久久一区二区免费播放,国产在线欧美日韩一区二区,国产综合色在线视频,精品伊人久久久香线蕉,精品视频麻豆网站,玖玖国产,国内精品久久久久影,在线观看精品视频一区二区三区,午夜久久影院,国产精品一区久久

一種測試細(xì)葉黃皮提取物抑菌活性的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種測試細(xì)葉黃皮提取物抑菌活性的方法，采用紙片擴(kuò)散法，抑菌測試細(xì)葉黃皮果實(shí)、葉的乙醇提取物及其石油醚部位、氯仿部位、乙酸乙酯部位對綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、殺螟桿菌、大腸桿菌的抑制作用；通過傾注平板法測定細(xì)葉黃皮根乙醇提取物及石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位對綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、殺螟桿菌、大腸桿菌的抑制作用；得出了細(xì)葉黃皮果實(shí)、葉、根的乙醇提取物及石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草桿菌及殺螟桿菌均有抑制作用，對革蘭氏陽性菌及革蘭氏陰性菌均有抑制作用，具有廣譜抑菌作用，用于消炎藥、含片、飲料、食品添加劑、濕紙巾等的制作。
【專利說明】一種測試細(xì)葉黃皮提取物抑菌活性的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于臨床醫(yī)學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種測試細(xì)葉黃皮提取物抑菌活性的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]細(xì)葉黃皮(Clausena anisum-olens (Blanco)Merr.),蕓香科植物，俗稱雞皮果，又名細(xì)葉黃皮，為柑桔亞科黃皮屬多年生常綠大灌木或小喬木，主要分布于南亞熱帶地區(qū)，主產(chǎn)我國廣西西南部、云南南部、廣東新會及越南北部和菲律賓。細(xì)葉黃皮為珍稀佳果，果皮、果肉、果仁均可食用，含有多種氨基酸、維生素及礦物質(zhì)。在藥用方面，果實(shí)可助食消暑、消積去滯、祛痰化氣、疏通腸胃；枝葉可人藥，有引氣、健胃、止痛、跌打刀傷、消風(fēng)腫、去疳積等功能。
[0003]細(xì)葉黃皮果實(shí)含17種氨基酸、多種維生素以及豐富的鐵、鈣等營養(yǎng)元素，營養(yǎng)價(jià)值高。此外，細(xì)葉黃皮枝葉、果實(shí)、根莖還具有祛痰化氣、消積消滯等藥效，有很好的保健功效。
[0004]廣西有豐富的細(xì)葉黃皮果資源，主要分布在龍州、大新、寧明、扶綏等縣。廣西西南部群眾常將其作調(diào)配香料，加工成果皮干、果醬，用于肉類、糕點(diǎn)制作的增香調(diào)料。副產(chǎn)品開發(fā)種類有限，產(chǎn)品附加值低，為促進(jìn)當(dāng)?shù)剞r(nóng)民增收，加快少數(shù)民族地區(qū)脫貧的步伐，對細(xì)葉黃皮進(jìn)行綜合利用、提高資源利用率、深層次的開發(fā)研究迫在眉睫。
[0005]目前，有關(guān)細(xì)葉黃皮的化學(xué)成分研究已有報(bào)道，(汪云松，沈月毛，何紅平.河口細(xì)葉黃皮化學(xué)成分研究[J].有機(jī)化學(xué)，2003，23(增刊):144.)等從細(xì)葉黃皮中提取分離了 5 個(gè)化合物，分別為 4_ (3-methoxyphenyl_4-0—D-glucopyanoside) _2_butanone,3- (4-hydroxyphenyl)-2-propenoic acid,3_ (3-methoxyphenyl-4-hydroxy)-2-propenoic acid,3_ (3-methoxypheny1-4-hydroxy)-2-propenoic acid,3_(3,4-dihydroxyphenyl)-2-propenoic methyl ester,3-hydroxy-4-methoxybenzoic acid。Wang Yun-song[ffangY S, Huang R, LI N Z al.Coumarins from Clausum-olens Merr[J].Biosci Biotechnol Biochem, 2010, 74(7):100143-1-2.]等從細(xì)葉黃皮中提取到 7 個(gè)化合物，分別為 anisumarin、isoscopoletin、umbelliferone、anisocoumarin H、capnolactone、aurapten 及 7_[ (E)-7' -hydroxy-3' , I' -dimethylocta-2' ，5-dienyloxy]-coumar。(蘇秀芳.GC-MS法分析雞皮果葉揮發(fā)油的化學(xué)成分[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36 (25):10956-10957.