專利名稱:一種組織樣品高分辨率斷層光學(xué)顯微成像裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明為一種基于機(jī)械切削實(shí)現(xiàn)組織樣品斷層顯微成像的裝置。
背景技術(shù):
對(duì)組織樣品進(jìn)行高分辨率斷層光學(xué)顯微成像,再進(jìn)行三維重建,可以獲得亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的三維空間分布,對(duì)于神經(jīng)組織,則可以實(shí)現(xiàn)特定神經(jīng)元樹突和軸突的三維空間分布的追蹤,從而了解神經(jīng)元之間的相互連接關(guān)系。為了實(shí)現(xiàn)組織樣品的斷層光學(xué)顯微成像,可以采用光學(xué)層析成像技術(shù):共聚焦成像技術(shù),通過使用共焦小孔阻擋聚焦面以外的信號(hào),實(shí)現(xiàn)層析;雙光子顯微成像技術(shù),利用非線性效應(yīng),有效的光學(xué)信號(hào)只來源于焦點(diǎn)位置,實(shí)現(xiàn)層析;另外,也有近年來受到較多關(guān)注的光片照明層析技術(shù),將激發(fā)光整形為微米厚度的薄層光片,照明樣品中垂直于探測(cè)光軸的一個(gè)面,實(shí)現(xiàn)層析。這些光學(xué)層析成像方法,首先于組織樣品對(duì)光的散射和吸收,所能達(dá)到的成像深度限制在Imm以內(nèi),如果需要對(duì)更大的組織樣品進(jìn)行成像,則需要結(jié)合組織樣品的光透明處理以及機(jī)械切片過程。機(jī)械切片結(jié)合光學(xué)顯微成像方法理論上不會(huì)受制于組織樣品的尺寸和光學(xué)特性。結(jié)合機(jī)械切片與光學(xué)顯微成像有多種方式。最為傳統(tǒng)和直接的方式是先對(duì)組織樣品進(jìn)行切片,再將切片轉(zhuǎn)移到載玻片上進(jìn)行光學(xué)成像。切片和切片的制備過程費(fèi)時(shí),并且因?yàn)楹茈y保證不同切片固定和成像位置的一致性,需要對(duì)不同切片的圖像進(jìn)行空間位置的配準(zhǔn)才能進(jìn)行后續(xù)的三維圖像重建。另一種方式是對(duì)組織樣品的表面進(jìn)行顯微光學(xué)成像或者對(duì)組織樣品的淺表的幾百微米厚度進(jìn)行光學(xué)成像,再去除(機(jī)械切削或激光消融)組織樣品淺表已成像的部分。因?yàn)閬碜员砻嬉韵陆M織樣品信號(hào)的干擾,需要借助光學(xué)層析成像技術(shù)。第三種方式是對(duì)組織樣品進(jìn)行塑性包埋,進(jìn)行微米厚度的薄切片,同時(shí)在切片過程的同時(shí),對(duì)切下并貼覆在切削刀具背面的組織樣品切削條進(jìn)行同步的成像。這種方式切下的組織樣品薄切片與剩余的組織樣品在空間上有一定的分離(取決于刀具的厚度),但因?yàn)閷?duì)塑性包埋的組織樣品進(jìn)行薄切片一般使用透明的金剛石刀,使得金剛石刀下方剩余的樣品仍會(huì)透過金剛石刀而對(duì)光學(xué)成像結(jié)果造成影響,在圖像中疊加上干擾背景。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提出一種通過機(jī)械切削方式和顯微光學(xué)成像實(shí)現(xiàn)組織樣品斷層成像裝置。為解決上述技術(shù)問題,本發(fā)明首先提出了一種組織樣品高分辨率斷層顯微成像裝置,包括組織樣品切片模塊和光學(xué)顯微成像系統(tǒng);所述組織樣品切片模塊包括三維電控移動(dòng)平臺(tái),樣品槽和切削刀具,所述樣品槽安裝在所述三維電控移動(dòng)平臺(tái)上,包埋的組織樣品固定于所述樣品槽中,所述切削刀具固定安裝在所述樣品槽上方,所述切削刀具的切削面與所述組織樣品上表面成鈍角相交,所述光學(xué)顯微成像系統(tǒng)與所述切削刀具相對(duì)位置固定,且聚焦于所述切削刀具頭;所述切削刀具進(jìn)行不透明處理。
