用于結(jié)核分枝桿菌感染檢測(cè)及臨床治療效果監(jiān)測(cè)的試劑盒及其用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于結(jié)核分枝桿菌感染檢測(cè)及臨床治療效果監(jiān)測(cè)的試劑盒。本發(fā)明提供的試劑盒包括特異性抗體：IP-10抗體和/或CD14抗體；抗原刺激物；以及陽性對(duì)照刺激劑。本發(fā)明所述試劑盒可用于診斷活動(dòng)性結(jié)核病人或結(jié)核潛伏感染者而不受接種BCG(卡介苗)的影響。本試劑盒用于活動(dòng)性結(jié)核病人診斷的敏感性和特異性均高于T-SPOT.TB商用試劑盒，均達(dá)到100％?？菇Y(jié)核治療1個(gè)月后，80％以上的臨床結(jié)核病人的檢出率轉(zhuǎn)為陰性，表明本試劑盒可用于檢測(cè)臨床抗結(jié)核治療效果。
【專利說明】用于結(jié)核分枝桿菌感染檢測(cè)及臨床治療效果監(jiān)測(cè)的試劑盒及其用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域，具體涉及一種用于結(jié)核分枝桿菌感染檢測(cè)及臨床治療效果監(jiān)測(cè)的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]結(jié)核病主要由結(jié)核分枝桿菌感染引起，2013年世界衛(wèi)生組織(WHO)報(bào)道指出全球約有1200萬結(jié)核病患者，其中2012年結(jié)核新發(fā)病例為860萬，死亡病例為130萬。結(jié)核病給人類健康造成嚴(yán)重威脅。我國(guó)是結(jié)核病五大高負(fù)擔(dān)國(guó)之一，結(jié)核病嚴(yán)重阻礙我國(guó)經(jīng)濟(jì)和社會(huì)發(fā)展。
[0003]結(jié)核病防控的難點(diǎn)之一是缺乏快速準(zhǔn)確的診斷方法。傳統(tǒng)的結(jié)核病診斷方法有結(jié)核菌素皮試試驗(yàn)(TST)、結(jié)核菌痰涂片抗酸染色、結(jié)核菌痰培養(yǎng)以及放射性X光片等。近年來新發(fā)展的診斷方法有分子生物學(xué)方法(PCR法)和免疫學(xué)方法等。傳統(tǒng)的診斷方法都存在敏感性或特異性低的缺陷，而PCR方法假陽性較高。新型免疫學(xué)方法中的Y-干擾素(IFN-Y)釋放實(shí)驗(yàn)(interferon-gamma release assay, IGRA)是現(xiàn)階段檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌感染準(zhǔn)確性較高的方法， 現(xiàn)有的商用試劑盒有T-SP0T.TB和QuantiFERON-TB GoldIn-Tube(QFT-1T)，這兩個(gè)試劑盒的敏感性和特異性分別為80%到90%之間，尚有待改進(jìn)。
[0004]人體感染結(jié)核分枝桿菌后，體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生免疫記憶。當(dāng)用相同的抗原再次刺激人體免疫細(xì)胞時(shí)，活化的免疫細(xì)胞會(huì)分泌大量細(xì)胞因子或趨化因子，并具有抗原特異性，即疾病特異性，因而這些免疫細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子或趨化因子具有良好的結(jié)核病診斷潛力。
[0005]在臨床抗結(jié)核治療過程中，結(jié)核病人體內(nèi)的結(jié)核分枝桿菌荷載量隨著有效治療的進(jìn)行而降低，從而導(dǎo)致體內(nèi)結(jié)核抗原特異性免疫細(xì)胞數(shù)量下降。因而抗原特異性誘導(dǎo)的細(xì)胞因子或趨化因子含量也隨之下降，因此可見，這些細(xì)胞因子或趨化因子能較好地反映臨床治療的有效性，即臨床預(yù)后價(jià)值。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種新的用于檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌感染和臨床抗結(jié)核治療效果監(jiān)測(cè)的試劑盒及其用途。
[0007]在本發(fā)明的一方面，提供一種用于結(jié)核分枝桿菌感染檢測(cè)及臨床治療效果監(jiān)測(cè)的試劑盒，所述試劑盒包含:
[0008]a)以下特異性抗體:IP-10抗體和/或⑶14抗體；
[0009]b)抗原刺激物；