[5]蘇秀芳，梁振益.GC-MS法分析山黃皮莖根揮發(fā)油的化學(xué)成分[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥2010，21 (6):1540-1542.)等研究表明，細(xì)葉黃皮各個(gè)部分都含有豐富的揮發(fā)油，其主要成分為:芳香類、烯類及酸類。有關(guān)細(xì)葉黃皮的抑菌活性研究鮮見有報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明實(shí)施例的目的在于提供一種測試細(xì)葉黃皮提取物抑菌活性的方法，旨在解決缺少有關(guān)細(xì)葉黃皮對抑菌活性方法的問題。[0007]本發(fā)明實(shí)施例是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種測試細(xì)葉黃皮提取物抑菌活性的方法，該測試細(xì)葉黃皮提取物抑菌活性的方法包括:
[0008]采用紙片擴(kuò)散法，抑菌測試細(xì)葉黃皮果實(shí)、葉的乙醇提取物及其石油醚部位、氯仿部位及乙酸乙酯部位對綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、殺螟桿菌、大腸桿菌的抑制作用；通過傾注平板法測定細(xì)葉黃皮根乙醇提取物及其石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位對綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、殺螟桿菌、大腸桿菌的抑制作用；得出了細(xì)葉黃皮果實(shí)、葉、根乙醇提取物及其石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位對綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草桿菌、殺螟桿菌及枯草桿菌均有抑制作用。
[0009]進(jìn)一步，采用傾注平板法測試細(xì)葉黃皮提取物抑菌活性的方法包括以下步驟:
[0010]步驟一，細(xì)葉黃皮根提取物的提取，把細(xì)葉黃皮根自然晾干，粉碎，用30%的乙醇浸泡10天，減壓蒸餾至浸膏狀，得到乙醇提取物，一部分留作實(shí)驗(yàn)，一部分依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取，得到各部位浸膏，置4°C冰箱保存?zhèn)溆茫?br> [0011]步驟二，受試液的制備，分別取細(xì)葉黃皮根乙醇提取物及其石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位，用溶劑和經(jīng)滅菌處理的含5% Tween-80的蒸餾水混合，配制成系列濃度受試液，供最低抑菌濃度測定用；
[0012]步驟三，菌液的制備，分別用無菌棉簽蘸取金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、殺螟桿菌、大腸桿菌接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，于35°C下?lián)u床培養(yǎng)18h，進(jìn)行菌種活化；稀釋活化后的菌懸液，進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，取得最佳菌懸液濃度約為IO6Cfu.mL-1濃度的細(xì)胞懸浮液；
[0013]步驟四，傾注平板法測定最低抑菌濃度，用移液槍吸取不同濃度的受試液各2mL，分別放于無菌空培養(yǎng)皿內(nèi)，加入融化后并冷卻的瓊脂培養(yǎng)基13mL，最終體積為15ml，立即混勻，使4種受試液在培養(yǎng)基中的終濃度依次為40mg / mL、20mg/mL、10mg / mL、5mg / mL、
2.5mg / mL、1.25mg / mL、0.63mg/mL、0.31mg / mL、0.16mg/mL ;
[0014]步驟五，待凝固后，用移液槍從5種配置好的菌液中吸取IOOuL,放入到相應(yīng)的培養(yǎng)皿中，然后進(jìn)行均勻涂布，于35°C恒溫培養(yǎng)，24h后觀察結(jié)果；如果培養(yǎng)皿無菌落形成則說明有抑菌作用，開始明顯長菌則說明該濃度接近MIC值。
[0015]進(jìn)一步，細(xì)葉黃皮根乙醇提取物及其石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位對金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、殺螟桿菌、大腸桿菌都具有較強(qiáng)的抑制作用，三個(gè)部位對金黃色葡萄球菌的抑制作用最強(qiáng)，最低抑菌劑量分別為1.25,5.0及2.5mg / mL ;三個(gè)部位中石油醚部位對5種供試菌的最低抑菌劑量均為1.25mg / mL，其次是乙酸乙酯部位。
[0016]進(jìn)一步，采用紙片擴(kuò)散法測定測試細(xì)葉黃皮提取物抑菌活性的方法包括以下步驟:
