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一種河豚毒素柱前衍生-高效液相熒光檢測方法及基于該方法的試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種河豚毒素柱前衍生-高效液相熒光檢測方法，包括以下步驟：(1)制備待測品的樣品溶液及河豚毒素標準品溶液；(2)取樣品溶液0.4mL，加入0.2mLpH維持液，將溶液pH控制在11.6~11.9區(qū)間，然后加入0.1mL衍生試劑1和0.1mL衍生試劑2，混勻，水浴加熱20min，冷卻至室溫，加入0.1mL終止液，使溶液pH呈中性，而后用超純水定容；取樣品溶液，加入河豚毒素標準品溶液混勻，然后進行本步驟操作進行熒光衍生；(3)采用配備熒光檢測器的液相色譜儀對步驟(2)熒光衍生后的樣品溶液和河豚毒素標準品溶液進行分析，對樣品溶液中的河豚毒素進行定性和定量。本發(fā)明同時公開適用于該方法的試劑盒。該方法用于定性、定量檢測水產(chǎn)品中河豚毒素，結(jié)果可靠、檢測限低。
【專利說明】一種河豚毒素柱前衍生-高效液相熒光檢測方法及基于該方法的試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及河豚毒素檢測方法及試劑盒，具體涉及一種河豚毒素柱前衍生-高效液相熒光檢測方法及基于該方法的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]河豚毒素(Tetrodotoxin,TTX)是日本學者 Dr.Yoshizumi Tahara 于 1909 年首次從河豚肝臟中提取并發(fā)現(xiàn)的一種氨基全喹啉化合物神經(jīng)毒素，分子量約為319.3Da。普遍存在于河豚、織紋螺、蟹、海星、蝦虎魚等海生生物，蠑螈、蛙、蛇等陸棲動物，甲藻、紅藻等藻類以及細菌等生物中。TTX毒性極強，I mg等于4500MU，對哺乳類靜脈注射半致死劑量LD50為2?10 μ g/kg，皮下注射LD50為10?14 μ g/kg，對人類的最低急性中毒劑量約為
0.2mg，致死攝食劑量0.6?2mg/50kg體重。由于其熱穩(wěn)定性高，普通烹飪手段如在100°C加熱難以破壞，常常引發(fā)吃食河豚、織紋螺等中毒。小鼠生物法、酶聯(lián)免疫法(ELISA)、液質(zhì)聯(lián)用法(LC-MS)和高效液相柱后衍生熒光檢測法(HPLC-FLD)等為河豚毒素檢測常用方法，但由于均存在一定的缺陷，如小鼠法不能專一地檢出TTX，ELISA容易出現(xiàn)假陽性，LC-MS檢測成本昂貴，柱后衍生HPLC-FLD需要配備柱后衍生裝置和昂貴聯(lián)用質(zhì)譜儀確證。熒光檢測技術(shù)具有背景干擾低、靈敏度高、精確、成本相對低廉的特點，因此開發(fā)一種新型熒光檢測手段，將有利于促進河豚毒素的檢測工作。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的之一是提供一種河豚毒素柱前衍生-高效液相熒光檢測方法，該方法用于定性、定量檢測水產(chǎn)品中河豚毒素(TTX)，結(jié)果可靠、檢測限低。
[0004]本發(fā)明的目的之二是提供基于上述河豚毒素柱前衍生-高效液相熒光檢測方法的試劑盒。
[0005]本發(fā)明的第一個目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn):一種河豚毒素柱前衍生-高效液相熒光檢測方法，包括以下步驟:
(1)制備待測品的樣品溶液及河豚毒素標準品溶液；
(2)熒光衍生:取樣品溶液0.4m L，加入0.2m L pH維持液，將溶液pH控制在11.6?11.9區(qū)間，然后加入0.1mL衍生試劑I和0.1mL衍生試劑2，混勻，水浴加熱20min，冷卻至室溫，加入0.1mL終止液,使溶液pH呈中性,而后用超純水定容；取樣品溶液，加入河豚毒素標準品溶液混勻，然后進行本步驟操作進行熒光衍生；
(3)定性和定量檢測:采用配備熒光檢測器的液相色譜儀對步驟(2)熒光衍生后的樣品溶液和河豚毒素標準品溶液進行分析，對樣品溶液中的河豚毒素進行定性和定量。
