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熒光生物標(biāo)記多微孔板自參考量化檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種熒光生物標(biāo)記多微孔板自參考量化檢測方法，屬于熒光標(biāo)記生物檢測【技術(shù)領(lǐng)域】。解決了現(xiàn)有熒光標(biāo)記生物量化檢測需要另設(shè)參考信號源且標(biāo)準(zhǔn)樣易變，導(dǎo)致量化精度低，易受環(huán)境影響且檢測成本高的技術(shù)問題。本發(fā)明的熒光生物標(biāo)記多微孔板自參考量化檢測方法是在多微孔板中摻雜稀土銩離子，并以稀土銩離子在685nm處的熒光發(fā)射光譜的熒光信號強(qiáng)度作為待測物的熒光信號強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)參考信號強(qiáng)度。本發(fā)明將多微孔板與儀器系統(tǒng)結(jié)合，無需另外設(shè)計標(biāo)準(zhǔn)信號參考源和相應(yīng)的光路，簡化儀器結(jié)構(gòu)，降低成本，使用摻雜的稀土銩離子的熒光信號強(qiáng)度為標(biāo)準(zhǔn)參考信號強(qiáng)度，提高了熒光生物標(biāo)記多微孔板量化分析檢測的穩(wěn)定性、精確度和準(zhǔn)確性。
【專利說明】熒光生物標(biāo)記多微孔板自參考量化檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種熒光生物標(biāo)記多微孔板自參考量化檢測方法，屬于熒光標(biāo)記生物檢測【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]應(yīng)用多微孔板(包括96孔板等)進(jìn)行熒光標(biāo)記生物分子的檢測是當(dāng)前普遍應(yīng)用的技術(shù)和方法之一，許多基于不同材質(zhì)和不同規(guī)格的多微孔板已商品化多年，并被普遍應(yīng)用。但是，基于各種熒光生物探針的生物分子的量化檢測和檢驗都需要采用已知量的標(biāo)準(zhǔn)樣品作為量化參考標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分析檢測，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行量化分析。但是，這些量化檢測用的標(biāo)準(zhǔn)樣品易受時間和環(huán)境影響，從而影響量化檢測和檢驗的穩(wěn)定性、精度和準(zhǔn)確性。除此之外，所有基于多微孔板的熒光生物標(biāo)記量化檢測和檢驗的儀器設(shè)備均需要外設(shè)量化檢測標(biāo)準(zhǔn)信號參考源，這將增加生化分析儀器設(shè)計和結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性和成本?，F(xiàn)有技術(shù)中，還沒有一種穩(wěn)定性好、精度高、準(zhǔn)確性好且成本低的熒光生物標(biāo)記多微孔板量化檢測方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有熒光標(biāo)記生物分子的量化檢測需要另設(shè)參考信號源且標(biāo)準(zhǔn)樣易變，導(dǎo)致量化精度低，易受環(huán)境影響且檢測成本高的技術(shù)問題，提供一種熒光生物標(biāo)記多微孔板自參考量化檢測方法。
[0004]本發(fā)明的熒光生物標(biāo)記多微孔板自參考量化檢測方法是在多微孔板中摻雜稀土銩離子，并以稀土銩離子在685nm處的熒光發(fā)射光譜的熒光信號強(qiáng)度作為待測物的熒光信號強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)參考信號強(qiáng)度。
[0005]進(jìn)一步的，還包括，以稀土銩離子在685nm處的熒光信號強(qiáng)度與待測物的熒光信號強(qiáng)度之比/差為量化光學(xué)分析檢測值，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)而完成待測物的量化檢測。
[0006]進(jìn)一步的，所述在多微孔板中摻雜稀土銩離子的方法是:在多微孔板的前驅(qū)材料中摻雜稀土銩離子后再制備多微孔板。
[0007]進(jìn)一步的，所述多微孔板的前驅(qū)材料為高分子或玻璃。
[0008]進(jìn)一步的，所述待測物為生化細(xì)菌戰(zhàn)劑分子、DNA分子或蛋白質(zhì)分子。
[0009]本發(fā)明的有益效果:
[0010](I)本發(fā)明采用多微孔板中稀土銩離子的熒光信號強(qiáng)度作為待測物熒光信號強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)參考信號強(qiáng)度，將自參考多微孔板與儀器系統(tǒng)結(jié)合，無需另外設(shè)計標(biāo)準(zhǔn)信號參考源和相應(yīng)的光路，簡化儀器結(jié)構(gòu)，降低檢測成本，提高了熒光標(biāo)記生物分子量化分析檢測的穩(wěn)定性、精確度和準(zhǔn)確性；
