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一種脂肽檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種脂肽檢測(cè)方法，該方法包括以下步驟：a)將待檢測(cè)樣品溶液pH調(diào)為1～2，然后用乙醚萃取，萃取物用NaOH溶液洗滌溶解，調(diào)節(jié)所得溶解液的pH調(diào)為1～2，用乙醚二次萃取，得到待檢樣品中的脂肽提取物；b)將脂肽提取物水解得到氨基酸，氨基酸進(jìn)行硅烷化反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物用GC/MS檢測(cè)，色譜圖積分得到氨基酸(亮氨酸)峰面積；c)依據(jù)氨基酸(亮氨酸)計(jì)算脂肽含量。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明脂肽檢出限達(dá)到ppm級(jí)，解決了復(fù)雜體系中微量脂肽檢測(cè)的技術(shù)難題。
【專利說(shuō)明】一種脂肽檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種脂肽檢測(cè)方法，具體是一種復(fù)雜體系中微量脂肽的檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]脂肽是一類重要的生物表面活性劑，具有良好的表面活性及生物活性，被廣泛應(yīng)用于食品、化妝品、藥品、油田開(kāi)發(fā)等領(lǐng)域，目前已經(jīng)受到廣泛關(guān)注。
[0003]在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中，含脂肽的應(yīng)用體系一般具有如下特點(diǎn):1)由于脂肽具有較強(qiáng)的表界面活性，脂肽用量一般較低；2)為了強(qiáng)化作用效果，通常脂肽會(huì)和化學(xué)表面活性劑、聚合物等物質(zhì)復(fù)合使用；3)復(fù)合使用的體系或待分析樣品中又往往含有機(jī)酸、烴類有機(jī)物、無(wú)機(jī)鹽等雜質(zhì)。因此，對(duì)于這樣的低含量、多雜質(zhì)并存的復(fù)雜體系，準(zhǔn)確定量分析其中的微量脂肽具有非常大的技術(shù)難度。
[0004]現(xiàn)有技術(shù)檢測(cè)脂肽的方法有重量法、薄層色譜法、高效液相色譜法等方法。
[0005]重量法是利用脂肽在酸性條件下可以形成沉淀的原理，通過(guò)離心分離沉淀物，干燥稱重的方法來(lái)分析脂肽的量。由于復(fù)雜體系中雜質(zhì)較多，有些雜質(zhì)本身可以在酸性條件下沉淀，重量法測(cè)定時(shí)雜質(zhì)會(huì)對(duì)測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生很大影響，導(dǎo)致誤差較大；同時(shí)，對(duì)于脂肽含量很低(102ppm級(jí))的體系，該方法無(wú)法檢測(cè)，因此重量法是一種脂肽的常規(guī)、常量檢測(cè)方法。
[0006]薄層色譜法是采用TLC將樣品色譜分離，在層析板上得到脂肽分離的斑點(diǎn)，脂肽斑點(diǎn)采用水解及顯色劑顯色，通過(guò)定量分析斑點(diǎn)顯色情況，確定脂肽量。復(fù)雜體系中的一些化學(xué)添加劑(表面活性劑如石油磺酸鹽、烷基苯磺酸鹽，微量原油等化學(xué)雜質(zhì))，可能會(huì)影響脂肽的TLC分離，同時(shí)又會(huì)干擾脂肽水解產(chǎn)物的顯色，因此，依據(jù)斑點(diǎn)顯色進(jìn)行定量分析誤差較大，甚至導(dǎo)致檢測(cè)失敗。
[0007]高效液相色譜法檢出限較高(102ppm級(jí))，且考慮到分離效果及對(duì)色譜柱的傷害，高效液相色譜法僅適用于檢測(cè)比較純凈的脂肽樣品。而復(fù)雜體系中物質(zhì)繁雜，物質(zhì)理化性質(zhì)差異大，不僅干擾檢測(cè)，嚴(yán)重時(shí)會(huì)傷害色譜柱，導(dǎo)致柱效降低，定量不準(zhǔn)。對(duì)于復(fù)雜體系中微量的脂肽，濃度低于高效液相色譜檢出限，檢測(cè)無(wú)法進(jìn)行。此外，高效液相色譜法檢測(cè)還需要脂肽標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，而目前已知的脂肽化合物有23個(gè)族，單就考慮分子量和肽鏈部分，就有近90個(gè)不同分子化合物，如果再考慮脂肪鏈的不同，不同分子化合物的數(shù)量將更大，這進(jìn)一步加大了獲取標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的難度。即使超出檢出限，因無(wú)對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，也無(wú)法準(zhǔn)確地定量分析。由上可見(jiàn)，現(xiàn)有技術(shù)在進(jìn)行復(fù)雜體系中微量脂肽的檢測(cè)方面，存在著檢出限高、檢出能力低、樣品要求及傷害儀器等一項(xiàng)或多項(xiàng)缺陷，無(wú)法進(jìn)行準(zhǔn)確的計(jì)量檢測(cè)。
