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一種電致化學(xué)發(fā)光成像裝置及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種電致化學(xué)發(fā)光成像裝置，包括物鏡、光傳輸通道、單光子檢測(cè)電子倍增CCD和電致化學(xué)發(fā)光發(fā)生器，所述電致化學(xué)發(fā)光發(fā)生器包括ITO電極、銀電極和電壓發(fā)生器，其中，所述物鏡、光傳輸通道和單光子檢測(cè)電子倍增CCD依次連接；所述ITO電極與電壓發(fā)生器相連的正極連接，所述銀電極與電壓發(fā)生器的負(fù)極連接。本發(fā)明還提出了一種上述電致化學(xué)發(fā)光成像裝置在可視化檢測(cè)雙氧水中的應(yīng)用以及該裝置在可視化檢測(cè)單細(xì)胞表面外泄雙氧水和可視化檢測(cè)細(xì)胞表面分子上的應(yīng)用。本發(fā)明的電致化學(xué)發(fā)光成像裝置組成簡(jiǎn)單，可進(jìn)行平行快速檢測(cè)，檢測(cè)通量大，操作簡(jiǎn)便，發(fā)光效率高。
【專利說明】一種電致化學(xué)發(fā)光成像裝置及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物化工【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地涉及一種電致化學(xué)發(fā)光成像裝置及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]應(yīng)用電化學(xué)技術(shù)對(duì)單細(xì)胞進(jìn)行成像研究可以得到細(xì)胞表面化學(xué)組分和局部活性等重要生物信息，目前最通用的顯微儀器為電化學(xué)掃描顯微鏡。這個(gè)顯微鏡是利用一根微電極掃描單一活細(xì)胞的表面來檢測(cè)具有電活性的化學(xué)物種。通過降低電極尺寸至納米級(jí)別可使得電化學(xué)掃描顯微鏡的空間分辨率達(dá)到納米級(jí)別。該技術(shù)的缺陷在于:每一個(gè)細(xì)胞表面必須單一獨(dú)立檢測(cè)，因此檢測(cè)的通量被嚴(yán)重限制。作為除了電化學(xué)掃描顯微鏡的另一種選擇，近期發(fā)展的基于表面等離子共振的電化學(xué)成像技術(shù)利用了局部的電化學(xué)信號(hào)和表面等離子共振信號(hào)之間的關(guān)系來進(jìn)行單細(xì)胞成像。雖然這種新技術(shù)通過對(duì)多細(xì)胞的平行檢測(cè)提高了檢測(cè)通量，但是表面等離子共振技術(shù)由于自身檢測(cè)靈敏度差，因此很難對(duì)單細(xì)胞中外泄的生物分子或者細(xì)胞表面低豐度分子進(jìn)行檢測(cè)。
[0003]電致化學(xué)發(fā)光是一種高靈敏的電化學(xué)方法。它利用電化學(xué)反應(yīng)激發(fā)的物質(zhì)從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)的同時(shí)，發(fā)射光來實(shí)現(xiàn)對(duì)分子的檢測(cè)。鑒于整個(gè)電極表面生物分子產(chǎn)生的光都會(huì)被單光子檢測(cè)電子倍增電子耦合元件(CCD)接收，因此基于電致化學(xué)發(fā)光的成像技術(shù)具有高通量和高靈敏度的優(yōu)勢(shì)，具備目前兩種單細(xì)胞用電化學(xué)成像技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)?，F(xiàn)有電致化學(xué)發(fā)光成像已經(jīng)用于對(duì)電極表面的模糊指紋和蛋白質(zhì)層的成像。最新技術(shù)可對(duì)微球表面的抗原成像。該技術(shù)通過引入濃度高達(dá)毫摩爾級(jí)別的共反應(yīng)物，就可以在0.4微米的區(qū)域中產(chǎn)生能夠檢測(cè)到的光信號(hào)，進(jìn)而將空間分辨率推到亞微米級(jí)別。