[0010]c)陽性對(duì)照刺激劑。
[0011]所述抗原刺激物為蛋白質(zhì)或多肽。所述抗原刺激物優(yōu)選為結(jié)核分枝桿菌ESAT-6抗原和/或結(jié)核分枝桿菌CFP-10抗原中的一條或多條多肽或其類似物。所述的多肽由20個(gè)氨基酸組成，所述其類似物為與其同源性在75%以上的多肽或多肽修飾物。所述結(jié)核分枝桿菌ESAT-6抗原具體可為SEQ ID NO: 1-SEQ ID N0:9所示序列的多肽中的至少一種；所述結(jié)核分枝桿菌CFP-1O抗原具體可為序列表的SEQ ID NO: 10-SEQ ID NO: 18所示序列的多肽中的至少一種。所述抗原刺激物為SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 18所示序列中的一條或多條多肽。
[0012]序列1MTEQQWNFAG IEAAASAIQG,如 SEQ ID NO:1 所示；
[0013]序列2IEAAASAIQG NVTSIHSLLD,如 SEQ ID NO: 2 所示；
[0014]序列3NVTSIHSLLD EGKQSLTKLA,如 SEQ ID NO: 3 所示；
[0015]序列4EGKQSLTKLA AAffGGSGSEA,如 SEQ ID NO: 4 所示；
[0016]序列5AAWGGSGSEA YQGVQQKffDA,如 SEQ ID NO: 5 所示；
[0017]序列6YQGVQQKWDA TATELNNALQ,如 SEQ ID NO: 6 所示；
[0018]序列7TATELNNALQ NLARTISEAG,如 SEQ ID NO: 7 所示；
[0019]序列8NLARTISEAG QAMASTEGNV,如 SEQ ID NO: 8 所示；
[0020]序列9Q AMASTEGNV TGMFA,如 SEQ ID NO: 9 所示；
[0021]序列10MAEMKTDAAT LAQEAGNFER,如 SEQ ID NO: 10 所示；
[0022]序列11LAQEAGNFER IS⑶LKTQID，如 SEQ ID NO: 11 所示；
[0023]序列12IS⑶LKTQID QVESTAGSLQ,如 SEQ ID NO: 12 所示；
[0024]序列13QVESTAGSLQ GQffRGAAGTA,如 SEQ ID NO: 13 所示；
[0025]序列14GQWRGAAGTA AQAAVVRFQE,如 SEQ ID NO: 14 所示；
[0026]序列15AQAAVVRFQE AANKQKQELD,如 SEQ ID NO: 15 所示；
[0027]序列16AANKQKQELD EISTNIRQAG,如 SEQ ID NO: 16 所示；
[0028]序列17EISTNIRQAG VQYSRADEEQ,如 SEQ ID NO: 17 所示；
[0029]序列18VQYSRADEEQ QQALSSQMGF,如 SEQ ID NO: 18 所示。
[0030]本發(fā)明所述特異性抗體包括捕獲抗體和檢測(cè)抗體組成；所述捕獲抗體包括抗IP-?ο包被抗體；所述檢測(cè)抗體包括生物素標(biāo)記的抗IP-10抗體、熒光素標(biāo)記的抗IP-?ο抗體和/或抗⑶14抗體。
[0031]此外，本發(fā)明試劑盒還可以包括鏈霉親和素標(biāo)記的辣根過氧化物酶(HRP)。
[0032]所述陽性對(duì)照刺激劑指能非特異性刺激細(xì)胞產(chǎn)生IP-10的物質(zhì)。優(yōu)選為植物血凝素或乙酸肉豆蘧佛波醇。
[0033]本發(fā)明所述試劑盒診斷原理如下:受檢樣本可來自于全血、血液分離獲得物、胸水、肺泡灌洗液、淋巴結(jié)和腦脊液，如PBMC (外周血單個(gè)核細(xì)胞)分為三份，其中一份為無刺激物的陰性對(duì)照，另一份用抗原刺激以產(chǎn)生應(yīng)答樣品，第三份用PHA(植物血球凝集素，或簡(jiǎn)稱植物血凝素)或或乙酸肉豆蘧佛波醇(PMA)等刺激以作為陽性對(duì)照。用抗原刺激應(yīng)答樣品所得的ip-?ο的值減去陰性對(duì)照以確定樣本的抗原特異性免疫應(yīng)答水平，并與受試者工作特征曲線(ROC)分析獲得的參考值進(jìn)行對(duì)比。如果大于或等于參考值，則表明該受試樣本為陽性。同時(shí)，陽性對(duì)照值要求大于或等于參考值的2倍。
[0034]本發(fā)明所述檢測(cè)方法包括但不限于:胞內(nèi)細(xì)胞因子染色法(ICS)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法(ELISP0T)、Luminex、PCR/RT — PCR法、免疫熒光法、放射性免疫檢定、免疫學(xué)干燥棒、免疫色譜法、免疫雜交、免疫印記、細(xì)胞增殖和酶擴(kuò)增免疫測(cè)定技術(shù)等。[0035]在本發(fā)明的另一方面，提供該試劑盒的用途，包括該試劑盒在制備輔助診斷活動(dòng)性結(jié)核或結(jié)核潛伏感染的試劑盒中的應(yīng)用；該試劑盒在制備評(píng)價(jià)臨床抗結(jié)核治療效果的試劑盒中的應(yīng)用。