[0017]步驟一，細(xì)葉黃皮提取物的提取，細(xì)葉黃皮果實(shí)及葉洗凈，陰干，粉碎，用30%的乙醇浸泡15天，減壓蒸餾至浸膏狀，得到乙醇提取物，一部分留作實(shí)驗(yàn)，一部分依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取，得到各部位浸膏；
[0018]步驟二，細(xì)菌懸液的制備，分別用無菌棉簽蘸取供試菌綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、殺螟桿菌、大腸桿菌接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，于35°C下?lián)u床培養(yǎng)18h，進(jìn)行菌種活化；稀釋活化后的菌懸液，并進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)；用無菌水將細(xì)菌分別配制成約IO6Cfu.mL—1濃度的細(xì)胞懸浮液。
[0019]步驟三，抑菌圈的測定，把小濾紙片放入干燥培養(yǎng)皿中，在120°C下滅菌15min ;將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，待培養(yǎng)基自然冷卻凝固后，用移液槍從每種菌種吸取lOOuL，放入到相應(yīng)的培養(yǎng)皿中，涂布均勻；將試藥浸泡過的濾紙片置于平板內(nèi)，于35°C培養(yǎng)，18?24h后觀察結(jié)果；有明顯抑菌的測抑菌圈的直徑。
[0020]進(jìn)一步，細(xì)葉黃皮果實(shí)及葉的乙醇提取物，濃度為1.32mg /片對綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、殺螟桿菌、大腸桿菌5種供試菌具有較強(qiáng)的抑制作用，果實(shí)乙醇提取物的石油醚部位、氯仿部位、乙酸乙酯部位，濃度為1.32mg /片對綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、殺螟桿菌、大腸桿菌5種供試菌有抑制作用；葉乙醇提取物的石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位在相同濃度下對綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、殺螟桿菌、大腸桿菌5種供試菌均有抑制作用。
[0021]進(jìn)一步，細(xì)葉黃皮果實(shí)乙醇提取物的石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位劑量為0.103mg/片以上時(shí)對金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、大腸桿菌、殺螟桿菌、枯草桿菌均有抑制作用，乙酸乙酯部位抑菌活性最強(qiáng)，對金黃色葡萄球菌及大腸桿菌最敏感，最小抑菌劑量分別為0.006及0.013mg /片；細(xì)葉黃皮葉石油醚、氯仿、乙酸乙酯及正丁醇部位對金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、大腸桿菌、殺螟桿菌、枯草桿菌5種供試菌均有抑制作用，其中乙酸乙酯部位對金黃色葡萄球菌抑制作用最強(qiáng)，最小抑菌劑量為0.026mg /片。
[0022]進(jìn)一步，該細(xì)葉黃皮果實(shí)、葉、根的乙醇提取物對革蘭氏陽性菌及革蘭氏陰性菌均有抑制作用，具有廣譜的抑菌作用，基于此，細(xì)葉黃皮果實(shí)、葉、根用于消炎藥、含片、飲料、果汁、食品添加劑、營養(yǎng)粉、功能食品、飼料、飼料添加劑、茶、洗面奶、早霜、晚霜、乳液、祛痘水、消炎水、面膜、洗發(fā)水(露)、洗衣液(乳)、洗衣粉、肥皂、洗手液(乳)、淋浴液(乳)、牙膏、牙膏添加劑、酒類、農(nóng)藥、殺蟲劑、消毒劑、濕紙巾的制作。
[0023]本發(fā)明提供的測試細(xì)葉黃皮提取物抑菌活性的方法，采用紙片擴(kuò)散法，抑菌測試細(xì)葉黃皮果實(shí)、葉的乙醇提取物及其石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位對綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、殺螟桿菌、大腸桿菌的抑制作用；通過傾注平板法測定細(xì)葉黃皮根乙醇提取物及其石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位對金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、殺螟桿菌、大腸桿菌的抑制作用；得出了細(xì)葉黃皮果實(shí)、葉、根的乙醇提取物及其石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草桿菌、殺螟桿菌及枯草桿菌均有抑制作用，為綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草桿菌及殺螟桿菌類疾病的臨床治療提供了參考依據(jù)。本發(fā)明的方法簡單，為利用細(xì)葉黃皮資源有著非常重要的理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，也可為今后更好地應(yīng)用于臨床提供科學(xué)依據(jù)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的采用傾注平板法測定測試細(xì)葉黃皮提取物抑菌活性的方法的流程圖；
