 I μ mo I/L 溶菌酶報告探針(5 ’ -巰基-C6-GTGCAGAGCTAAGTAACTCTGCAC-亞甲基藍(lán) _3，)和 I μ mo I/L y -干擾素報告探針(5，-巰基-C6-TTCAACCAACTTTTTTTTTTCAACACCCAT- 二茂鐵-3，)分別在含有0.5 μ L10mmol/L三(2-氯乙基)磷酸酯(TCEP)的50 μ L溶液(20mmol/L Tris-HCl, pH7.4, 140mmol/L NaCl, 20mmol/L MgC12, 20mmol/L KCl)中室溫下靜置2h，以打開二硫鍵。再向溶液中添加I μ mol/L溶菌酶適體(5’ -ATC AGG GCTAAA GAG TGC AGA GTT ACT TAG-3’ )和 I μ mol/L 干擾素適體(5，-GGG GTT GGT TGT GTTGGG TGT TGT GT-3’)，溶菌酶報告探針和溶菌酶適體形成溶菌酶報告探針-適體雙鏈結(jié)構(gòu)，Y-干擾素報告探針和Y-干擾素適體形成Y-干擾素報告探針-適體雙鏈結(jié)構(gòu)，得到預(yù)處理后的溶菌酶適體和Y-干擾素適體混合液。
[0030](2)金電極用0.3 μ m的Al2O3粉打磨成鏡面，二次蒸餾水清洗后，相繼在二次蒸餾水和乙醇溶液中超聲50s ;將清洗干凈的金電極在0.5mol/L的硫酸溶液中循環(huán)伏安(0.2?1.65V，0.lV/s，)至穩(wěn)定，然后用二次蒸餾水沖洗干凈，室溫晾干。將處理好的金電極浸在經(jīng)過步驟(I)預(yù)處理后的溶菌酶適體和Y-干擾素適體混合液中，室溫靜置過夜，之后用二次蒸餾水和清洗液(lOmmol/L Tris-HCl, pH7.4)清洗。
[0031](3)將經(jīng)過步驟⑵處理后的電極浸在含有2mmol/L6-巰基_1_己醇(MCH)的溶液(20mmol/L Tris-HCl, ρΗ7.4，140mmol/L NaCl, 20mmol/L MgCl2, 20mmol/L KCl)中 lh，以封閉電極，之后用二次蒸餾水和清洗液(lOmmol/L Tris-HCl, pH7.4)清洗。
[0032](4)將步驟(3)處理后的電極作為工作電極，和參比電極、對電極連接在化學(xué)工作站上，以得到可同時檢測兩種急性白血病標(biāo)志物的電化學(xué)傳感器。
[0033]上述電化學(xué)傳感器可用于兩種急性白血病標(biāo)志物溶菌酶和Y-干擾素的同時檢測，具體包括以下步驟:
[0034](I)溶菌酶和Y -干擾素檢測溶液的制備:溶菌酶和Y -干擾素在溶液(20mmol/L Tris-HCl, pH7.4, 140mmol/L NaCl, 20mmol/L MgCl2, 20mmol/L KCl)中配制成濃度分別為
0.5?500nmol/L和0.5?500nmol/L的混合液溶液，儲存在4°C下備用。[0035](2)將所制備的傳感器工作電極浸泡在50 μ L步驟⑴配制的已知濃度的混合液中，37°C下靜置lh，之后用二次蒸餾水和清洗液(lOmmol/L Tris-HCl, pH7.4)清洗，得到組裝的工作電極。
[0036](3)將參比電極、對電極和組裝的工作電極連接在電化學(xué)工作站上，在電解槽中加入 40 ?60μ L 的溶液(20mmol/L Tris-HCl, pH7.4, 140mmol/L NaCl, 20mmol/LMgCl2, 20mmol/L KCl)，然后用差分脈沖伏安法檢測組裝的工作電極的電流響應(yīng)，根據(jù)所得電流響應(yīng)與兩種急性白血病標(biāo)志物的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度之間的關(guān)系，繪制工作曲線。
[0037](4)將待測樣品溶液代替兩種標(biāo)志物的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照所述兩種急性白血病標(biāo)志物的工作曲線的繪制方法進(jìn)項檢測。
[0038]檢測結(jié)果如下:
[0039]1、Y-干擾素的檢測:二茂鐵的信號在400±4mV左右，檢測范圍大約為0.5?500nmol/L,檢測限約為 0.3nmol/L。
[0040]2、溶菌酶的檢測:亞甲基藍(lán)的信號在_245±3mV左右，檢測范圍大約為0.5?500nmol/L 檢測限約為 0.2nmol/L。
[0041]由以上檢測數(shù)據(jù)可看出，本發(fā)明傳感器對溶菌酶和干擾素可以實現(xiàn)同時高靈敏度檢測。
【權(quán)利要求】
1.一種同時檢測兩種急性白血病標(biāo)志物電化學(xué)傳感器的制備方法，其特征在于包括以下步驟: (1)將溶菌酶報告探針和Y-干擾素報告探針分別在含有三(2-氯乙基)磷酸酯的溶液中靜置，以打開二硫鍵；再向溶液中添加溶菌酶適體和Y-干擾素適體，溶菌酶報告探針和溶菌酶適體形成溶菌酶報告探針-適體雙鏈結(jié)構(gòu)，Y-干擾素報告探針和Y-干擾素適體形成Y-干擾素報告探針-適體雙鏈結(jié)構(gòu)； (2)對金電極進(jìn)行預(yù)處理，將處理好的金電極浸在經(jīng)過步驟(1)預(yù)處理后的溶菌酶報告探針-適體雙鏈和Y -干擾素報告探針-適體雙鏈混合液中，室溫靜置過夜，之后用二次蒸餾水和清洗液清洗； (3)將步驟(2)處理后的電極浸在含有6-巰基-1-己醇的溶液中，以封閉電極，之后用二次蒸餾水和清洗液清洗； (4)將步驟(3)處理后的電極作為工作電極，和參比電極、對電極連接在化學(xué)工作站上，以得到可同時檢測兩種急性白血病標(biāo)志物的電化學(xué)傳感器。