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一種用于atp檢測的方法及其配套的光學(xué)適配子傳感器的制造方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于ATP檢測的方法及其配套的光學(xué)適配子傳感器。將完整的ATP適配子被分成單鏈DNA，即S1和S2。S1被固定在帶孔DNA結(jié)合板表面；S2和用于產(chǎn)生信號的核酸鏈S3被固定在以PNS/AuNPs納米復(fù)合物為信號放大載體的表面，在被檢測物ATP存在時，S1和S2通過ATP分子而連接，從而將信號放大載體固定在帶孔DNA結(jié)合板表面，然后負(fù)載在PNS/AuNPs納米復(fù)合物表面的S3與加入的鉀離子和血紅素形成四鏈體結(jié)構(gòu)DNA酶，催化底物，得到可用于檢測的光學(xué)信號。本發(fā)明具有很高的靈敏度和特異性，對ATP的響應(yīng)范圍為0.01–1nmol·L-1，檢測限為1.35pmol·L-1。
【專利說明】—種用于ATP檢測的方法及其配套的光學(xué)適配子傳感器
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物分析檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種用于ATP檢測的方法及其配套的光學(xué)適配子傳感器。
【背景技術(shù)】
[0002]三磷酸腺苷(ATP)是體內(nèi)組織細(xì)胞所需能量的主要來源，在細(xì)胞的多種代謝過程中扮演者重要的角色，是維持生物體正常機(jī)能無可替代的物質(zhì)，并且細(xì)胞中ATP的含量還和許多疾病如貧血、低血糖、心血管疾病以及癌癥等有著密切的關(guān)系，因此發(fā)展一種聞效靈敏的方法去檢測ATP分子有著非常重要的意義。
[0003]傳統(tǒng)上，有大量的方法可以檢測ATP分子，如色譜法(J.Chromatogr.，Biomed.Appl.，1994，662，15 - 20)、生物發(fā)光法(Cancer, 1993，71，1613 - 1620)、電化學(xué)方法(Talanta, 2009，78，954 - 958)以及熒光法(Chem.Commun.，2011，47, 6066 - 6068)等。但是這些方法或多或少存在有操作麻煩、檢測時間長、性能不穩(wěn)定以及靈敏度較低等問題。
[0004]近年來，適配子傳感器因其對目標(biāo)分子的高親合力以及良好的特異性而受到科研工作者的廣泛研究，而基于光學(xué)方法發(fā)展的超靈敏適配子傳感器更是因?yàn)榈统杀疽约案哽`敏度而備受青睞。自組裝寡肽納米球因其良好的生物相容性、高的均相度以及表面易于修飾等優(yōu)點(diǎn)而引起人們的關(guān)注，但是將自組裝寡肽納米球作為信號放大載體用于構(gòu)建超靈敏光學(xué)適配子傳感器還未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的就是基于上述不足，提供一種基于自組裝寡肽納米球構(gòu)建的光學(xué)適配子傳感器及其用于ATP檢測的方法，該光學(xué)適配子傳感器設(shè)計(jì)簡單、成本低廉且穩(wěn)定性好，更重要的是具有高的靈敏度。本發(fā)明的目的是通過以下方式實(shí)現(xiàn)的:
[0006]一種用于ATP檢測的方法，包括以下步驟:
[0007](I)將設(shè)計(jì)合成的含巰基的寡肽自組裝成寡肽納米球；
[0008](2)將制備的金納米粒子通過Au - S鍵固定到寡肽納米球的表面，得到用于信號放大的PNS/AuNPs納米復(fù)合物載體；
[0009](3)將用于產(chǎn)生信號的核酸鏈S3和ATP單鏈適配體S2固定到PNS/AuNPs納米復(fù)合物上，ATP單鏈適配體SI固定在帶孔DNA結(jié)合板上，板表面空隙位置用牛血清蛋白封閉；