[0006]本發(fā)明所述步驟(I)中待測品的樣品溶液的提取和純化采用已有技術(shù)即可，例如，將待測品均質(zhì)，用乙酸溶液在水浴超聲提取后，所得提取液上河豚毒素親和層析柱或WCX固體萃取柱等洗脫，獲得的洗脫液經(jīng)水浴氮氣吹干后再制成樣品溶液。[0007]本發(fā)明所述步驟(1)河豚毒素標準品溶液中河豚毒素濃度為2(T10000ng/ml。
[0008]本發(fā)明所述步驟(2)中pH維持液為2mol/L碳酸鈉溶液。
[0009]本發(fā)明所述步驟⑵中衍生試劑I的pH約為12，包括a液、b液和c液，a液、b液和c液之間的體積比為5: 2: 3，具體地，所述a液為次溴酸鈉貯備液:0.67g溴酸鈉、3.0g溴化鈉，用蒸懼水溶解并定容至IOmL ;所述b液為5mol/L鹽酸；所述c液為4.81mol/L氫氧化鈉。
[0010]本發(fā)明所述步驟⑵中衍生試劑2為20%尿素(w/v)。
[0011]本發(fā)明所述步驟⑵中終止液為15%磷酸(w/v)。
[0012]本發(fā)明所述步驟(3)中高效液相色譜檢測條件為:色譜柱:反相C-18柱；流動相:50 mmoL/L磷酸二氫銨；檢測信號:激發(fā)波長233 nm,發(fā)射波長370 nm。
[0013]本發(fā)明的第二個目的通過以下技術(shù)措施來實現(xiàn):基于上述河豚毒素柱前衍生-高效液相熒光檢測方法用試劑盒，包括以下試劑:
(1)衍生試劑1:pH約為12，包括a液、b液和c液，a液、b液和c液之間的體積比為5:2: 3，所述a液為次溴酸鈉貯備液:0.67g溴酸鈉、3.0 g溴化鈉，用蒸餾水溶解并定容至IOmL ;所述b液為5mol/L鹽酸溶液，IOmL ;所述c液為4.81mol/L氫氧化鈉溶液，IOmL ；
(2)衍生試劑2:20%尿素溶液(w/v)。 [0014](3) pH維持液:2mol/L碳酸鈉溶液；
(4)河豚毒素標準品貯備液:100μ g/mL河豚毒素溶液，內(nèi)含lmmol/L的檸檬酸鹽，pH=5.0 ；
(5)終止液:15%磷酸溶液(w/v)。
[0015]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點:
(I)本發(fā)明首次使用次溴酸鈉和尿素與河豚毒素反應(yīng)，將其定量地轉(zhuǎn)化為一種特定的熒光物質(zhì)，與傳統(tǒng)的使用高濃度堿堿解不同，反應(yīng)在弱堿性條件下進行，反應(yīng)條件比較溫和。使用高效液相色譜檢測時，采用柱前衍生方式，不需要配備柱后衍生裝置，檢測成本低。
[0016](2)本發(fā)明與已有的將河豚毒素與熒光物質(zhì)(如鄰苯二醛)相連接的柱前熒光衍生方法不同，不需要具有熒光信號的試劑參與反應(yīng)，同時不易受其他物質(zhì)的干擾，具有很強的特異性，可使用高效液相色譜檢測。
[0017](3)本發(fā)明將河豚毒素衍生后，檢測信號為激發(fā)波長233nm、發(fā)射波長為370nm。
[0018](4)以無毒的河豚魚提取液加入TTX標準品0.0?μδ,熒光衍生處理后，定容至ImL，高效液相色譜測定，計算得出色譜峰信噪比為4.2，以3倍信噪比計算出本發(fā)明提供的方法的檢測限，最低檢測濃度可達0.008Pg/mL，靈敏度高于現(xiàn)有的河豚毒素檢測方法。
[0019](5)本發(fā)明預制所需衍生試劑，形成試劑盒，方便了使用，同時可避免了因配制人員不同造成的試劑誤差。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1為河豚毒素熒光衍生反應(yīng)后熒光掃描圖譜:TTX經(jīng)熒光衍生后，固定激發(fā)波長為233nm，掃描獲得發(fā)射光譜，最大發(fā)射波長為370nm ;固定發(fā)射波長為370nm，掃描獲得激發(fā)光譜，最大激發(fā)波長為232.9nm ；
圖2為河豚毒素柱前衍生-高效液相熒光檢測色譜圖:衍生物經(jīng)高效液相色譜反相C-18柱分離，熒光檢測器檢測(激發(fā)波長233nm、發(fā)射波長370nm)，獲得色譜圖顯示僅有一個主峰，次峰很小可忽略不計，說明熒光衍生物為一種單一物質(zhì)。
【具體實施方式】