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種同時檢測兩種急性白血病標(biāo)志物電化學(xué)傳感器的制備方法，其特征在于，步驟⑴中:所述溶菌酶報告探針為5’ -巰基-C6-GTGCAGAGCTAAGTMCTCTGCAC-亞甲基藍(lán)-3 ’，所述溶菌酶適體為 5 ’ -ATC AGG GCT AAAGAG TGC AGA GTT ACT TAG-3’，所述 Y -干擾素報告探針為 5’-巰基-C6-TTCAACCAACTTTTTTTTTTCAACACCCAT-二茂鐵-3’，所述 Y -干擾素適體為 5’-GGG GTT GGT TGT GTT GGG TGTTGT GT-3’。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種同時檢測兩種急性白血病標(biāo)志物電化學(xué)傳感器的制備方法，其特征在于，步驟(1)中:所述溶液中溶菌酶報告探針-適體雙鏈的濃度為I μ mol/L, Y-干擾素報告探針-適體雙鏈的濃度為I μ mo I/L ;所述溶液中含有0.5 μ L10mmol/L三(2-氯乙基)憐酸酯，還含有 20mmol/L Tris-HCl> 140mmol/L NaCl、20mmol/L MgCl2 以及20mmol/L KCl，溶液 pH 值為 7.4。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種同時檢測兩種急性白血病標(biāo)志物電化學(xué)傳感器的制備方法，其特征在于，步驟(1)中:所述靜置過程在室溫下進(jìn)行，靜置時間為2小時。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種同時檢測兩種急性白血病標(biāo)志物電化學(xué)傳感器的制備方法，其特征在于，步驟⑵中所述金電極的預(yù)處理過程如下:金電極用0.3μπι的Al2O3粉打磨成鏡面，二次蒸餾水清洗后，相繼在二次蒸餾水和乙醇溶液中超聲50s ;將清洗干凈的金電極在0.5mol/L的硫酸溶液中循環(huán)伏安掃描至穩(wěn)定,掃描電壓為0.2~1.65V,掃描速度為0.lV/s，然后用二次蒸餾水沖洗干凈，室溫晾干。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種同時檢測兩種急性白血病標(biāo)志物電化學(xué)傳感器的制備方法，其特征在于，步驟⑶中:所述溶液中MCH的濃度為2mmol/L，溶液中還含有20mmol/L Tris-HClU40mmol/L NaCl、20mmol/L MgCl2 以及 20mmol/L KC1，溶液 pH 值為 7.4。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種同時檢測兩種急性白血病標(biāo)志物電化學(xué)傳感器的制備方法，其特征在于，步驟⑵與步驟(3)中:所述清洗液為濃度lOmmol/L的Tris-HCl緩沖溶液，溶液PH值為7.4。
8.如權(quán)利要求1-7中任一權(quán)利要求所制備的電化學(xué)傳感器用于兩種急性白血病標(biāo)志物溶菌酶和Y-干擾素的同時檢測。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的電化學(xué)傳感器用于兩種急性白血病標(biāo)志物的同時檢測，具體包括以下步驟: (1)溶菌酶和Y-干擾素檢測溶液的制備:溶菌酶和Y-干擾素在溶液中配制成濃度分別為0.5~500nmol/L和0.5~500nmol/L，儲存在4°C下備用；所述溶液中包含有20mmol/L Tris-HClU40mmol/L NaCl、20mmol/L MgCl2 以及 20mmol/L KC1，溶液 pH 值為7.4； (2)將所制備的傳感器工作電極浸泡在50μ L步驟(1)配制的溶菌酶和Y-干擾素檢測溶液中，37°C下靜置lh，之后用二次蒸餾水和清洗液清洗，得到組裝的工作電極； (3)將參比電極、對電極和組裝的工作電極連接在電化學(xué)工作站上，在電解槽中加入40~6(^1^的溶液，溶液中含有20臟01/1 Tris-HClU40mmoI/L NaCl、20mmol/L MgCl2 以及20mmol/L KCl，溶液pH值為7.4，然后用差分脈沖伏安法檢測組裝的工作電極的電流響應(yīng)，根據(jù)所得電流響應(yīng)與兩種急性 白血病標(biāo)志物的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度之間的關(guān)系，繪制工作曲線； (4)將待測樣品溶液代替兩種標(biāo)志物的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照所述兩種急性白血病標(biāo)志物的工作曲線的繪制方法進(jìn)項檢測。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的電化學(xué)傳感器用于兩種急性白血病標(biāo)志物的同時檢測，其特征在于，步驟(2)中，所述清洗液為濃度lOmmol/L的Tris-HCl緩沖溶液，溶液pH為7.4。
【文檔編號】G01N27/26GK103940872SQ201410181470
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年4月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月30日
【發(fā)明者】王宗花, 趙凱, 夏建飛, 宋岱珉, 張菲菲, 夏霖, 遲德玲, 李延輝, 夏延致, 夏臨華 申請人:青島大學(xué)