[0004]雖然電致化學(xué)發(fā)光成像技術(shù)顯示具有對(duì)細(xì)胞表面抗原成像的潛力，我們?cè)趯⒋隧?xiàng)技術(shù)用于對(duì)單細(xì)胞分子外泄過程進(jìn)行成像時(shí)受到了挑戰(zhàn)。因?yàn)獒尫懦龅姆肿訚舛确浅５?，通常是在微摩?jí)別。雖然在魯米諾存在的情況下，這些釋放出的分子通過其氧化酶而轉(zhuǎn)變成可電致化學(xué)發(fā)光的雙氧水，但要實(shí)現(xiàn)在亞微米的區(qū)域中，且加上秒級(jí)別的采樣時(shí)間(時(shí)間分辨率)范圍內(nèi)，對(duì)如此低濃度的生物分子獲取可檢測(cè)的光信號(hào)，還是不太可能的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]發(fā)明目的:為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題，本發(fā)明提出一種構(gòu)造簡(jiǎn)單，收光效率高，可實(shí)現(xiàn)對(duì)單細(xì)胞中外泄的生物分子或者細(xì)胞表面低豐度分子進(jìn)行檢測(cè)的電致化學(xué)發(fā)光成像裝置及其應(yīng)用。
[0006]技術(shù)內(nèi)容:為實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的，本發(fā)明提出一種電致化學(xué)發(fā)光成像裝置，包括物鏡、光傳輸通道、單光子檢測(cè)電子倍增CCD和電致化學(xué)發(fā)光發(fā)生器，所述電致化學(xué)發(fā)光發(fā)生器包括ITO電極銀電極和電壓發(fā)生器，其中，所述物鏡、光傳輸通道和單光子檢測(cè)電子倍增CCD依次連接；所述ITO電極與電壓發(fā)生器的正極相連，所述銀電極和電壓發(fā)生器的負(fù)極相連。[0007]其中，所述物鏡為5倍鏡、10倍鏡、20倍鏡、40倍鏡和100倍鏡中的任意一種，物鏡的N.A.越大越好。優(yōu)選地，所述物鏡為N.A.為0.50的20倍鏡。根據(jù)對(duì)空間分辨率的要求選擇合適的物鏡及其N.A值。
[0008]本發(fā)明還提出了上述的電致化學(xué)發(fā)光成像裝置在可視化檢測(cè)雙氧水中的應(yīng)用。
[0009]具體地，所述應(yīng)用包括如下步驟:在ITO玻璃片的表面粘貼O型圈作為溶液室，以ITO玻璃片為工作電極，銀電極為對(duì)電極，將發(fā)光試劑和雙氧水加入到O型圈內(nèi)，在單光子檢測(cè)電子倍增CCD曝光的同時(shí)向ITO電極施加周期性的發(fā)光電壓-恢復(fù)電壓，檢測(cè)成像效
果O
[0010]其中，所述的發(fā)光試劑為所述的發(fā)光試劑為L(zhǎng)012、魯米諾、N-(4-氨基丁基)-N-乙基異魯米諾，N-(6-氨基已基)-N-乙基異魯米諾、異硫氰酸異魯米諾中的任意一種，用量為濃度為100 μ M?500 μ Μ，優(yōu)選地發(fā)光試劑為L(zhǎng)O12，發(fā)光試劑的用量為100 μ M?500 μ Μ，優(yōu)選地為200 μ M0
[0011]其中，所述雙氧水的檢測(cè)范圍為10?200 μ Μ。
[0012]優(yōu)選地，單光子檢測(cè)電子倍增CCD曝光的時(shí)間為兩個(gè)發(fā)光電壓-恢復(fù)電壓周期，其中，一個(gè)發(fā)光電壓-恢復(fù)電壓周期為:發(fā)光電壓:1.0±0.1V的正電壓下2±ls ;恢復(fù)電壓:-1.0±0.1V的負(fù)電壓下0.5±0.25s。更為優(yōu)選地，所述周期性的發(fā)光電壓-恢復(fù)電壓的一個(gè)周期為:發(fā)光電壓:1.0V的正電壓下2s ;恢復(fù)電壓:-1.0V的負(fù)電壓下0.5s。
[0013]本發(fā)明還提出了上述裝置在可視化檢測(cè)單細(xì)胞表面外泄雙氧水中的應(yīng)用。
[0014]具體地，所述可視化檢測(cè)單細(xì)胞表面外泄雙氧水的步驟包括:在ITO玻璃片的表面粘貼O型圈作為溶液室，以ITO玻璃片為工作電極，銀電極為對(duì)電極，將細(xì)胞在溶液室中培養(yǎng)，向溶液室中加入發(fā)光試劑，然后加入PMA刺激細(xì)胞內(nèi)的NADPA氧化酶使細(xì)胞表面產(chǎn)生雙氧水，在單光子檢測(cè)電子倍增CCD曝光的同時(shí)向ITO電極施加周期性的發(fā)光電壓-恢復(fù)電壓，檢測(cè)成像效果。
[0015]其中，所述的發(fā)光試劑為L(zhǎng)012、魯米諾、N-(4_氨基丁基)-N-乙基異魯米諾，N-(6-氨基已基)-N-乙基異魯米諾和異硫氰酸異魯米諾中的任意一種，用量為100 μ M?500 μ Mo優(yōu)選地發(fā)光試劑為L(zhǎng)012，發(fā)光試劑的用量為ΙΟΟμΜ?500μΜ，優(yōu)選地為200 μ Μ。