[0021]下面通過具體實施例，對本發(fā)明的技術(shù)方案做進一步說明。應(yīng)當理解，本發(fā)明的實施并不局限于下面的實施案例，對本發(fā)明所做的的任何形式上的變通和/或改變都將落入本發(fā)明保護范圍內(nèi)。
[0022]在本發(fā)明中，若非特指，所有設(shè)備和原料等均可從市場購得或是本行業(yè)常用的。
[0023]以下實施例的河豚毒素柱前衍生-高效液相熒光檢測方法使用試劑盒，包括以下試劑:
(I)衍生試劑I φΗ約為12,包括a液、b液和c液，a液、b液和c液之間的體積比為5:2:3，所述a液為次溴酸鈉忙備液:0.67g溴酸鈉、3.0 g溴化鈉,用蒸懼水溶解并定容至IOmL ;所述b液為5mol/L鹽酸溶液IOmL ;所述c液為4.81mol/L氫氧化鈉溶液IOmL ；
衍生試劑I是現(xiàn)用現(xiàn)配，即使用時取5 mL a液，準確加入2 mL b液，密封混勻，靜置5min后,準確加入3 mL c液,立即混勻，配制成衍生試劑I,其pH約為12。
[0024](2)衍生試劑2:衍生試劑2:20%尿素溶液(w/v) 12mL。
[0025](3) pH維持液:2mol/L碳酸鈉溶液25mL ；
(4)河豚毒素標準品貯備液:100μ g/mL河豚毒素溶液2mL，內(nèi)含lmmol/L的檸檬酸鹽,pH=5.0 ；
(5)終止液:15%磷酸溶液(w/v)12mL。
[0026]TTX標準溶液:取一定量TTX標準品貯備液用蒸餾水稀釋濃度在20?IOOOOng/mL之間。
[0027]實施例一結(jié)合C18固相萃取柱和WCX固相萃取柱純化的待測樣品中河豚毒素的檢測
(I)樣品的提取與純化:稱取均質(zhì)后的河豚肉樣品2g，加入10 mL0.1%乙酸，于85°C水浴超聲提取10 min,再沸水浴5min,冷卻后于4500 r/min離心5 min,取全部上清液過C18固相萃取柱(使用前依次用3mL甲醇、3mL0.1%乙酸活化)，再用2mL0.1%乙酸洗滌；收集全部濾過液，用氨水調(diào)節(jié)至pH=7.0，全部過WCX固相萃取柱(使用前依次用3mL10%氨甲醇、ImL水活化)，2mL水洗滌，抽干小柱，用5mL 2%乙酸-甲醇洗脫。洗脫液于80°C水浴氮氣吹干后用I mL水溶解,得樣品液。
[0028](2)熒光衍生:取樣品液0.4mL，加入0.2mL pH維持液，混勻，使pH為11.7，再分別加入0.1mL衍生試劑1、0.ImL衍生試劑2，混勻，于75°C下水浴20min,冷卻，加入0.1mL終止液使溶液PH為中性，加超純水定容至lmL。另取0.4mL樣品液，加入一定量TTX標準液后，按上述操作進行熒光衍生。
[0029](3)檢測:采用配備熒光檢測器的液相色譜儀對步驟(2)熒光衍生后的樣品液和TTX標準品溶液進行分析，檢測信號為:激發(fā)波長233nm，發(fā)射波長370nm ;使用標準加入法定量。
[0030]高效液相色譜檢測條件為:色譜柱:反相C-18柱；流動相:50 mmoL/L磷酸二氫銨；檢測信號:激發(fā)波長233 nm，發(fā)射波長370 nm。[0031]實施例二結(jié)合河豚毒素親和層析柱純化的待測樣品中河豚毒素的檢測
(I)樣品的提取與純化:稱取均質(zhì)后的河豚內(nèi)臟樣品2g，加入10 mL0.1%乙酸，于85°C水浴超聲提取10 min,再沸水浴5min,冷卻后4500 r/min離心5 min,取全部上清液,用
0.5mol/L磷酸氫二鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7.4,以2mL/min速度，全部過河豚毒素親和層析柱(3mL規(guī)格)，分別用3mL PBS (0.0lmol/L，pH=7.4)，3mL去離子水洗滌，5mL 1%醋酸洗脫，抽干柱子。洗脫液于90°C水浴氮氣吹干后用I mL水溶解，得樣品液。
[0032](2)熒光衍生:取樣品液0.4mL，加入0.2mL pH維持液，混勻，使pH為11.7，再分別加入0.1mL衍生試劑1、0.ImL衍生試劑2，混勻，于75°C下水浴20min,冷卻，加入0.1mL終止液使溶液PH為中性，加超純水定容至lmL。另取0.4mL樣品液，加入一定量TTX標準液后，按上述操作進行熒光衍生。