[0036]由于本發(fā)明所用抗原為結(jié)核分枝桿菌特有抗原，因而可區(qū)分結(jié)核分枝桿菌感染和BCG疫苗接種者。
[0037]本發(fā)明所述結(jié)核分枝桿菌感染人群包括有臨床癥狀的活動(dòng)性結(jié)核病人和無癥狀的潛伏感染者。此處臨床癥狀包括但不限于咳嗽，發(fā)熱，胸片異常，胸痛，咳血等。
[0038]本發(fā)明所述釋放IP-10的細(xì)胞主要為但不限于⑶14+單核細(xì)胞。
[0039]本發(fā)明所述體外診斷活動(dòng)性結(jié)核病人的方法，主要通過使用結(jié)核分枝桿菌特異性抗原或多肽體外刺激受檢樣本從而活化單個(gè)核細(xì)胞，并檢測(cè)IP-10釋放細(xì)胞的數(shù)量或培養(yǎng)上清中IP-?ο的表達(dá)量，確定結(jié)核分枝桿菌的感染情況。
[0040]本發(fā)明公開了一種體外評(píng)價(jià)臨床抗結(jié)核特異性治療效果的方法，主要通過使用結(jié)核分枝桿菌特異性抗原或多肽體外刺激治療不同時(shí)間結(jié)核病人單個(gè)核細(xì)胞，并檢測(cè)釋放IP-10細(xì)胞數(shù)量或培養(yǎng)上清中IP-?ο的分泌量，確定結(jié)核病人的臨床療效情況。
[0041]本發(fā)明所述從活動(dòng)性結(jié)核病人、正常人群以及非結(jié)核對(duì)照人群等研究對(duì)象獲得的生物學(xué)樣本包含但不限 于:血液、肺泡灌洗液、胸水、淋巴液及其它含有單個(gè)核細(xì)胞的生物學(xué)樣本。此檢測(cè)方法中釋放IP-10的細(xì)胞包括但不限于⑶14+單核細(xì)胞、⑶14 一單核細(xì)胞和T細(xì)胞等。
[0042]本發(fā)明實(shí)施方案之一中，采用胞內(nèi)細(xì)胞因子染色法(ICS)發(fā)現(xiàn)，結(jié)核分枝桿菌特異性抗原誘導(dǎo)的IP-10主要由CD14+單核細(xì)胞分泌，且ROC曲線分析表明其用于區(qū)分活動(dòng)性結(jié)核病人和正常人群的敏感性和特異性都為100%。
[0043]本發(fā)明實(shí)施方案之二中，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)方法，檢測(cè)活動(dòng)性結(jié)核病人PBMC體外經(jīng)結(jié)核分枝桿菌特異性抗原刺激后IP-10的分泌，同樣，用ROC曲線分析表明其用于區(qū)分活動(dòng)性結(jié)核病人和正常人群的敏感性和特異性都為100%。通過監(jiān)測(cè)治療過程中活動(dòng)性結(jié)核病人樣本經(jīng)核分枝桿菌特異性抗原刺激后ip-?ο的分泌量，可反映治療的療效情況，即預(yù)后情況。
[0044]經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，本發(fā)明所述試劑盒可用于診斷活動(dòng)性結(jié)核病人或結(jié)核潛伏感染者而不受接種BCG(卡介苗)的影響。本試劑盒用于活動(dòng)性結(jié)核病人診斷的敏感性和特異性均高于T-SP0T.TB商用試劑盒，均達(dá)到100%?？菇Y(jié)核治療I個(gè)月后，80%以上的臨床結(jié)核病人的檢出率轉(zhuǎn)為陰性，表明本試劑盒可用于檢測(cè)及有效評(píng)價(jià)臨床抗結(jié)核治療效果。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0045]圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中結(jié)核病人PBMC中結(jié)核分枝桿菌特異性抗原誘導(dǎo)的IP-10主要由CD14+單核細(xì)胞分泌的示意圖。圖1a為ICS檢測(cè)法代表圖，其中Blank代表未刺激樣本，Stimulant代表抗原刺激樣本，HC代表正常人樣本，TB代表結(jié)核病人樣本，細(xì)胞分析群為FSC/SSC中的單核細(xì)胞群。圖1b為ICS檢測(cè)法統(tǒng)計(jì)圖，其中，縱坐標(biāo)代表1P-1O+細(xì)胞占單核細(xì)胞的比例，HC代表正常人樣本，TB代表結(jié)核病人樣本，Non-TB代表非結(jié)核疾病對(duì)照人群，統(tǒng)計(jì)分析采用Unpaired T test方法，*#:Ρ〈0.001。