[0025]圖2是本發(fā)明實(shí)施例提供的采用紙片擴(kuò)散法測定測試細(xì)葉黃皮提取物抑菌活性的方法的流程圖。
【具體實(shí)施方式】
[0026]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0027]下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施例對本發(fā)明的應(yīng)用原理作進(jìn)一步描述。
[0028]本發(fā)明提供的測試細(xì)葉黃皮提取物抑菌活性的方法，采用紙片擴(kuò)散法，抑菌測試細(xì)葉黃皮果實(shí)、葉的乙醇提取物及其石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位對綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、殺螟桿菌、大腸桿菌的抑制作用；得出了細(xì)葉黃皮果實(shí)的乙醇提取物及其石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位對綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯殺螟桿菌及枯草桿菌均有抑制作用；得出了細(xì)葉黃皮葉的乙醇提取物及其石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位對綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯殺螟桿菌及枯草桿菌均有抑制作用；
[0029]通過傾注平板法測定細(xì)葉黃皮根乙醇提取物及其石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位對綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、殺螟桿菌、大腸桿菌的抑制作用；
[0030]如圖1所示，本發(fā)明實(shí)施例的采用傾注平板法測試細(xì)葉黃皮提取物抑菌活性的方法包括以下步驟:
[0031]SlOl:把細(xì)葉黃皮根自然晾干，粉碎，用30%乙醇浸泡10天，減壓蒸餾至浸膏狀，得到乙醇提取物，一部分留作實(shí)驗(yàn)，一部分依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取，得到各部位浸膏，置4°C冰箱保存?zhèn)溆茫?br> [0032]S102:受試液的制備，分別取細(xì)葉黃皮根乙醇提取物及其石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位，用溶劑和經(jīng)滅菌處理的含5% Tween-80的蒸餾水混合，配制成系列濃度受試液，供最低抑菌濃度測定用；
[0033]S103:菌液的制備，分別用無菌棉簽蘸取金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、殺螟桿菌、大腸桿菌接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，于35°C下?lián)u床培養(yǎng)18h，進(jìn)行菌種活化。稀釋活化后的菌懸液，進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，取得最佳菌懸液濃度約為IO6Cfu.mL-1濃度的細(xì)胞懸浮液；
[0034]S104:傾注平板法測定最低抑菌濃度，用移液槍吸取不同濃度的受試液各2mL，分別放于無菌空培養(yǎng)皿內(nèi)，加入融化后冷卻瓊脂培養(yǎng)基13mL，其最終體積為15ml，立即混勻，使4種受試液在培養(yǎng)基中的終濃度依次為40mg / mL、20mg / mL、10mg / mL、5mg / mL、
2.5mg / mL、L 25mg/mL、0.63mg / mL、0.31mg / mL、0.16mg / mL ；
[0035]S105:待凝固后，用無菌移液槍分別吸取5種新鮮培養(yǎng)的菌液lOOuL。待培養(yǎng)基凝固后，即成含不同濃度受試品的瓊脂平板。用移液槍從5種配置好的菌液中吸取IOOuL,放入到相應(yīng)的培養(yǎng)皿中，然后進(jìn)行均勻涂布，于35°C左右恒溫培養(yǎng)，24h后觀察結(jié)果。如果培養(yǎng)皿無菌落形成則說明有抑菌作用，開始明顯長菌則說明該濃度接近MIC值。
[0036]本發(fā)明的采用傾注平板法測試細(xì)葉黃皮提取物抑菌活性的方法具體包括以下步驟:
[0037]1、材料:
[0038]SPH-210A恒溫培養(yǎng)振蕩器；LDZX_50KBS型立式電熱壓力蒸汽滅菌器；ZHJH-Cl214B型垂直流超凈工作臺；GNP_9270型隔水式恒溫培養(yǎng)箱；