優(yōu)選的,所述切削刀具的不透明處理包括,采用在激發(fā)或照明光波長(zhǎng)范圍內(nèi)不透明的材質(zhì)制作刀具,或者,對(duì)刀具表面進(jìn)行硬質(zhì)光學(xué)鍍膜處理,通過鍍膜實(shí)現(xiàn)激發(fā)或照明光波長(zhǎng)范圍內(nèi)的低透過率或高反射率。所述刀具可以是可見光波段透明的硬質(zhì)刀具,但對(duì)其進(jìn)行光學(xué)鍍膜處理,使其在照明或激發(fā)光波段呈現(xiàn)低透過率。為了得到微米厚度的薄組織切片,使用硬質(zhì)刀具,如金剛石刀具。由于金剛石的透明特性,可以在刀具表面鍍反射膜,使金剛石刀在成像系統(tǒng)所使用的照明光或激發(fā)光波長(zhǎng)范圍內(nèi)呈現(xiàn)很低的透過率,從而阻擋切削過程中,對(duì)刀具下方組織樣品的照明或激發(fā),從而抑制下方組織樣品對(duì)刀面上方組織切片的干擾。所述刀具也可使用其他非透明材質(zhì)的刀具,從而無需鍍膜處理。所述顯微光學(xué)成像模塊包括顯微物鏡和成像部分。顯微物鏡與刀具的相對(duì)位置固定,通過調(diào)節(jié)顯微物鏡使其光軸垂直于刀具表面,且焦點(diǎn)處于刀具表面。可以對(duì)切削過程中刀具表面的組織樣品進(jìn)行清晰成像。采用落射照明方式,顯微物鏡同時(shí)起到聚焦照明光或激發(fā)光于刀具表面組織切片,以及收集組織切片信號(hào)光的作用。優(yōu)選的,所述光學(xué)顯微成像系統(tǒng)采用掃描成像方式,掃描成像方式通過物鏡將照明光或激發(fā)光聚焦于刀具表面的組織切片,結(jié)合光束掃描器件和光探測(cè)器實(shí)現(xiàn)組織切片的掃描成像。以電控三維移動(dòng)平臺(tái)的位置反饋信號(hào)為同步信號(hào),同步掃描成像與切片過程,從而保證各斷層圖像相對(duì)位置的一致性。所述顯微光學(xué)成像還可以采用的成像方式可以使用寬場(chǎng)照明結(jié)合陣列探測(cè)器進(jìn)行成像。因?yàn)椴煌该鞯毒叩氖褂茫梢灾苯訉?duì)樣品進(jìn)行寬場(chǎng)照明(面照明或更為集中的線照明),同時(shí)使用陣列探測(cè)器實(shí)現(xiàn)顯微圖像的捕捉。因?yàn)榍衅^程中待成像的切片處于運(yùn)動(dòng)狀態(tài),需要通過電控三維移動(dòng)平臺(tái)的位置反饋信號(hào)逐行觸發(fā)陣列探測(cè)器的曝光和讀出。本發(fā)明的組織樣品高分辨率斷層顯微成像裝置的成像方法,包括以下步驟:步驟1、所述三維電控移動(dòng)平臺(tái)帶動(dòng)所述樣品槽中的組織樣品相對(duì)于所述切削刀具水平運(yùn)動(dòng),所述組織樣品被所述切削刀具切削形成微米厚度的組織樣品切片,在所述組織樣品切片短暫地貼覆于切削刀具上表面滑行的同時(shí),所述光學(xué)顯微成像系統(tǒng)對(duì)短暫貼覆在所述切削刀具上的組織樣品切片進(jìn)行顯微光學(xué)成像。步驟2、所述三維電控移動(dòng)平臺(tái)帶動(dòng)所述樣品槽中的組織樣品相對(duì)于所述切削刀具水平運(yùn)動(dòng)到設(shè)定水平極限值后,所述三維電控移動(dòng)平臺(tái)帶動(dòng)所述樣品槽中的組織樣品退回初始水平位置,然后在垂直方向上向上步進(jìn)一個(gè)切片厚度,再重復(fù)步驟I。