圖1c為ROC曲線分析ICS法檢測(cè)抗原特異性ip-?ο用于診斷結(jié)核病人的敏感性和特異性的示意圖。[0046]圖2為本發(fā)明實(shí)施例2中結(jié)核分枝桿菌特異性抗原誘導(dǎo)PBMC表達(dá)的IP — 10具有結(jié)核病特異性的示意圖。圖2a為ELISA檢測(cè)法統(tǒng)計(jì)圖，其中HC代表正常人樣本，TB代表結(jié)核病人樣本，Non-TB代表非結(jié)核疾病對(duì)照人群,統(tǒng)計(jì)分析采用Unpaired T test方法，***:P〈0.001。圖2b為ROC曲線分析ELISA法檢測(cè)抗原特異性IP — 10用于診斷結(jié)核病人的敏感性和特異性的示意圖。
[0047]圖3為本發(fā)明實(shí)施例1和2中結(jié)核分枝桿菌特異性抗原誘導(dǎo)PBMC表達(dá)的IP —10具有臨床預(yù)后價(jià)值的示意圖。圖3a為ICS法檢測(cè)抗原特異性IP — 10用于評(píng)價(jià)臨床抗結(jié)核治療療效代表圖，圖3a為二個(gè)不同治療階段樣本經(jīng)抗原刺激(Stimulant)或無刺激陰性對(duì)照(Blank)，細(xì)胞分析群為FSC/SSC中的單核細(xì)胞群。圖3b為ICS法檢測(cè)抗原特異性IP - 10用于評(píng)價(jià)臨床抗結(jié)核治療療效統(tǒng)計(jì)圖，其中縱坐標(biāo)代表1P-1O+細(xì)胞占單核細(xì)胞的比例。圖3c為ELISA法檢測(cè)抗原特異性IP — 10用于評(píng)價(jià)臨床抗結(jié)核治療療效示意圖，其中O — I代表治療I個(gè)月以內(nèi)的結(jié)核病人樣本，1- 9代表治療I至9個(gè)月的結(jié)核病人樣本，統(tǒng)計(jì)分析采用 Unpaired T test 方法(***:Ρ〈0.001, **:Ρ〈0.01)。
【具體實(shí)施方式】
[0048]以下通過 具體的實(shí)施例進(jìn)行示例，其中所用試劑均可通過市場(chǎng)渠道購(gòu)買，如有未盡之處，可以參考相應(yīng)的分子克隆和細(xì)胞生物學(xué)等實(shí)驗(yàn)手冊(cè)。本發(fā)明所述實(shí)施方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。
[0049]實(shí)施例1:胞內(nèi)細(xì)胞因子染色法檢測(cè)抗原特異性ΙΡ-10。
[0050]實(shí)驗(yàn)步驟具體如下:
[0051]1.活動(dòng)性結(jié)核病人外周血收集于抗凝管中，并用Ficoll密度梯度離心法，分離獲得 PBMCs。
[0052]2.PBMCs 經(jīng) 5 — IOml PBS 或 RPMI1640 洗滌 2 次后，重懸于含 10% FBS 的 RPMI1640中，計(jì)算細(xì)胞數(shù)量，并調(diào)整至終濃度2.5 X 106/ml。
[0053]3.96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入100 μ I細(xì)胞懸液即0.25X IO6細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)孔中加入結(jié)核分枝桿菌特異性抗原或多肽，抗原或單條多肽終濃度為10μ g/ml，多肽庫(kù)中每條多肽終濃度為2 μ g/ml。陽性對(duì)照孔加入2.5 μ g/ml PHA,陰性孔加入相同體積的含10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基。各孔用含10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基補(bǔ)充至總體積200 μ I。
[0054]4.培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2小時(shí)，37°〇，5%0)2，100%濕度。
[0055]5.每孔加入0.2μ I蛋白運(yùn)輸阻斷劑(GoligStop，l:1000)，繼續(xù)培養(yǎng)6到12小時(shí)。
[0056]6.用 200 μ I PBS 或含 I % FBS 的 RPMI1640 洗滌 2 次。
[0057]7.PBS或RPMI1640-1% FBS配制表面染色抗體抗⑶14_PeCY7工作液，將細(xì)胞重懸于50 μ I表面抗體工作液中，于4°C避光染色30min。