[0016]優(yōu)選地，單光子檢測(cè)電子倍增CCD曝光的時(shí)間為兩個(gè)發(fā)光電壓-恢復(fù)電壓周期，其中，一個(gè)發(fā)光電壓-恢復(fù)電壓周期為:發(fā)光電壓:1.0±0.1V的正電壓下2±ls ;恢復(fù)電壓:-1.0±0.1V的負(fù)電壓下0.5±0.25s。更為優(yōu)選地，所述周期性的發(fā)光電壓-恢復(fù)電壓的一個(gè)周期為:發(fā)光電壓:1.0V的正電壓下2s ;恢復(fù)電壓:-1.0V的負(fù)電壓下0.5s。
[0017]本發(fā)明還提出了上述裝置在可視化檢測(cè)細(xì)胞表面分子上的應(yīng)用。
[0018]具體地，包括如下步驟:在ITO玻璃片的表面粘貼O型圈作為溶液室，以ITO玻璃片為工作電極，銀電極為對(duì)電極，將細(xì)胞在溶液室中培養(yǎng)，向溶液室中加入發(fā)光試劑，利用細(xì)胞表面的待測(cè)分子對(duì)應(yīng)的氧化酶將所述待測(cè)分子轉(zhuǎn)化為雙氧水，在單光子檢測(cè)電子倍增CCD曝光的同時(shí)向ITO電極施加周期性的發(fā)光電壓-恢復(fù)電壓，檢測(cè)成像效果。
[0019]其中，所述的發(fā)光試劑為L(zhǎng)012、魯米諾、N-(4_氨基丁基)-N-乙基異魯米諾，N-(6-氨基已基)-N-乙基異魯米諾和異硫氰酸異魯米諾中的任意一種，用量為100 μ M?500 μ Mo優(yōu)選地發(fā)光試劑為L(zhǎng)012，發(fā)光試劑的用量為ΙΟΟμΜ?500μΜ，優(yōu)選地為200μΜ。
[0020]優(yōu)選地，單光子檢測(cè)電子倍增CCD曝光的時(shí)間為兩個(gè)發(fā)光電壓-恢復(fù)電壓周期，其中，一個(gè)發(fā)光電壓-恢復(fù)電壓周期為:發(fā)光電壓:1.0±0.1V的正電壓下2±ls ;恢復(fù)電壓:-1.0±0.1V的負(fù)電壓下0.5±0.25s。更為優(yōu)選地，所述周期性的發(fā)光電壓-恢復(fù)電壓的一個(gè)周期為:發(fā)光電壓:1.0V的正電壓下2s ;恢復(fù)電壓:-1.0V的負(fù)電壓下0.5s。
[0021]有益效果:與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明有如下優(yōu)點(diǎn):
[0022](I)本發(fā)明的電致化學(xué)發(fā)光成像裝置組成簡(jiǎn)單，收光率高，可進(jìn)行平行快速檢測(cè)，且檢測(cè)的空間分辨率可以通過物鏡倍率和單光子檢測(cè)電子倍增CCD進(jìn)行調(diào)節(jié)，并通過電位調(diào)節(jié)來促進(jìn)發(fā)光效率，獲取可檢測(cè)的信號(hào)，同時(shí)，可以直接將培養(yǎng)細(xì)胞的ITO電極放置于顯微鏡平臺(tái)上檢測(cè)，不用進(jìn)一步修飾電極，因此可以方便的將本電致化學(xué)發(fā)光發(fā)光分析技術(shù)用于生物研究，且可以同時(shí)獲得ITO表面所有細(xì)胞的發(fā)光信息從而加大了檢測(cè)的通量，對(duì)于單細(xì)胞檢測(cè)具有重要意義。
[0023](2)通過在電致化學(xué)發(fā)光檢測(cè)的過程中加載周期性的發(fā)光電壓和恢復(fù)電壓，可以避免在電極上持續(xù)施加高壓會(huì)導(dǎo)致電極失活，提高發(fā)光效率。
[0024](3)本發(fā)明的電致化學(xué)發(fā)光成像方法可以有效地檢測(cè)低濃度的雙氧水，且具有高的電致化學(xué)方法精確度，并可以檢測(cè)單細(xì)胞表面雙氧水的外泄，從而可以為不同狀態(tài)下的細(xì)胞釋放的雙氧水提供其存在的亞微米分布的證據(jù)。
[0025](4)本發(fā)明的電致化學(xué)發(fā)光成像方法可以為藥物分析提供活化膜膽固醇的分布信息，通過對(duì)細(xì)胞活化膽固醇的成像為細(xì)胞膽固醇運(yùn)輸研究提供了更多的生物學(xué)信息。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1為本發(fā)明的電致化學(xué)發(fā)光成像裝置的示意圖；
[0027]圖2為組合電壓膜式和恒電壓膜式對(duì)雙氧水發(fā)光檢測(cè)的影響；
[0028]圖3為不同的電壓頻率和不同的曝光時(shí)間對(duì)成像信噪比的影響；