[0011](2)本發(fā)明的檢測方法適用于各種直徑和形狀的多微孔板，能夠應(yīng)用在整個光譜范圍內(nèi)，適合化學(xué)發(fā)光生物探針、酶標(biāo)記生物探針、生物熒光標(biāo)記生物探針、染料熒光標(biāo)記生物探針和納米標(biāo)記生物探針等方法的生物檢測與檢驗?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0012]圖1中，(a)為實施例1標(biāo)記二抗體ant1-CA-153的QD65tl量子點的熒光發(fā)射光譜與多微孔板中稀土銩離子的熒光發(fā)射光譜，(b)為對比例I中標(biāo)記二抗體ant1-CA-153的QD650量子點的熒光發(fā)射光譜；
[0013]圖2中，(a)為實施例1中(I685-1xVI685與待測物濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線；(b)為對比例I中的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【具體實施方式】
[0014]為了進(jìn)一步了解本發(fā)明，下面結(jié)合【具體實施方式】對本發(fā)明的優(yōu)選實施方案進(jìn)行描述，但是應(yīng)當(dāng)理解，這些描述只是為進(jìn)一步說明本發(fā)明的特征和優(yōu)點而不是對本發(fā)明權(quán)利要求的限制。
[0015]本發(fā)明的熒光生物標(biāo)記多微孔板自參考量化檢測方法是在多微孔板中摻雜稀土銩離子，并以稀土銩離子在685nm處的熒光發(fā)射光譜的熒光信號強(qiáng)度作為待測物的熒光信號強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)參考信號強(qiáng)度，所述待測物的熒光信號強(qiáng)度通常采用熒光生物探針標(biāo)記待測物的方式顯示，所以待測物的熒光信號強(qiáng)度也可以說是待測物熒光生物探針標(biāo)記的熒光信號強(qiáng)度，該檢測方法通常包括以下步驟:
[0016](I)在多微孔板的前驅(qū)材料中摻雜稀土銩離子后，制備多微孔板，多微孔板的前驅(qū)材料為高分子或玻璃，多微孔板的制備與現(xiàn)有技術(shù)相同；
[0017](2)將待測物(如抗原)的配對分子(如抗體分子)植被于步驟(I)制備的多微孔板的表面；
[0018](3)再將含有待測物的緩沖液加入步驟(2)的多微孔板中，清洗；
[0019](4)將用熒光生物探針標(biāo)記的能與待測物發(fā)生反應(yīng)的另一生物分子(如二抗體分子)的緩沖液加入步驟(3)已結(jié)合待測物的多微孔板中，經(jīng)反應(yīng)后，清洗；
[0020](5)利用熒光分析系統(tǒng)進(jìn)行熒光分析，獲得熒光發(fā)射光譜，熒光發(fā)射光譜顯示多微孔板中稀土銩離子在685nm處熒光信號強(qiáng)度和待測物熒光生物探針標(biāo)記的熒光信號強(qiáng)度；
[0021](6)對稀土錢離子在685nm處的突光信號與待測物突光生物探針標(biāo)記的突光信號的相對強(qiáng)度進(jìn)行分析，進(jìn)而完成待測物濃度的檢測；分析通常采用將稀土銩離子在685nm處的熒光信號強(qiáng)度與待測物熒光生物探針標(biāo)記的熒光信號強(qiáng)度的比值或者差值作為量化光學(xué)分析檢測值，如以稀土錢離子在685nm處突光信號強(qiáng)度I685與突光生物標(biāo)記的突光信號強(qiáng)度Ix的差值與I685的比值，即(I685-1xVI685，作為量化光學(xué)分析檢測值，并以此檢測值與待測物濃度X的函數(shù)關(guān)系繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，(I685-1x)/I685=a+bx，其中，a、b為常數(shù)，檢測時，再將檢測得到的(I685-1x)A685代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)而得到待測物濃度X。
[0022]本實施方式所指待測物適用于現(xiàn)有技術(shù)中所有以熒光標(biāo)記多微孔板分析檢測的生物分子，常見的有生化細(xì)菌戰(zhàn)劑分子、DNA分子、蛋白質(zhì)分子，分析時通常采用待測物的buffer緩沖液。
[0023]下面結(jié)合實施例及附圖進(jìn)一步說明本發(fā)明。
[0024]實施例1
[0025]結(jié)合圖1和圖2說明實施例1
[0026](I)在玻璃中摻雜稀土銩離子后，制備6X6的多微孔板，將2組銩離子摻雜制備的多微孔板表面氨基功能化后，將體積為500 μ L，濃度為lmg/mL的抗原CA-153分子的buffer緩沖液中的抗原CA-153分子固定于第一組多微孔板表面，將體積為500 μ L，濃度為lmg/mL的抗體ant1-CA-153分子的buffer緩沖液中的抗體ant1-CA-153分子固定于第二組多微孔板表面，備用；
[0027](2)向第I組多微孔板的2個孔中分別加入體積為500 μ L，濃度分別為20，IOOng/mL的已用QD65tl量子點(熒光發(fā)射峰在650nm處)標(biāo)記的二抗體ant1-CA-153分子的buffer緩沖液,經(jīng)過I小時的免疫結(jié)合反應(yīng)后，形成了抗原CA-153/ 二抗體ant1-CA-153分子+QD65tl量子熒光探針結(jié)構(gòu)，對這兩個孔進(jìn)行水沖清洗后，利用熒光分析系統(tǒng)進(jìn)行熒光分析，檢測獲得兩個孔中稀土銩離子在685nm處的熒光信號強(qiáng)度I685和標(biāo)記濃度分別為20，100ng/mL的標(biāo)記二抗體ant1-CA-153分子的QD65tl量子點的熒光信號強(qiáng)度