[0010](4)通過加入不同濃度的ATP分子將負(fù)載有S3和S2的PNS/AuNPs納米復(fù)合物連接到帶孔DNA結(jié)合板上；
[0011](5)往上述帶孔DNA結(jié)合板中加入鉀離子和血紅素后，PNS/AuNPs納米復(fù)合物表面的S3與鉀離子和血紅素形成四鏈體結(jié)構(gòu)的DNA酶，從而可催化底物反應(yīng)得到具有光學(xué)信號產(chǎn)物。
[0012](6)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線后，用于檢測ATP樣品。
[0013]所用寡肽序列為含有半胱氨酸或蛋氨酸，和苯丙氨酸的短肽單元，序列通式為:Cys-Phe-AniBn,或者 Met-Phe-AniBn, A 為 Phe, Trp 及 His 中的任何一種，其中 m=l 或 2 ;B 為Gly、Leu、Val、Ala及Met中的任何一種，其中n=0,1或2。
[0014]所述寡肽納米球是將0.5?10mg/mL的寡肽溶液放置在室溫條件下，反應(yīng)12?48h。
[0015]所述金納米粒子的粒徑范圍為2.5_15nm，金納米粒子溶液的濃度范圍為0.01?lg/L。
[0016]所述PNS/AuNPs納米復(fù)合物是將0.1?IOmL制備的0.01?lg/L金納米粒子溶液加入到I?20mL制備的0.5?10mg/mL的寡肽納米球溶液中，震蕩條件下反應(yīng)I?6h。
[0017]所述S2和S3的濃度分別為0.5?5μ M和2?ΙΟμΜ，往制備的PNS/AuNPs納米復(fù)合物表面固定時，所加入的S2和S3溶液體積比為1:1?1:10，所用S2和S3溶液，與PNS/AuNPs納米復(fù)合物溶液體積比例為1:0.5?1:5。
[0018]S2和S3固定在PNS/AuNPs納米復(fù)合物的表面，結(jié)合時間為6?24h，離心將未反應(yīng)的S2和S3移除。
[0019]步驟(4)中向各孔中加入10-30 μ L的待檢測的ATP和80-120 μ L修飾有S2和S3的PNS/AuNPs納米復(fù)合物溶液。
[0020]完整的ATP適配子被分成兩段單鏈DNA，其序列分別為:S1:5' -NH2-TTT TTT ACCTGG GGG AGTAT-3'和S2:5/ -HS-TTT TTT TGC GGA GGA AGG T-3/，用于產(chǎn)生信號的核酸鏈為 S3:5' -HS-TTT TTT GGTTGG TGT GGT TGG-3'。
[0021]所述的用于ATP檢測的方法及其配套的光學(xué)適配子傳感器，包括:含巰基的寡肽自組裝成的寡肽納米球、金納米粒子、用于產(chǎn)生信號的核酸鏈S3、ATP單鏈適配體S2、ATP單鏈適配體S1、帶孔DNA結(jié)合板、鉀離子、血紅素、底物、牛血清蛋白。
[0022]本發(fā)明是將完整的ATP適配子分成兩段單鏈DNA，即SI和S2。SI被固定在帶孔DNA結(jié)合板表面，板表面空隙位置用牛血清蛋白(BSA)封閉；S2和S3被固定在以PNS/AuNPs納米復(fù)合物為信號放大載體的表面，在被檢測物ATP存在時，SI和S2可以通過ATP分子而連接起來，從而將信號放大載體固定在帶孔DNA結(jié)合板表面，然后負(fù)載在PNS/AuNPs納米復(fù)合物表面用于產(chǎn)生信號的核酸鏈S3與加入的鉀離子和血紅素形成具有過氧化氫酶的功能的四鏈體結(jié)構(gòu)DNA酶。該DNA酶可以催化過氧化氫去氧化底物3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，從而得到可用于檢測的光學(xué)信號。
[0023]本發(fā)明所述寡肽納米球(PNS)是將0.5?10mg/mL凍干的Cys-Phe-AmBn,或者M(jìn)et-Phe-AmBn, (A 為 Phe> Trp 及 His 中的任何一種，其中 m=l 或 2 ;B 為 Gly、Leu、Val、Ala及Met中的任何一種，其中n=0，I或2)寡肽溶液放置在室溫條件下，反應(yīng)12?48h。優(yōu)選的寡肽濃度為2mg/mL。優(yōu)選的反應(yīng)時間為24h。