[0008]本發(fā)明利用脂肽在酸性條件下不溶，堿性條件可溶的特點(diǎn)，通過(guò)降低待檢測(cè)樣品溶液的PH，降低脂肽溶解度，在此基礎(chǔ)上采用乙醚萃取，萃取物采用堿液洗滌，將脂肽復(fù)溶到堿液中；溶解液調(diào)低PH后再次用乙醚萃取，有效地將脂肽從復(fù)雜體系中分離出來(lái)；之后將獲得的脂肽提取物水解為氨基酸，氨基酸硅烷化反應(yīng)后利用GC/MS檢測(cè)，通過(guò)定量分析其中的氨基酸(峰面積)，根據(jù)氨基酸峰面積和脂肽量的對(duì)應(yīng)關(guān)系，(脂肽中氨基酸所占的比例是確定的、已知的)，特異性地計(jì)算樣品中脂肽的量。該方法極大地提高了脂肽的檢出限，實(shí)現(xiàn)了特異性檢測(cè)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷而提供一種可定量分析的脂肽檢測(cè)方法。
[0010]本發(fā)明的目的可以通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn):一種脂肽檢測(cè)方法，其特征在于，該方法包括以下步驟:
[0011]a)將待檢測(cè)樣品溶液pH調(diào)為I?2，然后用乙醚萃取，萃取物用NaOH溶液洗滌溶解，調(diào)節(jié)所得溶解液的PH調(diào)為I?2，用乙醚二次萃取，得到待檢樣品中的脂肽提取物；
[0012]b)將脂肽提取物水解得到氨基酸，氨基酸進(jìn)行硅烷化反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物用GC/MS檢測(cè)，色譜圖積分得到氨基酸(亮氨酸)峰面積；
[0013]c)依據(jù)氨基酸(亮氨酸)計(jì)算脂肽含量。
[0014]步驟a)所述的NaOH溶液的濃度為0.2mol/L?0.8mol/L。
[0015]步驟a)所述的pH調(diào)為I?2所用的試劑為6M HCl。
[0016]步驟b)所述的脂肽提取物水解所用試劑為6M HCl，水解溫度為90?110°C，時(shí)間為20?24h。
[0017]步驟c)所述的依據(jù)氨基酸(亮氨酸)計(jì)算脂肽含量為依據(jù)GC/MS檢測(cè)到的氨基酸硅烷化反應(yīng)產(chǎn)物的峰面積與脂肽濃度關(guān)系曲線計(jì)算脂肽含量。
[0018]步驟b)所述的氨基酸進(jìn)行娃燒化反應(yīng)參照文獻(xiàn)(Quantitative Analyses of theIsoforms of Surfactin Produced by Bacillus subtilis HS0121Using GC-MS)提供的方法進(jìn)行硅烷化反應(yīng)。
[0019]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明用乙醚萃取-NaOH溶液洗滌溶解-乙醚二次萃取的方法分離得到待檢樣品中的脂肽提取物。即利用脂肽在酸性條件下不溶，堿性條件溶解的特點(diǎn)，通過(guò)降低待檢測(cè)樣品溶液的PH，降低脂肽溶解度，在此基礎(chǔ)上采用乙醚萃取，萃取物采用堿液洗滌，將脂肽復(fù)溶到堿液中；溶解液調(diào)低PH后再次用乙醚萃取，有效地將脂肽從復(fù)雜體系中分離出來(lái)；之后將獲得的脂肽提取物水解為氨基酸，氨基酸硅烷化反應(yīng)后利用GC/MS檢測(cè)，通過(guò)定量分析其中的氨基酸(峰面積)，根據(jù)氨基酸峰面積和脂肽量的對(duì)應(yīng)關(guān)系，(月旨肽中氨基酸所占的比例是確定的、已知的)，特異性地計(jì)算樣品中脂肽的量。該方法極大地提高了脂肽的檢出限，實(shí)現(xiàn)了特異性檢測(cè)。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0020]圖1為本發(fā)明技術(shù)GC/MS測(cè)定某油田現(xiàn)場(chǎng)污水配制的復(fù)雜體系樣品(實(shí)施例1)中氨基酸(亮氨酸)離子色譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0021]下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