[0033](3)檢測:采用配備熒光檢測器的液相色譜儀對步驟(2)熒光衍生后的樣品溶液和TTX標準品溶液進行分析，檢測信號為:激發(fā)波長233nm，發(fā)射波長370nm ;使用標準加入
法定量。
[0034]高效液相色譜檢測條件為:色譜柱:反相C-18柱；流動相:50 mmoL/L磷酸二氫銨；檢測信號:激發(fā)波長233 nm，發(fā)射波長370 nm。
【權(quán)利要求】
1.一種河豚毒素柱前衍生-高效液相熒光檢測方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)制備待測品的樣品溶液及河豚毒素標準品溶液； (2)熒光衍生:取樣品溶液0.4m L，加入0.2m L pH維持液，將溶液pH控制在11.6?11.9區(qū)間，然后加入0.1mL衍生試劑I和0.1mL衍生試劑2，混勻，水浴加熱20min，冷卻至室溫,加入0.1mL終止液,使溶液pH呈中性，而后用超純水定容；取樣品溶液,加入河豚毒素標準品溶液混勻，然后進行本步驟操作進行熒光衍生； (3)定性和定量檢測:采用配備熒光檢測器的液相色譜儀對步驟(2)熒光衍生后的樣品溶液和河豚毒素標準品溶液進行分析，對樣品溶液中的河豚毒素進行定性和定量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的河豚毒素柱前衍生-高效液相熒光檢測方法，其特征在于，所述步驟(I)河豚毒素標準品溶液中河豚毒素濃度為2(Tl0000ng/ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的河豚毒素柱前衍生-高效液相熒光檢測方法，其特征在于，所述步驟⑵中pH維持液為2mol/L碳酸鈉溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的河豚毒素柱前衍生-高效液相熒光檢測方法，其特征在于，所述步驟⑵中衍生試劑I的PH約為12，包括a液、b液和c液，a液、b液和c液之間的體積比為5:2:3，具體地，所述a液為次溴酸鈉貯備液:0.67g溴酸鈉、3.0 g溴化鈉，用蒸懼水溶解并定容至IOmL ;所述b液為5mol/L鹽酸；所述c液為4.81mol/L氫氧化鈉。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的河豚毒素柱前衍生-高效液相熒光檢測方法，其特征在于，所述步驟⑵中衍生試劑2為20%尿素。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的河豚毒素柱前衍生-高效液相熒光檢測方法，其特征在于，所述步驟(2)中終止液為15%磷酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的河豚毒素柱前衍生-高效液相熒光檢測方法，其特征在于，所述步驟(3)中高效液相色譜檢測條件為:色譜柱:反相C-18柱；流動相:50 mmoL/L磷酸二氫銨；檢測信號:激發(fā)波長233 nm，發(fā)射波長370 nm。
8.一種基于權(quán)利要求1所述的河豚毒素柱前衍生-高效液相熒光檢測方法用試劑盒，其特征在于，包括以下試劑: (1)衍生試劑1:pH約為12,包括a液、b液和c液，a液、b液和c液之間的體積比為5:2: 3，所述a液為次溴酸鈉貯備液:0.67g溴酸鈉、3.0 g溴化鈉，用蒸餾水溶解并定容至IOmL ;所述b液為5mol/L鹽酸溶液；所述c液為4.81mol/L氫氧化鈉溶液； (2)衍生試劑2:20%尿素溶液； (3)pH維持液:2mol/L碳酸鈉溶液； (4)河豚毒素標準品貯備液:100μ g/mL河豚毒素溶液，內(nèi)含lmmol/L的檸檬酸鹽，pH=5.0 ； (5)終止液:15%磷酸溶液。
【文檔編號】G01N30/02GK103983706SQ201410181792
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年5月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月4日
【發(fā)明者】岑劍偉, 李來好, 楊賢慶, 郝淑賢, 魏涯, 辛少平, 周婉君, 黃卉, 楊少玲, 鄧建朝 申請人:中國水產(chǎn)科學研究院南海水產(chǎn)研究所