逐層切削成像即可獲得組織樣品的完整高分辨率斷層顯微光學(xué)圖像。有益效果:本發(fā)明將顯微光學(xué)成像系統(tǒng)與組織樣品切片系統(tǒng)結(jié)合,在切片的同時(shí)對(duì)貼覆在刀具表面的正在形成的組織切片進(jìn)行同步的顯微光學(xué)成像,實(shí)現(xiàn)組織樣品的斷層顯微光學(xué)成像。在成像過程中,切片沿刀具表面滑動(dòng),滑動(dòng)的速度與切削運(yùn)動(dòng)的速度相同。通過同步匹配圖像采集與切削運(yùn)動(dòng)的時(shí)序,可以獲得運(yùn)動(dòng)中的切片的高分辨率顯微圖像。同時(shí),本發(fā)明采用不透明的刀具將切片與剩余的組織樣品從空間和光信號(hào)上分離開來。使所述光學(xué)顯微成像系統(tǒng)中的照明光或激發(fā)光,不能透過薄切片和刀具對(duì)刀具下方剩余組織樣品進(jìn)行照明或激發(fā),消除正在切削的組織切片以外的組織樣品對(duì)切片采樣的干擾,從而得到無背景干擾的斷層圖像。
下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。圖1為機(jī)械切削實(shí)現(xiàn)組織樣品斷層顯微成像系統(tǒng)的示意圖。圖2為切削刀具與組織樣品切片示意圖。圖3為時(shí)序及圖像米集流程圖。圖4為實(shí)施例1的結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實(shí)施例方式圖1為機(jī)械切削實(shí)現(xiàn)組織樣品斷層顯微成像系統(tǒng)的示意圖。塑性包埋的組織樣品I放置在樣品槽2中。樣品槽2固定于電控三維移動(dòng)平臺(tái)3上。組織樣品1,樣品槽2和電控三維移動(dòng)平臺(tái)3固定為一個(gè)整體??梢噪S電控三維移動(dòng)平臺(tái)3進(jìn)行整體的三維移動(dòng)。刀具4始終處于固定位置。當(dāng)電控三維移動(dòng)平臺(tái)3沿方向5運(yùn)動(dòng)時(shí),塑性包埋的組織樣品塊朝固定的刀具4做相對(duì)運(yùn)動(dòng),從而實(shí)現(xiàn)切片過程。產(chǎn)生的微米厚度的組織樣品切片6就短暫地貼覆于刀具4的上表面并隨著切片運(yùn)動(dòng)沿刀具4的表面滑行。物鏡7相對(duì)于刀具4固定,其光軸與刀具4上表面垂直。物鏡7 —方面將激發(fā)光聚焦于組織樣品切片6上,另一方面將切片6的后向散射光或發(fā)射光(對(duì)熒光樣品)進(jìn)行收集。如圖2所示,組織樣品塊沿方向5相對(duì)刀具4的運(yùn)動(dòng)切片過程可以得到薄組織切片6。對(duì)于塑性包埋硬度到達(dá)要求的組織樣品包埋塊1,組織切片6在靠近刀鋒的位置處會(huì)短暫地貼覆于刀具4的上表面,并隨著切片過程的進(jìn)行沿方向12順著刀具4的上表面滑行一段距離后再逐漸脫離刀具4上表面。位置7附近樣品切片6相對(duì)于刀具4處于比較穩(wěn)定的貼覆和滑行的狀態(tài),對(duì)位置7附近的切片區(qū)域進(jìn)行反復(fù)成像,則隨著切片6的滑行運(yùn)動(dòng),在切片過程完成的同時(shí)可以獲得切片6的完整圖像。在位置7附近,切片6相對(duì)于剩余的組織樣品I在空間上有一定的距離。另一方面,可以對(duì)刀具4的上表面10或下表面11進(jìn)行光學(xué)鍍膜。光學(xué)鍍膜的特性在于其在成像系統(tǒng)所使用的照明光或激發(fā)光波長(zhǎng)范圍內(nèi)具有很低的透過率,沿光軸9方向傳播的照明光或激發(fā)光無法透過刀具4照明或激發(fā)刀具4下方的組織樣品I,使得位置7附近對(duì)組織切片6的成像不會(huì)受到組織樣品I其余部分的干擾,達(dá)到圖像的層析效果。