[0022]實(shí)施例1
[0023]某油田現(xiàn)場(chǎng)污水配制的復(fù)雜體系樣品:其中含有微量脂肽、石油磺酸鹽、原油、無(wú)機(jī)鹽離子、小分子有機(jī)酸等雜質(zhì)。
[0024]取IOOmL復(fù)雜體系樣品于分液漏斗I,用鹽酸(6M)調(diào)節(jié)pH = I后乙醚萃取3次，取乙醚層于分液漏斗2。再用0.2mol/LNa0H溶液洗滌分液漏斗2中的萃取物3次，取堿液層于分液漏斗3。最后再用鹽酸(6M)調(diào)節(jié)分液漏斗3中的樣品至pH = 1.5，調(diào)節(jié)后用乙醚萃取3次，取乙醚層于安培瓶中，吹干乙醚，獲得脂肽提取物。向提取出的脂肽提取物中加Λ 0.5mL6M HC1，90°C水解24h。反應(yīng)完畢后，水解液全部轉(zhuǎn)移至氣質(zhì)小瓶，完全干燥后，參照文獻(xiàn)(Quantitative Analyses of the Isoforms of Surfactin Produced by Bacillussubtilis HS0121Using GC-MS)提供的方法進(jìn)行硅烷化反應(yīng)。所得硅烷化產(chǎn)物采用Agilent的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(6890GC，5975MSD)進(jìn)行檢測(cè)，色譜圖積分得到氨基酸(亮氨酸)峰面積為3.002(單位:Χ106μ V.S)，如圖1。由亮氨酸峰面積(y，單位:Χ106μν.S)與脂肽含量(X，單位:g/L)關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)工作曲線I = 3.2043X+0.0045，計(jì)算可得分析樣品中脂肽含量為:0.935g/L(935ppm)。
[0025]實(shí)施例2
[0026]聚驅(qū)油田產(chǎn)出液樣品:其中含有微量脂肽、聚合物、原油、無(wú)機(jī)鹽離子、短鏈脂肪酸等雜質(zhì)。
[0027]取IOOmL復(fù)雜體系樣品于分液漏斗1，用鹽酸(6M)調(diào)節(jié)pH = 1.5后乙醚萃取3次，取乙醚層于分液漏斗2。再用0.4mol/L NaOH溶液洗滌分液漏斗2中的萃取物3次，取堿液層于分液漏斗3。最后再用鹽酸(6M)調(diào)節(jié)分液漏斗3中的樣品至pH = 1.0,乙醚萃取3次，取乙醚層于安培瓶中，吹干乙醚，獲得脂肽提取物。向提取出的脂肽提取物中加入0.5mL6M HC1，90°C水解24h。反應(yīng)完畢后，水解液全部轉(zhuǎn)移至氣質(zhì)小瓶，完全干燥后，參照文獻(xiàn)(Quantitative Analyses of the Isoforms of Surfactin Produced by Bacillussubtilis HS0121Using GC-MS)提供的方法進(jìn)行硅烷化反應(yīng)。所得硅烷化產(chǎn)物采用Agilent的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀^890GC，5975MSD)進(jìn)行檢測(cè)。得到氨基酸(亮氨酸)峰面積為0.402 (單位:X IO6 μ V.S)，由亮氨酸峰面積(y，單位:X IO6 μ V.S)與脂肽含量(X，單位:g/L)關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)工作曲線y = 3.2043X+0.0045，計(jì)算可得分析樣品中脂肽含量為:0.124g/L(124ppm)。
[0028]實(shí)施例3[0029]復(fù)雜體系樣品:微量脂肽、烷基苯磺酸鹽、原油、無(wú)機(jī)鹽離子、雜質(zhì)。
[0030]取IOOmL復(fù)雜體系樣品于分液漏斗1，用鹽酸(6M)調(diào)節(jié)pH = 2后乙醚萃取3次，取乙醚層于分液漏斗2。再用0.6mol/LNa0H溶液洗滌分液漏斗2中的萃取物3次，取堿液層于分液漏斗3。最后再用鹽酸(6M)調(diào)節(jié)分液漏斗3中的樣品至pH = 1.6，乙醚萃取3次，取乙醚層于安培瓶中，吹干乙醚，獲得脂肽提取物。向提取出的脂肽提取物中加入0.5mL6M HC1，100°C水解22h。反應(yīng)完畢后，水解液全部轉(zhuǎn)移至氣質(zhì)小瓶，完全干燥后，參照文獻(xiàn)(Quantitative Analyses of the Isoforms of Surfactin Produced by Bacillussubtilis HS0121Using GC-MS)提供的方法進(jìn)行硅烷化反應(yīng)。所得硅烷化產(chǎn)物采用Agilent的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀^890GC，5975MSD)進(jìn)行檢測(cè)。得到氨基酸(亮氨酸)峰面積為