[0058]8.用 200 μ I PBS 或含 I % FBS 的 RPMI1640 洗滌 2 次。
[0059]9.細(xì)胞重懸于100 μ I破膜和固定液中，于4°C避光孵育20min。
[0060]10.每孔加入200 μ I Perm/wash溶液洗漆2次。
[0061]11.用Perm/wash溶液配制胞內(nèi)染色抗體IP_10_PE工作液，細(xì)胞重懸于50 μ I胞內(nèi)抗體液中。于4°C避光孵育45min。[0062]12.每孔加入200 μ I Perm/wash溶液洗漆2次。
[0063]13.細(xì)胞重懸于100-200 μ I PBS或含有1-2% PFA的PBS中，并轉(zhuǎn)移到流式管中。于4°C避光保存至上機(jī)檢測(cè)，結(jié)果見圖1。由圖1a可知，結(jié)核分枝桿菌特異性抗原誘導(dǎo)的IP 一 10主要由⑶14+單核細(xì)胞分泌。結(jié)核病人PBMC分泌的抗原特異性IP — 10顯著高于正常對(duì)照人群(見圖lb)。胞內(nèi)細(xì)胞因子染色法中，抗原特異性誘導(dǎo)的IP — 10用于活動(dòng)性結(jié)核病人診斷的敏感性和特異性都為100% (見圖1C)。
[0064]實(shí)施例2 =ELISA檢測(cè)抗原特異性IP-10。
[0065]實(shí)驗(yàn)步驟具體如下:
[0066]1.活動(dòng)性結(jié)核病人、結(jié)核潛伏感染者、正常人以及非結(jié)核肺部疾病對(duì)照人群外周血收集于抗凝管中，并用Ficoll密度梯度離心法，分離獲得PBMCs。
[0067]2.PBMCs 用 5 — IOml PBS 或 RPMI1640 洗滌 2 次后重懸于含 10 % FBS 的 RPMI1640中，計(jì)算細(xì)胞數(shù)量，并調(diào)整至終濃度2.5 X 106/ml。
[0068]3.96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入100 μ I細(xì)胞懸液，即0.25 X IO6PBMC細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)孔中加入結(jié)核分枝桿菌特異性抗原或多肽，抗原或單條多肽終濃度為10μ g/ml，多肽庫(kù)中每條多肽終濃度為2 μ g/ml。陽性對(duì)照孔加入2.5 μ g/ml PHA,陰性孔加入相同體積的含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基。各孔用含10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基補(bǔ)充至總體積200 μ I。
[0069]4.培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20小時(shí)，371:，5%0)2，100%濕度。
[0070]5.收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，凍于_80°C保存或直接用ELISA法檢測(cè)上清中IP-10濃度。
[0071]6.96孔ELISA板中每孔加入100 μ I抗人ΙΡ-10包被抗體，4°C孵育過夜。
[0072]7.每孔加入 300 μ I PBS-0.5% Tween20 (PBST)洗滌 5 次。
[0073]8.每孔加入200 μ I ELISA封閉液于室溫封閉lh。
[0074]9.每孔加入300 μ I PBST洗滌5次。
[0075]10.每孔加入100 μ I細(xì)胞培養(yǎng)上清或標(biāo)準(zhǔn)品，室溫孵育2h。
[0076]11.每孔加入300 μ I PBST洗滌5次。
[0077]12.每孔加入100μ I生物素標(biāo)記檢測(cè)抗體及鏈親和素-辣根過氧化物酶(SAv-HRP)混合液，并于室溫孵育lh。
[0078]13.每孔加入300 μ I PBST洗滌7次。每次作用l_2min。
[0079]14.每孔加入100 μ I TMB底物，于室溫孵育30min。
[0080]15.每孔加入2N硫酸溶液100 μ 1，以終止反應(yīng)。