也可通過選擇刀具4的材質(zhì)為在照明或激發(fā)光波長(zhǎng)范圍內(nèi)具有低透過率的材料,實(shí)現(xiàn)切片6與組織樣品I的光學(xué)隔離。圖3所示為切片運(yùn)動(dòng)與圖像采集的時(shí)序。切片過程由電控移動(dòng)平臺(tái)的兩個(gè)運(yùn)動(dòng)階段13組成:即樣品朝向刀具運(yùn)動(dòng)的進(jìn)刀過程,和樣品原理刀具運(yùn)動(dòng)的退刀過程。在進(jìn)刀過程實(shí)現(xiàn)切片。在電控移動(dòng)平臺(tái)的運(yùn)動(dòng)過程中給以產(chǎn)生與平臺(tái)運(yùn)動(dòng)位置相關(guān)的觸發(fā)信號(hào)14。平臺(tái)每次運(yùn)動(dòng)指定的距離15之后開始給出位置觸發(fā)信號(hào)。之后根據(jù)成像像素分辨率的需要,每運(yùn)動(dòng)距離16即產(chǎn)生一次觸發(fā)信號(hào)。該觸發(fā)信號(hào)用于觸發(fā)圖像的逐行采集過程17。距離16即決定了切片圖像每行像素的尺寸。根據(jù)組織樣品的大小,組織切片的圖像由N行像素組成。N=L/S,其中L為切片的總長(zhǎng)度,S為圖像中一行像素的實(shí)際大小,也即為距離16的大小。在逐行圖像采集的過程中對(duì)各行圖像數(shù)據(jù)進(jìn)行組合重建和圖像數(shù)據(jù)的存儲(chǔ)過程18,從而得到一個(gè)組織切片的斷層顯微光學(xué)圖像。重復(fù)上述過程可以逐層得到組織樣品的斷層顯微光學(xué)圖像。
實(shí)施例1如圖4所示為對(duì)綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)記的組織樣品的機(jī)械切削高分辨率斷層光學(xué)顯微成像系統(tǒng)。激光器19輸出波長(zhǎng)為488nm的激光,經(jīng)過柱透鏡20,將光束在柱透鏡20的焦距位置聚焦為線光源。經(jīng)過筒鏡21和物鏡8,在組織切片6上形成一條激發(fā)線。該激發(fā)線位置激發(fā)的樣品熒光信號(hào)經(jīng)物鏡8和筒鏡21成像于線陣列探測(cè)器24的光敏面上,得到切片6熒光圖像中的一行。隨切片運(yùn)動(dòng)的進(jìn)行,切片6沿刀具4表面滑行,并被488nm的激發(fā)線逐行激發(fā),電控平臺(tái)沿方向5運(yùn)動(dòng)過程中,每運(yùn)動(dòng)切片6上一行的距離即產(chǎn)生一個(gè)觸發(fā)信號(hào),控制線陣探測(cè)器24的曝光和數(shù)據(jù)讀出,從而逐行得到切片6的完整熒光圖像。使用金剛石刀具4,為了實(shí)現(xiàn)滿意的斷層成像效果,在金剛石刀具下表面鍍488nm的高反射膜25。在光路中二向色分束鏡21用于實(shí)現(xiàn)488nm激發(fā)光和GFP熒光的分離,為了消除組織切片6、金剛石刀具4和高反射膜25三者反射的488nm激發(fā)光,在線陣探測(cè)器24之前放置488nm的截止片23。具體的,如果使用40x物鏡8,成像像素大小設(shè)為0.5 μ m,則可以采用像素尺寸為20 μ m的線陣相機(jī)為探測(cè)器24。電控移動(dòng)平臺(tái)3配置光柵尺為位置傳感器,使其每運(yùn)動(dòng)
0.5 μ m產(chǎn)生一個(gè)觸發(fā)脈沖。塑性包埋的組織切片在方向5上的尺寸為10mm,則切片運(yùn)動(dòng)過程中,共產(chǎn)生10mm/0.5 μ m=20,000個(gè)觸發(fā)脈沖,將這些觸發(fā)脈沖作為線陣相機(jī)的曝光觸發(fā)信號(hào),則在切片過程中共進(jìn)行20,000次曝光,每次曝光得到組織切片6的一行圖像(行高為