[0024]本發(fā)明所述金納米粒子(AuNPs)粒徑范圍為2.5_15nm，金納米粒子溶液的濃度范圍為0.01?lg/L。具體配制可以是將0.1?5mLl%的氯金酸溶液加入到50mL雙蒸水中，劇烈攪拌5?lOmin，再加入0.5mLl%的檸檬酸鈉溶液，混勻后，加入0.5mL0.05?0.15%的硼氫化鈉溶液，劇烈攪拌5?lOmin，后放于4°C下保存?zhèn)溆?。?yōu)選的加入1%的氯金酸溶液的量為0.5mL，優(yōu)選的硼氫化鈉溶液濃度為0.075%。
[0025]本發(fā)明所述PNS/AuNPs納米復(fù)合物是將0.1?IOmL制備的0.01?lg/L金納米粒子溶液加入到I?20mL制備的0.5?10mg/mL的寡肽納米球溶液中，震蕩條件下反應(yīng)I?6h。優(yōu)選的加入AuNPs溶液的量為0.5?2mL。優(yōu)選的PNS溶液體積為I?5mL。優(yōu)選的反應(yīng)時間為2?4h。
[0026]本發(fā)明所述S2和S3的濃度分別為0.5?5 μ M和2?10 μ M，往上述制備的PNS/AuNPs納米復(fù)合物表面固定時，所加入的兩者體積比為1:1?1:10，所用S2和S3溶液，與PNS/AuNPs納米復(fù)合物溶液體積比例為1:0.5?1:5。優(yōu)選的S2和S3的濃度分別為I μ M和5 μ Μ。優(yōu)選的加入的S2和S3體積比為1:4?1:6。優(yōu)選的S2和S3溶液，與PNS/AuNPs納米復(fù)合物溶液體積比例為1:1?1:3。
[0027]本發(fā)明所述SI的濃度為0.1?5 μ M。封閉用的BSA濃度為0.5%?10%。優(yōu)選的SI的濃度為0.5 μ Μ。優(yōu)選的BSA濃度為2%。
[0028]本發(fā)明SI的固定過程可以是:在96孔DNA結(jié)合板的各孔中加入100 μ LSI (0.5 μ Μ), 37°C下放置lh，將溶液移除后用PBS清洗兩次；再加入300 μ Ll%的BSA，37 °C下放置Ih,將溶液移除后用PBS清洗三次。
[0029]本發(fā)明制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的過程可以是:向各孔中加入10-30 μ L的不同濃度的ATP和80-120 μ L修飾有S2和S3的PNS/AuNPs納米復(fù)合物溶液，室溫下放置lh，將溶液移除后用PBS清洗三次。加入50 μ L0.1%的KCl溶液和50 μ LI μ M的血紅素，室溫下放置Ih后加入100 μ L800 μ M 的 TMB 和 10 μ Ll% 的 H2O2,反應(yīng)約 15min 后加入 10 μ L 的 HCl (200 μ Μ)，然后在450nm下測定紫外吸光度。以450nm處吸光度值對ATP濃度的自然對數(shù)作圖。ATP濃度在0.01 -1nM范圍內(nèi)時，兩者之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，可實(shí)現(xiàn)該濃度范圍內(nèi)ATP分子的定量檢測。
[0030]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:
[0031]I)本發(fā)明檢測ATP分子時具有高的靈敏度和優(yōu)異的選擇性，對ATP的檢測濃度范圍為0.01 -1nM，檢測限為1.35pM ；
[0032]2)本發(fā)明的制作工藝簡單、成本低且性能穩(wěn)定；
[0033]3)本發(fā)明基于PNS/AuNPs納米復(fù)合物構(gòu)建的適配子傳感器有望成為一種通用的構(gòu)建適配子傳感器的方法。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0034]圖1為本發(fā)明的ATP檢測方法原理示意圖；