0.024 (單位:X IO6 μ V.S)，由亮氨酸峰面積(y，單位:X IO6 μ V.S)與脂肽含量(X，單位:g/L)關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)工作曲線y = 3.2043X+0.0045，計(jì)算可得分析樣品中脂肽含量為:0.0061g/L (6.1 ppm) ο[0031]實(shí)施例4
[0032]復(fù)雜體系樣品:微量脂肽、石油磺酸鹽、聚合物、無(wú)機(jī)鹽離子、雜質(zhì)
[0033]取IOOmL復(fù)雜體系樣品于分液漏斗I,用鹽酸(6M)調(diào)節(jié)pH = 2后乙醚萃取3次，取乙醚層于分液漏斗2。再用0.8mol/L NaOH溶液洗滌分液漏斗2中的萃取物3次，取堿液層于分液漏斗3。最后再用鹽酸(6M)調(diào)節(jié)分液漏斗3中的樣品至pH =2，乙醚萃取3次，取乙醚層于安培瓶中，吹干乙醚，獲得脂肽提取物。向提取出的脂肽提取物中加入
0.5mL6M HC1，110°C水解20h。反應(yīng)完畢后，水解液全部轉(zhuǎn)移至氣質(zhì)小瓶，完全干燥后，參照文獻(xiàn)(Quantitative Analyses of the Isoforms of Surfactin Produced by Bacillussubtilis HS0121Using GC-MS)提供的方法進(jìn)行硅烷化反應(yīng)。所得硅烷化產(chǎn)物采用Agilent的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀^890GC，5975MSD)進(jìn)行檢測(cè)。得到氨基酸(亮氨酸)峰面積為
0.232 (單位:X IO6 μ V.S)，由亮氨酸峰面積(y，單位:X IO6 μ V.S)與脂肽含量(X，單位:g/L)關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)工作曲線y = 3.2043X+0.0045，計(jì)算可得分析樣品中脂肽含量為:0.071g/L(71ppm)。`
【權(quán)利要求】
1.一種脂肽檢測(cè)方法，其特征在于，該方法包括以下步驟: a)將待檢測(cè)樣品溶液pH調(diào)為I?2，然后用乙醚萃取，萃取物用NaOH溶液洗滌溶解，調(diào)節(jié)所得溶解液的PH調(diào)為I?2，用乙醚二次萃取，得到待檢樣品中的脂肽提取物； b)將脂肽提取物水解得到氨基酸，氨基酸進(jìn)行硅烷化反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物用GC/MS檢測(cè)，色譜圖積分得到氨基酸(亮氨酸)峰面積； c)依據(jù)氨基酸(亮氨酸)計(jì)算脂肽含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種脂肽檢測(cè)方法，其特征在于，步驟a)所述的NaOH溶液的濃度為 0.2mol/L ?0.8mol/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種脂肽檢測(cè)方法，其特征在于，步驟a)所述的pH調(diào)為I?2所用的試劑為6M HCl。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種脂肽檢測(cè)方法，其特征在于，步驟b)所述的脂肽提取物水解所用試劑為6M HCl，水解溫度為90?110°C，時(shí)間為20?24h。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種脂肽檢測(cè)方法，其特征在于，步驟c)所述的依據(jù)氨基酸(亮氨酸)計(jì)算脂肽含量為依據(jù)GC/MS檢測(cè)到的氨基酸硅烷化反應(yīng)產(chǎn)物的峰面積與脂肽濃度關(guān)系曲線計(jì)算脂肽含量。
【文檔編號(hào)】G01N30/02GK103743841SQ201410020272
【公開(kāi)日】2014年4月23日 申請(qǐng)日期:2014年1月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月16日
【發(fā)明者】牟伯中, 楊世忠, 劉金峰, 剛洪澤, 朱原意 申請(qǐng)人:華東理工大學(xué)