[0081]16.全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀于450nm處檢測(cè)吸光度(0D450)值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出各樣本數(shù)值，結(jié)果見圖2。由圖2a可見，結(jié)核病人PBMC經(jīng)結(jié)核分枝桿菌特異性抗原刺激后分泌的IP - 10水平顯著高于正常人或非結(jié)核肺部疾病對(duì)照人群(P〈0.001)。ROC曲線分析表明，抗原特異性誘導(dǎo)的IP - 10用于活動(dòng)性結(jié)核病人診斷的敏感性和特異性都為100% (見圖2b)。圖3結(jié)果表明，經(jīng)抗結(jié)核治療I個(gè)月后，結(jié)核分枝桿菌特異性抗原誘導(dǎo)PBMC分泌IP-10的水平顯著下降(P〈0.001)，其中83.3%轉(zhuǎn)為陰性水平，表明本發(fā)明試劑盒可用于檢測(cè)及有效評(píng)價(jià)臨床抗結(jié)核治療效果。
【權(quán)利要求】
1.一種用于結(jié)核分枝桿菌感染檢測(cè)及臨床治療效果監(jiān)測(cè)的試劑盒，其特征在于:該試劑盒包含: a)以下特異性抗體=IP-1O抗體和/或CD14抗體； b)抗原刺激物； c)陽性對(duì)照刺激劑。
2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述抗原刺激物為ESAT-6抗原和/或CFP-10抗原中的一條或多條多肽或其類似物。
3.如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于:所述的多肽由20個(gè)氨基酸組成，所述其類似物為與其同源性在75%以上的多肽或多肽修飾物。
4.如權(quán)利要求2或3所述的試劑盒，其特征在于:所述抗原刺激物為SEQID NO: 1-SEQID NO: 18所示序列中的一條或多條多肽。
5.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述特異性抗體包括捕獲抗體和檢測(cè)抗體組成；所述捕獲抗體包括抗IP-10包被抗體；所述檢測(cè)抗體包括生物素標(biāo)記的抗IP-10抗體、熒光素標(biāo)記的抗IP-10抗體或抗⑶14抗體。
6.如權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于，還包括鏈霉親和素標(biāo)記的辣根過氧化物酶。
7.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述陽性對(duì)照刺激劑為植物血凝素或乙酸肉豆蘧佛波醇。
8.如權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于，其檢測(cè)方法包括胞內(nèi)細(xì)胞因子染色法、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法、Luminex, PCR/RT 一 PCR法、免疫熒光法、放射性免疫檢定、免疫學(xué)干燥棒、免疫色譜法、免疫雜交、免疫印記、細(xì)胞增殖和酶擴(kuò)增免疫測(cè)定技術(shù)。
9.如權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于，其檢測(cè)樣本來自于全血、血液分離獲得物、胸水、肺泡灌洗液、淋巴結(jié)和腦脊液，樣本分為三份:一份為無刺激物的陰性對(duì)照?’另一份用抗原刺激以產(chǎn)生應(yīng)答樣品；第三份用植物血凝素刺激以作為陽性對(duì)照；用所述應(yīng)答樣品所得的IP-10的值減去陰性對(duì)照以確定樣本的抗原特異性免疫應(yīng)答水平，并與參考值進(jìn)行對(duì)比。
10.如權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述的試劑盒在制備輔助診斷活動(dòng)性結(jié)核或結(jié)核潛伏感染的試劑盒中的應(yīng)用。
11.如權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述的試劑盒在制備評(píng)價(jià)臨床抗結(jié)核治療效果的試劑盒中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK104020297SQ201410255419
【公開日】2014年9月3日 申請(qǐng)日期:2014年6月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月10日
【發(fā)明者】肖洋炯, 王穎, 沈浩 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院
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