[0035]圖2㈧為實(shí)施例1中寡肽自組裝得到的PNS原子力顯微鏡圖，圖2 (B)為實(shí)施例1中AuNPs負(fù)載到PNS表面后Au的XPS圖譜；
[0036]圖3為實(shí)施例2中構(gòu)建的光學(xué)適配子傳感器對ATP檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，從左到右，ATP濃度分別為0.01,0.025、0.05,0.1,0.5、Inmol.L—1，橫坐標(biāo)為ATP濃度取自然對數(shù)，縱坐標(biāo)為吸光度；
[0037]圖4為實(shí)施例2中構(gòu)建的光學(xué)適配子傳感器對ATP的選擇性。
【具體實(shí)施方式】:
[0038]以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0039]實(shí)施例1:PNS/AuNPs納米復(fù)合物的制備
[0040]2mg/mL的Cys-Phe-Phe寡肽溶液放置于室溫下，反應(yīng)24h,得到PNS。[0041]將0.5mLl%的氯金酸溶液加入到50mL雙蒸水中，劇烈攪拌5min，再加入0.5mLl%的檸檬酸鈉溶液，混勻后，加入0.5mL0.075%的硼氫化鈉溶液，劇烈攪拌5min，得到AuNPs。
[0042]將ImL制備的AuNPs溶液加入到2mL制備的PNS溶液中，震蕩條件下反應(yīng)4h后，離心將未反應(yīng)的AuNPs移除，得到PNS/AuNPs納米復(fù)合物。
[0043]實(shí)施例2:光學(xué)適配子傳感器構(gòu)建及用于檢測ATP分子
[0044]50 μ L S2 (I μ Μ)和 200 μ L S3 (5 μ Μ)同時加入到 400 μ L 上述制得的 PNS/AuNPs納米復(fù)合物溶液中，反應(yīng)12h后，在8000rpm的條件下離心lOmin，移除未反應(yīng)的S2和S3，重復(fù)三次，得到修飾有S2和S3的PNS/AuNPs納米復(fù)合物。
[0045]在96孔DNA結(jié)合板的各孔中加入IOOyL SI (0.5 μ M)，37°C下放置lh，將溶液移除后用PBS清洗兩次；再加入300 μ Ll%的BSA，37°C下放置lh，將溶液移除后用PBS清洗三次。然后向各孔中加入20 μ L的不同濃度的ATP和100 μ L修飾有S2和S3的PNS/AuNPs納米復(fù)合物溶液，室溫下放置lh，將溶液移除后用PBS清洗三次。加入50 μ L0.1%的KCl溶液和50 μ LI μ M的血紅素，室溫下放置Ih后加入100 μ L800 μ M的TMB和10 μ Ll%的H2O2,反應(yīng)約15min后加入IOyL的Ηα(200μΜ)，然后在450nm下測定紫外吸光度。以450nm處吸光度值對ATP濃度的自然對數(shù)作圖，ATP濃度在0.01 -1nM范圍內(nèi)時，兩者之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，可實(shí)現(xiàn)該濃度范圍內(nèi)ATP分子的定量檢測。并且在檢測ATP分子時不受其他一些ATP類似物的干擾，如:GTP、CTP及UTP等。在上述ATP類似物存在的條件下，該光學(xué)適配子傳感器對ATP分子仍具有良好的選擇性和靈敏度(圖4)。
【權(quán)利要求】