0.5μπι)。20,000行圖像的合成即得到組織切片6的完整圖像。金剛石刀具4下表面的高反射膜,使488nm的激發(fā)光不能透過刀具4激發(fā)其下的組織樣品4,因而組織切片6的圖像不會(huì)受到組織樣品其余部分熒光信號(hào)的干擾,實(shí)現(xiàn)斷層效果的顯微成像效果。實(shí)施例2成像系統(tǒng)結(jié)構(gòu)如實(shí)施例1,如圖4所示。其中刀具4使用不透敏的碳化鎢硬質(zhì)刀具或黑色金剛石刀具。因?yàn)榈毒卟牧献陨淼牟煌该餍?,可以無需在刀具表面進(jìn)行光學(xué)鍍膜處理。成像過程的其他設(shè)置及步驟同實(shí)施例1,故不再贅述。
權(quán)利要求
1.一種組織樣品高分辨率斷層顯微成像裝置,其特征在于,包括組織樣品切片模塊和光學(xué)顯微成像系統(tǒng);所述組織樣品切片模塊包括三維電控移動(dòng)平臺(tái),樣品槽和切削刀具,所述樣品槽安裝在所述三維電控移動(dòng)平臺(tái)上,包埋的組織樣品固定于所述樣品槽中,所述切削刀具固定安裝在所述樣品槽上方,所述切削刀具的切削面與所述組織樣品上表面成鈍角相交,所述光學(xué)顯微成像系統(tǒng)與所述切削刀具相對(duì)位置固定,且聚焦于所述切削刀具頭;所述切削刀具進(jìn)行不透明處理。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織樣品高分辨率斷層顯微成像裝置,其特征在于,所述切削刀具的不透明處理包括,采用在激發(fā)或照明光波長(zhǎng)范圍內(nèi)不透明的材質(zhì)制作刀具,或者,對(duì)刀具表面進(jìn)行硬質(zhì)光學(xué)鍍膜處理,通過鍍膜實(shí)現(xiàn)激發(fā)或照明光波長(zhǎng)范圍內(nèi)的低透過率或高反射率。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的組織樣品高分辨率斷層顯微成像裝置,其特征在于,所述光學(xué)顯微成像系統(tǒng)采用掃描成像方式,或?qū)拡?chǎng)照明或結(jié)合陣列探測(cè)器方式實(shí)現(xiàn)成像。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于機(jī)械切削、在對(duì)組織樣品進(jìn)行薄切片的同時(shí)對(duì)薄切片進(jìn)行顯微光學(xué)成像,實(shí)現(xiàn)組織樣品的高分辨率斷層顯微成像的裝置,該裝置包括組織樣品切片模塊和光學(xué)顯微成像系統(tǒng),切削刀具進(jìn)行不透明處理。本發(fā)明在切削過程切片和組織樣品的物理分離的同時(shí)進(jìn)行斷層成像圖像采集,同時(shí),切削刀具進(jìn)行不透明處理使所述光學(xué)顯微成像系統(tǒng)中的照明光或激發(fā)光,不能透過薄切片和刀具對(duì)刀具下方剩余組織樣品進(jìn)行照明或激發(fā),消除正在切削的組織切片以外的組織樣品對(duì)切片采樣的干擾。可用于對(duì)組織樣品進(jìn)行快速高分辨率的斷層顯微成像。
文檔編號(hào)G01N1/06GK103207150SQ20131009351
公開日2013年7月17日 申請(qǐng)日期2013年3月21日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月21日
發(fā)明者曾紹群, 駱清銘, 龔輝, 呂曉華, 熊汗青 申請(qǐng)人:華中科技大學(xué)