[0039]氯化鈉、瓊脂粉、牛肉膏、蛋白胨、氫氧化鈉、丙酮、5% Tween-80的蒸餾水；供試菌種:綠膿桿菌，金黃色葡萄球菌，枯草桿菌，大腸桿菌，殺螟桿菌；細(xì)葉黃皮根于2010年5月采自于崇左市，自然晾干，粉碎備用；
[0040]2、方法:[0041 ] 2.1細(xì)葉黃皮根提取物的提取:
[0042]把細(xì)葉黃皮根自然晾干，粉碎，用乙醇浸泡3天，減壓蒸餾至浸膏狀，得到乙醇提取物，一部分留作實(shí)驗(yàn)，一部分依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取，得到各部位浸膏，置4°C冰箱保存?zhèn)溆茫?br> [0043]2.2受試液的制備:
[0044]分別取細(xì)葉黃皮根乙醇提取物及其石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位，用溶劑和經(jīng)滅菌處理的含5% Tween-80的蒸懼水混合,配制成系列濃度受試液,供最低抑菌濃度(MIC)測定用；
[0045]2.3菌液的制備:
[0046]分別用無菌棉簽蘸取供試菌接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，于35°C下?lián)u床培養(yǎng)18h，進(jìn)行菌種活化。稀釋活化后的菌懸液，進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，取得最佳菌懸液濃度約為IO6Cfu.mL—1濃度的細(xì)胞懸浮液；
[0047]2.4傾注平板法測定最低抑菌濃度:
[0048]用移液槍吸取不同濃度的受試液各2mL，分別放于無菌空培養(yǎng)皿內(nèi)，加入融化后冷卻的瓊脂培養(yǎng)基13mL，其最終體積為15ml，立即混勻，使4種受試液在培養(yǎng)基中的終濃度依次為 40mg / mL、20mg / mL、10mg / mL、5mg / mL、2.5mg / mL> 1.25mg / mL、0.63mg / mL、
0.3Img / mL、0.16mg / mL ;待凝固后，用無菌移液槍分別吸取5種新鮮培養(yǎng)的菌液lOOuL。待培養(yǎng)基凝固后，即成含不同濃度受試品的瓊脂平板。用移液槍從5種配置好的菌液中吸取IOOuL,放入到相應(yīng)的培養(yǎng)皿中，然后進(jìn)行均勻涂布，于35°C左右恒溫培養(yǎng)，24h后觀察結(jié)果。如果培養(yǎng)皿無菌落形成則說明有抑菌作用，開始明顯長菌則說明該濃度接近MIC值。
[0049]3、結(jié)果與分析:
[0050]按照上述試驗(yàn)方法，用溶劑與含5% Tween-80的蒸餾水混合，將細(xì)葉黃皮乙醇提取物及其石油醚、氯仿、乙酸乙酯部位依次對半稀釋，形成8個(gè)系列的濃度，做MIC試驗(yàn)研究。
[0051]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，細(xì)葉黃皮根乙醇提取物及其石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位對金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、殺螟桿菌、大腸桿菌、綠膿桿菌都具有較強(qiáng)的抑制作用。三個(gè)部位中石油醚部位對金黃色葡萄球菌的抑制作用最強(qiáng)，最低抑菌劑量分別為1.25、5.0及2.5mg / mL ;三個(gè)部位中石油醚部位對5種供試菌的低抑菌劑量均為1.25mg / mL，其次是乙酸乙酯部位。
[0052]本發(fā)明實(shí)施例的采用紙片擴(kuò)散法測定測試細(xì)葉黃皮果實(shí)、葉提取物抑菌活性的方法包括以下步驟:
[0053]S201:細(xì)葉黃皮提取物的提取，細(xì)葉黃皮果實(shí)及葉洗凈，陰干，粉碎，用30%的乙醇浸泡15天，減壓蒸餾至浸膏狀，得到乙醇提取物，一部分留作實(shí)驗(yàn)，一部分依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取，得到各部位浸膏。
[0054]S202:細(xì)菌懸液的制備，分別用無菌棉簽蘸取供試菌接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，于35°C下?lián)u床培養(yǎng)18h，進(jìn)行菌種活化。稀釋活化后的菌懸液，并進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。用無菌水將細(xì)菌分別配制成約IO6Cfu.mL—1濃度的細(xì)胞懸浮液。
[0055]S203:抑菌圈的測定,把小濾紙片放入干燥培養(yǎng)皿中，在120°C下滅菌15min。將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，待培養(yǎng)基自然冷卻凝固后，用移液槍從每種菌種吸取lOOuL，放入到相應(yīng)的培養(yǎng)皿中，涂布均勻。將試藥浸泡過的濾紙片置于平板內(nèi)，于35°C左右培養(yǎng)，18~24h后觀察結(jié)果。有明顯抑菌的測其抑菌圈的直徑。
[0056]本發(fā)明的具體步驟為:
[0057]1、儀器與材料:
[0058]1.1 儀器:
[0059]ZHJH-C1214B型垂直流超凈工作臺；LDZX_50KBS型立式電熱壓力蒸汽滅菌器；GNP-9270型隔水式恒溫培養(yǎng)箱；SPH-211B搖床培養(yǎng)箱。
[0060]1.2 菌種:
[0061]綠膿桿菌，金黃色葡萄球菌，枯草桿菌，大腸桿菌，殺螟桿菌
[0062]1.3細(xì)葉黃皮果實(shí)材料的來源:
[0063]細(xì)葉黃皮果實(shí)及葉摘自廣西龍州縣響水鎮(zhèn)。[0064]2、方法:
[0065]2.1細(xì)葉黃皮果實(shí)乙醇提取物及各部位提取物的提取:
[0066]細(xì)葉黃皮果實(shí)及葉洗凈，陰干，粉碎，用30%的乙醇浸泡15天，減壓蒸餾至浸膏狀，乙醇浸膏一部分留做抑菌實(shí)驗(yàn)，一部分依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯及正丁醇萃取，得到各部位浸膏。
[0067]2.2抑菌實(shí)驗(yàn):
[0068]2.2.1細(xì)菌懸液的制備:
[0069]分別用無菌棉簽蘸取供試菌接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，于35°C下?lián)u床培養(yǎng)18h，進(jìn)行菌種活化。稀釋活化后的菌懸液，并進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。用無菌水將細(xì)菌分別配制成約IO6Cfu.mL—1濃度的細(xì)胞懸浮液。
[0070]2.2.2抑菌圈的測定:
[0071]把小濾紙片^mm)放入干燥培養(yǎng)皿中，在120°C下滅菌15min。將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，待培養(yǎng)基自然冷卻凝固后，用移液槍從每種菌種吸取IOOuL，放入到相應(yīng)的培養(yǎng)皿中，涂布均勻。將試藥浸泡過的濾紙片置于平板內(nèi)，于35°C培養(yǎng)，18~24h后觀察結(jié)果。有明顯抑菌的測其抑菌圈的直徑。
[0072]3、結(jié)果與討論:
[0073]3.1抑菌活性初篩:
[0074]按照上述試驗(yàn)方法，發(fā)現(xiàn)細(xì)葉黃皮果實(shí)及葉的乙醇提取物對5種供試菌具有較強(qiáng)的抑制作用，為了了解抑菌物質(zhì)所存在的部位，特做了乙醇提取物的石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位初步抑菌實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，果實(shí)的乙醇提取物的石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位對5種供試菌有抑制作用；葉的乙醇提取物的石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位在相同濃度下對5種供試菌均有抑制作用。
[0075]3.2提取物的最低抑菌劑量研究:
[0076]為了了解乙醇提取物及其各個(gè)部位的抑菌活性強(qiáng)弱，用溶劑溶解乙醇提取物及其石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位，稀釋，浸泡濾紙片，按照2.2.2進(jìn)行抑菌活性檢測，同時(shí)算出濾紙片所含的藥液量。
[0077]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，細(xì)葉黃皮果實(shí)乙醇提取物的石油醚部位、氯仿部位、乙酸乙酯部位劑量為0.103mg/片以上時(shí)對金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、大腸桿菌、殺螟桿菌、枯草桿菌均有抑制作用，其中乙酸乙酯部位抑菌活性最強(qiáng)，其對金黃色葡萄球菌及大腸桿菌最敏感，最小抑菌劑量分別為0.006及0.013mg/片；細(xì)葉黃皮葉乙醇提取物的石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位對5種供試菌均有抑制作用，其中乙酸乙酯部位對金黃色葡萄球菌抑制作用最強(qiáng)，最小抑菌劑量為0.026mg /片。
[0078]4、結(jié)果:
[0079]細(xì)葉黃皮果實(shí)的乙醇提取物對革蘭氏陽性菌及革蘭氏陰性菌均有抑制作用，抑菌成分主要在石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位。乙酸乙酯部位對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌、殺螟桿菌及枯草桿菌作用較強(qiáng)，最小抑菌劑量為0.006mg /片；細(xì)葉黃皮葉乙醇提取物的石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位對5種供試菌均有抑制作用，其中乙酸乙酯部位對金黃色葡萄球菌抑制作用最強(qiáng)，最小抑菌劑量為0.026mg /片。