[0029]圖4為溶液中雙氧水的可視化檢測(cè)，其中，A為ITO電極的膠帶覆蓋區(qū)域和裸露區(qū)域的邊界的明場(chǎng)照片；B為加入200 μ M L012后的發(fā)光圖；C為加入200 μ M 1^012和1(^皿雙氧水的發(fā)光圖；D為C和B圖的差分偽彩色圖；E為不同濃度雙氧水和發(fā)光強(qiáng)度之間的關(guān)系圖；
[0030]圖5為細(xì)胞表面雙氧水外泄的可視化檢測(cè)，其中，A為ITO電極上的Hela細(xì)胞圖的明場(chǎng)照片為加入200 μ M L012的發(fā)光圖；C為細(xì)胞經(jīng)過PMA刺激的發(fā)光圖；D為圖B和C之間的發(fā)光差分圖；E為明場(chǎng)照片和差分照片的疊加圖丨為細(xì)胞外泄雙氧水的偽彩色圖；
[0031]圖6為ITO電極上的Hela細(xì)胞加入PBS緩沖液的檢測(cè)示意圖，其中，A為明場(chǎng)照片；B為加入200 μ M L012的發(fā)光成像圖；C為200 μ M L012中加入PBS (IOmM)的發(fā)光成像圖；D為圖B和圖C的發(fā)光成像差分圖；其中，亮度調(diào)節(jié)到了最佳可視程度；
[0032]圖7為ITO電極上ACAT被抑制的Hela細(xì)胞在200 μ M L012存在下的檢測(cè)圖像，其中A為明場(chǎng)照片；Β為加入膽固醇氧化酶前后的發(fā)光差分圖；C為圖A和B的疊加圖;?為選中的兩個(gè)細(xì)胞的活化膜膽固醇的分布的偽彩色圖；Ε為ACAT和HMGCoA共同被抑制的細(xì)胞在加入膽固醇氧化酶前后的發(fā)光差分圖；F為ACAT被抑制的細(xì)胞和ACAT、HMGCoA共同被抑制的細(xì)胞發(fā)光強(qiáng)度柱狀圖；其中，圖中的偏差為圖B和圖E中細(xì)胞區(qū)域的發(fā)光強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)偏差;
[0033] 圖8為ITO電極上ACAT、HMGCoA同時(shí)被抑制的Hela細(xì)胞加入200 μ M L012的檢測(cè)圖像，其中，A為明場(chǎng)照片；B為加入IU / ml膽固醇氧化酶前后發(fā)光差分圖《為明場(chǎng)圖和差分圖的疊加圖。
【具體實(shí)施方式】
[0034]本發(fā)明的電致化學(xué)發(fā)光成像裝置的示意圖如圖1所示，包括物鏡、光傳輸通道、單光子檢測(cè)電子倍增CCD和電致化學(xué)發(fā)光發(fā)生器，所述電致化學(xué)發(fā)光發(fā)生器包括ITO電極、銀電極和電壓發(fā)生器，其中，物鏡、光傳輸通道和單光子檢測(cè)電子倍增CXD依次連接，所述ITO電極與電壓發(fā)生器的正極相連，銀電極和電壓發(fā)生器的負(fù)極相連。在下述各實(shí)施例中，除非另外說明，各個(gè)ITO電極上粘貼的作為溶液室的O型圈的直徑均為1cm，檢測(cè)的溶液量為600 μ L。
[0035]實(shí)施例1溶液中雙氧水的可視化檢測(cè)。
[0036](I)檢測(cè)條件的確定。
[0037]在實(shí)驗(yàn)中，在氧化銦錫(ITO)玻璃片上粘貼直徑為Icm的O型圈作為溶液室，并以該ITO玻璃片為工作電極，選擇L012作為正電壓下的發(fā)光物質(zhì)。L012是一種魯米諾類似物，在雙氧水存在下具有比魯米諾更高的發(fā)光效果，所以被選作正電壓下的發(fā)光物質(zhì)。向O型圈內(nèi)滴加200 μ M的L012和100 μ M的雙氧水，共計(jì)600 μ L。鑒于L012和雙氧水在ITO玻璃電極上的發(fā)光峰值電壓為1.0V(其中，1.0V為雙氧水在ITO電極表面上電分解的峰值電壓，然后產(chǎn)生的氧自由基使得L012發(fā)光，所以對(duì)不同的發(fā)光試劑，發(fā)光峰值電壓都差不多，因此，對(duì)于其他的發(fā)光試劑，如魯米諾、N-(4-氨基丁基)-N-乙基異魯米諾，N-(6-氨基已基)-N-乙基異魯米諾、異硫氰酸異魯米諾等的發(fā)光電壓均在0.9V?1.1V之間)，因此在CCD曝光的同時(shí)在電極上施加1.0V恒電壓使得L012和雙氧水得到最大的發(fā)光強(qiáng)度。然而，在電極上持續(xù)施加這樣的高壓會(huì)導(dǎo)致電極失活，不利于發(fā)光。為了避免電極失活，我們?cè)陔姌O上施加一個(gè)負(fù)電壓-1.0V，使得電極更新恢復(fù)。因此電極電壓采用1.0V和-1.0V轉(zhuǎn)換模式來獲得更多的發(fā)光信號(hào)。每一個(gè)電壓轉(zhuǎn)換周期包括2s的1.0V電壓,再轉(zhuǎn)換施加0.5s的-1.0V電壓。和恒電壓模式相比，這種組合電壓模式可以使得L012-雙氧水獲得更強(qiáng)的發(fā)光效果(如圖2所示)。