1.一種用于ATP檢測的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)將設(shè)計(jì)合成的含巰基的寡肽自組裝成寡肽納米球； (2)將制備的金納米粒子通過Au- S鍵固定到寡肽納米球的表面，得到用于信號放大的PNS/AuNPs納米復(fù)合物載體； (3)將用于產(chǎn)生信號的核酸鏈S3和ATP單鏈適配體S2固定到PNS/AuNPs納米復(fù)合物上，ATP單鏈適配體SI固定在帶孔DNA結(jié)合板上，板表面空隙位置用牛血清蛋白封閉； (4)通過加入不同濃度的ATP分子將負(fù)載有S3和S2的PNS/AuNPs納米復(fù)合物連接到帶孔DNA結(jié)合板上； (5)往上述帶孔DNA結(jié)合板中加入鉀離子和血紅素后，PNS/AuNPs納米復(fù)合物表面的S3與鉀離子和血紅素形成四鏈體結(jié)構(gòu)的DNA酶，從而可催化底物反應(yīng)得到具有光學(xué)信號產(chǎn)物； (6)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線后，用于檢測ATP樣品。
2.如權(quán)利要求1所述的用于ATP檢測的方法，其特征在于，所用寡肽序列為含有半胱氨酸或蛋氨酸，和苯丙氨酸的短肽單元，序列通式為=Cys-Phe-AniBn，或者M(jìn)et-Phe-AniBn, A為Phe、Trp及His中的任何一種，其中m=l或2 ;B為Gly、Leu、Val、Ala及Met中的任何一種，其中η=0，1或2。
3.如權(quán)利要求2所述的用于ATP檢測的方法，其特征在于，所述寡肽納米球是將0.5?10mg/mL的寡肽溶液放置在室溫條件下,反應(yīng)12?48h。
4.如權(quán)利要求1所述的用于ATP檢測的方法，其特征在于， 所述金納米粒子的粒徑范圍為2.5-15nm，金納米粒子溶液的濃度范圍為0.01?lg/L。
5.如權(quán)利要求1所述的用于ATP檢測的方法，其特征在于， 所述PNS/AuNPs納米復(fù)合物是將0.1?IOmL制備的0.01?lg/L金納米粒子溶液加入到I?20mL制備的0.5?10mg/mL的寡肽納米球溶液中，震蕩條件下反應(yīng)I?6h。
6.如權(quán)利要求5所述的用于ATP檢測的方法，其特征在于， 所述S2和S3的濃度分別為0.5?5 μ M和2?10 μ M，往制備的PNS/AuNPs納米復(fù)合物表面固定時，所加入的S2和S3溶液體積比為1:1?1:10，所用S2和S3溶液，與PNS/AuNPs納米復(fù)合物溶液體積比例為1:0.5?1:5。
7.如權(quán)利要求1所述的用于ATP檢測的方法，其特征在于，S2和S3固定在PNS/AuNPs納米復(fù)合物的表面，結(jié)合時間為6?24h，離心將未反應(yīng)的S2和S3移除。
8.如權(quán)利要求6所述的用于ATP檢測的方法，其特征在于，步驟(4)中向各孔中加入10-30 μ L的待檢測的ATP和80-120 μ L修飾有S2和S3的PNS/AuNPs納米復(fù)合物溶液。
9.如權(quán)利要求1所述的用于ATP檢測的方法，其特征在于，完整的ATP適配子被分成兩段單鏈 DNA，其序列分別為:S1:5' -NH2-TTT TTT ACC TGG GGG AGT AT-3'和 S2:5' -HS-TTT TTT TGC GGA GGA AGGT-3'，用于產(chǎn)生信號的核酸鏈為 S3:5' -HS-TTT TTTGGT TGG TGT GGT TGG-3'。
10.權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述的用于ATP檢測的方法及其配套的光學(xué)適配子傳感器，其特征在于，包括:含巰基的寡肽自組裝成的寡肽納米球、金納米粒子、用于產(chǎn)生信號的核酸鏈S3、ATP單鏈適配體S2、ATP單鏈適配體S1、帶孔DNA結(jié)合板、鉀離子、血紅素、底物、牛血清蛋白。
【文檔編號】G01N21/33GK103822890SQ201410068710
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2014年2月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月27日
【發(fā)明者】劉又年, 鄧留, 黎世鵬, 郝遠(yuǎn)強(qiáng), 李娟
申請人:中南大學(xué)