[0080]綠膿桿菌為革蘭氏陰性菌，其耐藥性強(qiáng)，難以尋找治療藥物，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，細(xì)葉黃皮果實(shí)乙醇提取物的氯仿部位、乙酸乙酯部位及細(xì)葉黃皮葉乙醇提取物的乙酸乙酯部位對其抑制作用較大。該細(xì)葉黃皮果實(shí)、葉、根的乙醇提取物對革蘭氏陽性菌及革蘭氏陰性菌均有抑制作用，具有廣譜的抑菌作用，基于此，細(xì)葉黃皮果實(shí)、葉、根用于消炎藥、含片、飲料、果汁、食品添加劑、營養(yǎng)粉、功能食品、飼料、飼料添加劑、茶、洗面奶、早霜、晚霜、乳液、祛痘水、消炎水、面膜、洗發(fā)水(露)、洗衣液(乳)、洗衣粉、肥皂、洗手液(乳)、淋浴液(乳)、牙膏、牙膏添加劑、酒類、農(nóng)藥、殺蟲劑、消毒劑、濕紙巾的制作。例如:如只要含有細(xì)葉黃皮(Clausena anisum-olens (Blanco)Merr.)果實(shí)、葉、根所制作的消炎藥、含片、飲料、果汁、食品添加劑、營養(yǎng)粉、功能食品、飼料、飼料添加劑、茶、洗面奶、早霜、晚霜、乳液、祛痘水、消炎水、面膜、洗發(fā)水(露)、洗衣液(乳)、洗衣粉、肥皂、洗手液(乳)、淋浴液(乳)、牙膏、牙膏添加劑、酒類、農(nóng)藥、殺蟲劑、消毒劑、濕紙巾的制作及其抑菌方法；細(xì)葉黃皮為廣西崇左市近幾年大力推廣種植的經(jīng)濟(jì)樹種，市內(nèi)加工廠有十余家。研究表明，細(xì)葉黃皮果實(shí)、葉提取物具有廣譜的抑菌作用，其作為一種植物藥，具有安全、無毒的特點(diǎn)，值得深入研究。
[0081]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種測試細(xì)葉黃皮提取物抑菌活性的方法，其特征在于，該測試細(xì)葉黃皮提取物抑菌活性的方法包括: 采用紙片擴(kuò)散法，測試細(xì)葉黃皮果實(shí)、葉的乙醇提取物及石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位對綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、殺螟桿菌、大腸桿菌的抑制作用；通過傾注平板法測定細(xì)葉黃皮根乙醇提取物及其石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位對綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、殺螟桿菌、大腸桿菌的抑制作用；得出了細(xì)葉黃皮果實(shí)、葉、根的乙醇提取物及其石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位對綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草桿菌及殺螟桿菌均有抑制作用。
2.如權(quán)利要求1所述的測試細(xì)葉黃皮提取物抑菌活性的方法，其特征在于，采用傾注平板法測試細(xì)葉黃皮根提取物抑菌活性的方法包括以下步驟: 步驟一，細(xì)葉黃皮根提取物的提取:把細(xì)葉黃皮根自然晾干，粉碎，用30%乙醇浸泡10天，減壓蒸餾至浸膏狀，得到乙醇提取物，一部分留作實(shí)驗(yàn)，一部分依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取，得到各部位浸膏，置4°C冰箱保存?zhèn)溆茫? 步驟二，受試液的制備，分別取細(xì)葉黃皮根乙醇提取物及其石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位，用溶劑和經(jīng)滅菌處理的含5% Tween-80的蒸餾水混合，配制成系列濃度受試液，供最低抑菌濃度測定用； 步驟三，菌液的制備，分別用無菌棉簽蘸取綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、殺螟桿菌、大腸桿菌接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，于35°C下?lián)u床培養(yǎng)18h，進(jìn)行菌種活化；稀釋活化后的菌懸液，進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，取得最佳菌懸液濃度約為IO6Cfi^mr1濃度的細(xì)胞懸浮液； 步驟四，傾注平板法測定最低抑菌濃度，用移液槍吸取不同濃度的受試液各2mL，分別放于無菌空培養(yǎng)皿內(nèi)，加入融化后的瓊脂培養(yǎng)基13mL，最終體積為15mL，立即混勻，使受試液在培養(yǎng)基中的終濃度依次為40mg / mL、20mg / mL>IOmg / mL、5mg / mL、2.5mg/mL、1.25mg / mL、0.63mg / mL、0.3Img / mL、0.16mg / mL ； 步驟五，待凝固后，用移液槍從5種配置好的菌液中吸取IOOuL,放入到相應(yīng)的培養(yǎng)皿中，然后進(jìn)行均勻涂布，于35°C恒溫培養(yǎng)，24h后觀察結(jié)果；如果培養(yǎng)皿無菌落形成則說明有抑菌作用，開始明顯長菌則說明該濃度接近MIC值。