這種組合電壓模式對(duì)發(fā)光效果的放大表明了它對(duì)于ECL成像的重要性。發(fā)光效果會(huì)因?yàn)槠毓鈺r(shí)間的延長(zhǎng)進(jìn)一步得到增強(qiáng)。但是對(duì)于單細(xì)胞成像來說，最短的曝光時(shí)間可以獲得更好的時(shí)間分辨率。為了平衡這兩個(gè)參數(shù)比較了不同的電壓頻率和不同的曝光時(shí)間對(duì)成像信噪比的影響，如圖3所示。最終我們選擇了 5s的曝光時(shí)間，也就是兩個(gè)電壓周期作為成像實(shí)驗(yàn)的參數(shù)。
[0038](2)電致化學(xué)發(fā)光成像裝置可視化檢測(cè)雙氧水。
[0039]用一張膠帶貼在ITO玻璃片表面，利用加電壓條件下裸露的ITO會(huì)發(fā)光，而被膠帶覆蓋的地方不會(huì)發(fā)光這樣的現(xiàn)象，來驗(yàn)證用本發(fā)明的電致化學(xué)發(fā)光成像裝置來可視化檢測(cè)雙氧水是可行的。圖4A顯示了明場(chǎng)下玻璃裸露區(qū)域和膠帶區(qū)域的邊界。在玻璃裸露區(qū)域和膠帶區(qū)域的邊界處粘貼Icm的O型圈作為溶液室，使玻璃裸露區(qū)域和膠帶區(qū)域各占一半。在無雙氧水的情況下，L012會(huì)在電壓作用下自發(fā)光，向ITO表面的O型溶液室內(nèi)加入200 μ M的L012，記錄在黑暗環(huán)境下L012的背景光。結(jié)果如圖4Β所示。和預(yù)期的一樣，在ITO裸露區(qū)域拍到了微弱的發(fā)光，而膠帶區(qū)域則是全黑。當(dāng)加入了 10 μ M的雙氧水之后，繼續(xù)在黑暗環(huán)境下拍照(圖4C)。為了測(cè)定雙氧水產(chǎn)生的發(fā)光強(qiáng)度，利用軟件Image J來計(jì)算圖4B與圖4C之間的差別，差分圖用偽彩色染色之后，如圖4D所示。由L012和雙氧水產(chǎn)生的反應(yīng)導(dǎo)致在ITO裸露區(qū)域得到更高的光強(qiáng)，證明我們的系統(tǒng)能夠有效的觀測(cè)到低濃度的雙氧水。明場(chǎng)照片和發(fā)光差分圖的膠帶邊緣形狀的一致性說明電致化學(xué)發(fā)光成像的精確度。在ITO區(qū)域隨機(jī)選取直徑為50 μ m的區(qū)域計(jì)算發(fā)光強(qiáng)度，得到的光強(qiáng)相對(duì)偏差為2.63%。得到的光強(qiáng)的均一性保證了檢測(cè)在ITO不同區(qū)域培養(yǎng)細(xì)胞，并進(jìn)行成像分析的精確性。
[0040]本發(fā)明電致化學(xué)發(fā)光成像裝置的空間分辨率由物鏡和CXD控制。盡管擁有較大數(shù)值孔徑(N.A.)的高倍率物鏡可以增加收光效率，越高放大倍率會(huì)導(dǎo)致每個(gè)像素呈現(xiàn)的實(shí)際尺寸越小，從而使得每個(gè)像素得到的光強(qiáng)降低至檢測(cè)限以下。在本檢測(cè)體系中，物鏡是N.A為0.50的20倍鏡作為最佳選擇。同時(shí)，為了收集弱發(fā)光，采用了低分辨率(512X512)的單光子檢測(cè)電子倍增CXD (EM (XD)。由于CXD每個(gè)像素16 μ m,物鏡為20倍放大，所以計(jì)算得到檢測(cè)體系的空間分辨率為0.8 μ m。本成像裝置可以通過增大物鏡倍率實(shí)現(xiàn)0.4 μ m的成像質(zhì)量，但是需要通過延長(zhǎng)曝光時(shí)間或者增加雙氧水濃度來獲得?？紤]到我們需要低檢測(cè)限和短曝光時(shí)間，物鏡的倍率仍然被固定在20倍，所獲取的0.8 μ m的空間分辨率也適合于單細(xì)胞分析。
[0041](3)雙氧水的濃度和組合電壓對(duì)ECL成像的影響。
[0042]為了檢測(cè)雙氧水濃度和發(fā)光強(qiáng)度之間的關(guān)系，固定L012的濃度為200 μ Μ，在檢測(cè)體系中不斷升高雙氧水濃度并完成成像過程。在扣除了沒有雙氧水存在的背景光之后，發(fā)光強(qiáng)度根據(jù)雙氧水的濃度不同而不同，如圖4Ε所示。發(fā)光強(qiáng)度和雙氧水濃度之間的正相關(guān)關(guān)系表明圖像的光強(qiáng)度可以反映出局部的雙氧水濃度，最低可見的雙氧水濃度為10 μ Μ。作為對(duì)比，在電極上施加1.0v的恒電壓的條件下，最低可見雙氧水濃度為50 μ M0這一可視檢測(cè)限的改進(jìn)確定了使用組合電壓用于ECL成像的重要性。