3.如權(quán)利要求2所述的測試細(xì)葉黃皮提取物抑菌活性的方法，其特征在于，細(xì)葉黃皮根乙醇提取物及其石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位對綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、殺螟桿菌、大腸桿菌都具有較強(qiáng)的抑制作用，三個(gè)部位對金黃色葡萄球菌的抑制作用最強(qiáng)，最低抑菌劑量分別為1.25mg / mL、5.0mg / mL及2.5mg / mL ;三個(gè)部位中石油醚部位對四種供試菌的最低抑菌劑量均為1.25mg / mL，其次是乙酸乙酯部位。
4.如權(quán)利要求1所述的測試細(xì)葉黃皮提取物抑菌活性的方法，其特征在于，采用紙片擴(kuò)散法測試細(xì)葉黃皮果實(shí)、葉提取物抑菌活性的方法包括以下步驟: 步驟一，細(xì)葉黃皮果實(shí)、葉提取物的提取:細(xì)葉黃皮果實(shí)及葉洗凈，陰干，粉碎，用30%的乙醇浸泡15天，減壓蒸餾至浸膏狀，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取，得到各部位浸膏； 步驟二，細(xì)菌懸液的制備，分別用無菌棉簽蘸取供試菌綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、殺螟桿菌、大腸桿菌接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，于35°C下?lián)u床培養(yǎng)25h，進(jìn)行菌種活化，稀釋，并進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)；用無菌水將細(xì)菌分別配制成約IO6Cfu.mL-1濃度的細(xì)胞懸浮液； 步驟三，抑菌圈的測定，把小濾紙片放入干燥培養(yǎng)皿中，在120°C下滅菌15min ;將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，待培養(yǎng)基自然冷卻凝固后，用移液槍從每種菌種吸取lOOuL，放入到相應(yīng)的培養(yǎng)皿中，涂布均勻；將試藥浸泡過的濾紙片置于平板內(nèi)，于35°C中培養(yǎng)，24h后觀察結(jié)果；有明顯抑菌的測抑菌圈的直徑。
5.如權(quán)利要求4所述的測試細(xì)葉黃皮提取物抑菌活性的方法，其特征在于，細(xì)葉黃皮果實(shí)及葉的乙醇提取物，濃度為1.32mg/片對綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、殺螟桿菌、大腸桿菌5種供試菌具有抑制作用；果實(shí)乙醇提取物的石油醚部位、氯仿部位及乙酸乙酯部位，濃度為1.32mg/片對綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、殺螟桿菌、大腸桿菌5種供試菌有抑制作用；葉乙醇提取物的石油醚部位、氯仿部位及乙酸乙酯部位在相同濃度下對綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、殺螟桿菌、大腸桿菌5種供試菌均有抑制作用。
6.如權(quán)利要求4所述的測試細(xì)葉黃皮果實(shí)提取物抑菌活性的方法，其特征在于，細(xì)葉黃皮果實(shí)乙醇提取物的石油醚部位、氯仿部位及乙酸乙酯部位劑量為0.103mg/片以上時(shí)對金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、大腸桿菌、殺螟桿菌、枯草桿菌均有抑制作用，乙酸乙酯部位抑菌活性最強(qiáng)，對金黃色葡萄球菌及大腸桿菌最敏感，最小抑菌劑量分別為0.006及0.013mg/片；細(xì)葉黃皮葉乙醇提取物的石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位對金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、大腸桿菌、殺螟桿菌、枯草桿菌5種供試菌均有抑制作用，其中乙酸乙酯部位對金黃色葡萄球菌抑制作用最強(qiáng)，最小抑菌劑量為0.026mg/片。
7.如權(quán)利要求1所述 的測試細(xì)葉黃皮提取物抑菌活性的方法，其特征在于，該細(xì)葉黃皮果實(shí)、葉、根的乙醇提取物對革蘭氏陽性菌及革蘭氏陰性菌均有抑制作用，細(xì)葉黃皮果實(shí)、葉、根用于消炎藥、含片、飲料、果汁、食品添加劑、營養(yǎng)粉、功能食品、飼料、飼料添加劑、茶、洗面奶、早霜、晚霜、乳液、祛痘水、消炎水、面膜、洗發(fā)水(露)、洗衣液(乳)、洗衣粉、肥皂、洗手液(乳)、淋浴液(乳)、牙膏、牙膏添加劑、酒類、農(nóng)藥、殺蟲劑、消毒劑、濕紙巾的制作。
【文檔編號】G01N33/50GK103913564SQ201410142509
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2014年4月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月11日
【發(fā)明者】蘇秀芳 申請人:蘇秀芳