[0043]實(shí)施例2單細(xì)胞表面外泄雙氧水的可視化檢測(cè)。
[0044]單細(xì)胞外泄雙氧水成像是將100-5000個(gè)Hela細(xì)胞培養(yǎng)在ITO玻璃片上的溶液室中，然后用IOyUOng / ml的巴豆醇-12-十四烷酸酯-13-乙酸酯(PMA，Phorbol 12-myristate-13_acetate,簡(jiǎn)稱佛波酯,購(gòu)買自 sigma-aldrich,貨號(hào)為 P8139)刺激產(chǎn)生雙氧水。據(jù)報(bào)導(dǎo)，PMA會(huì)刺激細(xì)胞內(nèi)的NADPA氧化酶而使得雙氧水量積累,從而導(dǎo)致雙氧水外泄。根據(jù)相同的成像步驟，得到了在L012存在條件下的明場(chǎng)圖和背景圖(圖5A和5B)。在發(fā)光圖中，由于細(xì)胞貼附在電極表面阻礙了 L012擴(kuò)散到電極表面，從而呈現(xiàn)為較暗的強(qiáng)度。細(xì)胞在PMA刺激以后釋放出雙氧水后，立刻拍照，得到一張發(fā)光圖(圖5C)。通過將圖5C扣除背景圖5B，得到圖中細(xì)胞變亮(圖OT)。細(xì)胞發(fā)光應(yīng)該不是由擴(kuò)散到細(xì)胞上的氧自由基與L012接觸產(chǎn)生的，因?yàn)閺寞B加圖上看在細(xì)胞周圍并沒有發(fā)光現(xiàn)象(圖5E)。在排除了自由基擴(kuò)散導(dǎo)致發(fā)光的可能性之后，細(xì)胞底部存在L012就是對(duì)此現(xiàn)象的唯一解釋。對(duì)于貼壁細(xì)胞，細(xì)胞膜的褶皺被認(rèn)為會(huì)在細(xì)胞底部和支撐物表面形成微小的空間，從而造成了 L012在細(xì)胞和電極之間的存在。經(jīng)過刺激之后，細(xì)胞底部表面釋放的雙氧水在電壓作用下產(chǎn)生自由基，并與細(xì)胞底部的L012發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生發(fā)光。采用軟件ImageJ，通過對(duì)每個(gè)像素光強(qiáng)的計(jì)算，參考圖4E中的光強(qiáng)信號(hào)，細(xì)胞表面拍到的光強(qiáng)通過標(biāo)記不同顏色來轉(zhuǎn)換成雙氧水的濃度在10?30 μ M(圖5F)。該結(jié)果顯示出雙氧水外泄的不均勻性。
[0045]在對(duì)照組實(shí)驗(yàn)中用ρΗ7.4的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)替代ΡΜΑ，使得細(xì)胞不會(huì)受到刺激。其成像圖片如圖6所示。減去了背景之后的發(fā)光圖顯示沒有任何光增強(qiáng)情況出現(xiàn)在細(xì)胞區(qū)域。對(duì)照組細(xì)胞沒有任何雙氧水釋放，所以正如預(yù)期的，這些細(xì)胞沒有發(fā)光。發(fā)光強(qiáng)度和雙氧水外泄的相關(guān)性表明我們的實(shí)驗(yàn)方法是可以為不同狀態(tài)下的細(xì)胞釋放的雙氧水提供其存在亞微米分布的依據(jù)。
[0046]和電化學(xué)掃描顯微鏡對(duì)細(xì)胞雙氧水成像相比，使用電致化學(xué)發(fā)光成像方法有著裝置簡(jiǎn)單和可以平行快速檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)。對(duì)于電致化學(xué)發(fā)光成像，將培養(yǎng)細(xì)胞的ITO電極放置于顯微鏡平臺(tái)上檢測(cè)，電極不需要進(jìn)一步修飾。這種簡(jiǎn)單的方法可以促進(jìn)電致化學(xué)發(fā)光分析技術(shù)用于生物研究。同時(shí)，可以同時(shí)獲得ITO表面所有細(xì)胞的發(fā)光信息加大了檢測(cè)的通量，這對(duì)于單細(xì)胞檢測(cè)是十分有意義的。6個(gè)細(xì)胞的發(fā)光信號(hào)顯示的對(duì)于平均光強(qiáng)的標(biāo)準(zhǔn)偏差為10.0%，這反映出不同細(xì)胞外泄的雙氧水量的波動(dòng)較小。
[0047]實(shí)施例3單細(xì)胞表面分子的電致化學(xué)發(fā)光成像。
[0048]除了可以對(duì)細(xì)胞釋放的雙氧水進(jìn)行成像，本發(fā)明的電致化學(xué)發(fā)光成像方法還可以利用細(xì)胞表面的分子對(duì)應(yīng)的氧化酶將它們轉(zhuǎn)化為雙氧水，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞表面分子的成像。為了證明可對(duì)細(xì)胞表面分子成像，我們選擇了膽固醇作為模板分子，檢測(cè)細(xì)胞膜活化膽固醇分子的分布?；罨懝檀季哂休^高的化學(xué)勢(shì)(逃離趨勢(shì))，它對(duì)細(xì)胞膜膽固醇運(yùn)輸具有重要作用。雖然細(xì)胞膜膽固醇已經(jīng)可以利用熒光膽固醇類似物或者flipin來成像，但是因?yàn)檫@些熒光探針無法區(qū)分活化膽固醇和非活化膽固醇，因此細(xì)胞表面活化膽固醇從未被成功成像。而本發(fā)明的電致化學(xué)發(fā)光方法可以利用活化膽固醇與膽固醇氧化酶反應(yīng)生成雙氧水這一特性，通過ECL成像的方法來對(duì)活化膽固醇進(jìn)行成像。實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞首先在含有sandoz58035 (購(gòu)買于sigma-aldrich,貨號(hào)為S9318)的培養(yǎng)液中處理過夜,通過抑制?；o酶 a_ 膽固醇酸基轉(zhuǎn)移酶(acyl-coA / cholesterol acyltransferase) (ACAT)蛋白，實(shí)現(xiàn)更多的膽固醇在細(xì)胞膜中積累，從而增加膽固醇的活性。當(dāng)細(xì)胞暴露在膽固醇氧化酶和L012環(huán)境中，這兩個(gè)物質(zhì)都會(huì)擴(kuò)散至細(xì)胞底部的微小空隙中。當(dāng)膽固醇氧化酶和活化膽固醇反應(yīng)產(chǎn)生雙氧水后，施加電壓就會(huì)實(shí)現(xiàn)電致化學(xué)發(fā)光成像。明場(chǎng)和加入膽固醇氧化酶之后的發(fā)光差異圖分別如圖7A，7B所示。從圖7B來看，細(xì)胞表面出現(xiàn)比周圍更亮的光強(qiáng)度，展示我們可以看到細(xì)胞表面的活化細(xì)胞膜膽固醇。從加入了偽彩色的圖7C和局部放大圖(圖7D)上可以看到細(xì)胞表面的活化膽固醇分布存在一定的不均勻度。
[0049]陰性對(duì)照組的實(shí)驗(yàn)使用他汀類藥物來對(duì)ACAT被抑制的細(xì)胞中的3-hydroxy-3_methylglutaryl-CoA(3-輕基-3-甲基戍二酰輔酶A還原酶,HMGCoA)的活性進(jìn)行抑制,導(dǎo)致減少細(xì)胞內(nèi)的膽固醇合成從而減低細(xì)胞膜上的活化膽固醇。發(fā)光強(qiáng)度的差分圖如圖7E以及圖8中的明場(chǎng)照片和疊加照片所示。從HMGCoA和ACAT同時(shí)被抑制得到細(xì)胞發(fā)光圖可以知道，雖然這類細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)膽固醇和膜膽固醇總量大大降低，但是活化膽固醇依然存在。和ACAT被抑制的細(xì)胞發(fā)光相比，HMGCoA, ACAT同時(shí)被抑制的細(xì)胞產(chǎn)生的弱發(fā)光證明了 ECL成像方法可以為藥物分析提供活化膜膽固醇的分布信息。本次對(duì)細(xì)胞活化膽固醇的成像為細(xì)胞膽固醇運(yùn)輸研究提供了更多的生物學(xué)信息。
[0050]綜上所述，本發(fā)明采用了一套空間分辨率為0.8 μ m的ECL成像系統(tǒng)對(duì)細(xì)胞外泄的雙氧水和細(xì)胞膜活化膽固醇進(jìn)行了成像。電極表面細(xì)胞發(fā)光可以使得多個(gè)細(xì)胞同時(shí)成像，因此這一套簡(jiǎn)單的系統(tǒng)擁有高檢測(cè)通量。后續(xù)研究將著眼于更高效的ECL發(fā)光探針來增加發(fā)光強(qiáng)度來達(dá)到更高的信噪比以獲得更高分辨率的單細(xì)胞成像圖。
【權(quán)利要求】
1.一種電致化學(xué)發(fā)光成像裝置，其特征在于，包括物鏡、光傳輸通道、單光子檢測(cè)電子倍增CCD和電致化學(xué)發(fā)光發(fā)生器，所述電致化學(xué)發(fā)光發(fā)生器包括ITO電極、銀電極和電壓發(fā)生器，其中，所述物鏡、光傳輸通道和單光子檢測(cè)電子倍增CXD依次連接；所述ITO電極與電壓發(fā)生器的正極相連，銀電極和電壓發(fā)生器的負(fù)極相連。
2.權(quán)利要求1所述的電致化學(xué)發(fā)光成像裝置在可視化檢測(cè)雙氧水中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，包括如下步驟:將發(fā)光試劑和雙氧水加入到O型圈內(nèi)，在單光子檢測(cè)電子倍增CCD曝光的同時(shí)向ITO電極施加周期性的發(fā)光電壓-恢復(fù)電壓，檢測(cè)成像效果。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的發(fā)光試劑為L(zhǎng)012、魯米諾、N-(4-氨基丁基)-N-乙基異魯米諾，N-(6-氨基已基)-N-乙基異魯米諾和異硫氰酸異魯米諾中的任意一種，用量為ΙΟΟμΜ?500μΜ。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述雙氧水的檢測(cè)范圍為10?200μ Μ。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，單光子檢測(cè)電子倍增CCD曝光的時(shí)間為兩個(gè)發(fā)光電壓-恢復(fù)電壓周期，其中，一個(gè)發(fā)光電壓-恢復(fù)電壓周期為:發(fā)光電壓:1.0±0.1V的正電壓下2± Is ;恢復(fù)電壓:-1.0±0.1V的負(fù)電壓下0.5±0.25s。
7.權(quán)利要求1所述的裝置在可視化檢測(cè)單細(xì)胞表面外泄雙氧水中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，包括如下步驟:在ITO玻璃片的表面粘貼O型圈作為溶液室，以ITO玻璃片為工作電極，銀電極為對(duì)電極，將細(xì)胞在溶液室中培養(yǎng)，向溶液室中加入發(fā)光試劑，然后加入PMA刺激細(xì)胞內(nèi)的NADPA氧化酶使細(xì)胞表面產(chǎn)生雙氧水，在單光子檢測(cè)電子倍增CCD曝光的同時(shí)向ITO電極施加周期性的發(fā)光電壓-恢復(fù)電壓，檢測(cè)成像效果。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的發(fā)光試劑為L(zhǎng)012、魯米諾、N-(4-氨基丁基)-N-乙基異魯米諾，N-(6-氨基已基)-N-乙基異魯米諾和異硫氰酸異魯米諾中的任意一種，用量為ΙΟΟμΜ?500μΜ。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，單光子檢測(cè)電子倍增CCD曝光的時(shí)間為兩個(gè)發(fā)光電壓-恢復(fù)電壓周期，其中，一個(gè)發(fā)光電壓-恢復(fù)電壓周期為:發(fā)光電壓:`1.0±0.1V的正電壓下2± Is ;恢復(fù)電壓:-1.0±0.1V的負(fù)電壓下0.5±0.25s。
11.權(quán)利要求1所述的裝置在可視化檢測(cè)細(xì)胞表面分子上的應(yīng)用。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的應(yīng)用，其特征在于，包括如下步驟:在ITO玻璃片的表面粘貼O型圈作為溶液室，以ITO玻璃片為工作電極，銀電極為對(duì)電極，將細(xì)胞在溶液室中培養(yǎng)，向溶液室中加入發(fā)光試劑，利用細(xì)胞表面的待測(cè)分子對(duì)應(yīng)的氧化酶將所述待測(cè)分子轉(zhuǎn)化為雙氧水，在單光子檢測(cè)電子倍增CCD曝光的同時(shí)向ITO電極施加周期性的發(fā)光電壓-恢復(fù)電壓，檢測(cè)成像效果。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的發(fā)光試劑為L(zhǎng)012、魯米諾、N- (4-氨基丁基)-N-乙基異魯米諾，N- (6-氨基已基)-N-乙基異魯米諾和異硫氰酸異魯米諾中的任意一種，用量為ΙΟΟμΜ?500μΜ。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的應(yīng)用，其特征在于，單光子檢測(cè)電子倍增CCD曝光的時(shí)間為兩個(gè)發(fā)光電壓-恢復(fù)電壓周期，其中，一個(gè)發(fā)光電壓-恢復(fù)電壓周期為:發(fā)光電壓:`1.0±0.1V的正電壓下2 ± Is ;恢復(fù)電壓:-1.0±0.1V的負(fù)電壓下0.5±0.25s。
【文檔編號(hào)】G01N21/76GK103913447SQ201410126893
【公開日】2014年7月9日 申請(qǐng)日期:2014年3月31日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月31日
【發(fā)明者】方丹君, 江德臣, 周俊宇 申請(qǐng)人:南京醫(yī)科大學(xué)