1650/20 和 1650/100，
以稀土銩離子在685nm處的熒光信號強(qiáng)度I685與標(biāo)記二抗體ant1-CA-153分子的QD65tl量子點的熒光信號強(qiáng)度工650/20 和 ^650/100 的差值分別與I685的比值，即(I685-165Q/2Q)/I685和(!685-^50/100)/^85為量化光學(xué)分析檢測值，并將這兩個值代入公式y(tǒng)=a+bx,確定y=a+bx公式中的a和b值，并得到標(biāo)準(zhǔn)線性公式y(tǒng)=0.01+0.5x,即(I685-1x)/I685=0.01+0.5x，其中Ix為標(biāo)記待測物的熒光信號強(qiáng)度，X為待測物濃度；應(yīng)用濃度分別為20和lOOng/mL的QD65tl量子點標(biāo)記二抗體ant1-CA-153分子的檢測值代入公式并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到如圖2(a)所示的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0028](3)向第2組多微孔板的四個孔中分別加入體積為500 μ L，濃度分別為20、40、60、80ng/mL的抗原CA-153分子的buffer緩沖液，經(jīng)I小時免疫結(jié)合反應(yīng)后，進(jìn)行水沖清洗，再向這四個孔中分別加入體積為500 μ L，濃度為300ng/mL的已用QD65tl量子點標(biāo)記的二抗體ant1-CA-153分子的buffer緩沖·液,經(jīng)過I小時免疫反應(yīng)后,形成了抗體ant1-CA-153分子/抗原CA-153分子/ 二抗體ant1-CA-153分子+QD65tl量子熒光探針的三明治結(jié)構(gòu)，水沖清洗第2組多微孔板，在與步驟(2)同樣條件下，利用熒光分析系統(tǒng)進(jìn)行熒光分析，檢測四個孔中稀土銩離子在685nm處的熒光信號強(qiáng)度I685和標(biāo)記二抗體ant1-CA-153分子的QD65tl量
子點的突光信號強(qiáng)度650/40Λ 1650/60 ^ Ιθ50/80?

得到稀土銩離子在685nm處的熒光信號強(qiáng)度I685與標(biāo)記二抗體ant1-CA-153分子的QD65tl量子點的熒光信號強(qiáng)度Ix的差值與I685的比值，分力|J 為(1685—1650/20)/工685、^685_Ιθ5θ/4θ) /?θ85Λ ^685_Ιθ5θ/6θ) /^685 矛口 (l685_l650/80)/工685， 將這四個值分別代入步驟(2)的標(biāo)準(zhǔn)線性公式，得到相應(yīng)的濃度值，經(jīng)計算，四個孔中抗原CA-153分子(即待測物)的濃度值分別接近20、40、60、80ng/mL，說明本發(fā)明能夠用于熒光生物標(biāo)記多微孔板自參考量化檢測；再將得到的(I685-1x)/I685與相應(yīng)濃度20、40、60、80ng/mL分別作為縱橫坐標(biāo)，在圖2(a)中標(biāo)示出對應(yīng)的點,如a、b、c、d所示,從圖2(a)可以看出，實施例1的標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢測值的擬合值R=0.996，說明本發(fā)明的方法具有較高的準(zhǔn)確度和精確度。
[0029]圖1中，(a)為實施例1標(biāo)記二抗體ant1-CA-153分子的QD65tl量子點的突光發(fā)射光譜與多微孔板中稀土銩離子位于685nm處的熒光發(fā)射光譜，圖2中，(a)為實施例1中(I685-1x)/I685與待測物濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0030]對比例I
[0031 ] 結(jié)合圖1和圖2說明對比例I
[0032]應(yīng)用醫(yī)學(xué)臨床常用免疫檢測方法:
[0033](I)將2組市售96孔多微孔板表面氨基功能化后，將體積為500 μ L，濃度為Img/mL的抗原CA-153分子的buffer緩沖液中的抗原CA-153分子固定于第一組市售96孔多微孔板表面，將體積為500 μ L,濃度為lmg/mL的抗體ant1-CA-153分子的buffer緩沖液中的抗體ant1-CA-153分子固定于第二組市售96孔多微孔板表面,備用；
[0034](2)將體積為500 μ L，濃度分別為20，100ng/mL的QD65tl量子點標(biāo)記的二抗體ant1-CA-153分子的buffer緩沖液分別加入第一組96孔多微孔板的2個孔中，經(jīng)過I小時的免疫結(jié)合反應(yīng)后，采用熒光免疫分析儀對QD65tl量子點進(jìn)行熒光檢測，分別檢測2個孔中濃度分別為20，100ng/mL的標(biāo)記二抗體ant1-CA-153分子的QD65tl量子點的熒光信號強(qiáng)度值IeKi/2。和I6Ki/i(ici，并以這2個值代入標(biāo)準(zhǔn)線性公式y(tǒng)=a+bx,即可得到a=0.01和b=0.5,進(jìn)而得到標(biāo)準(zhǔn)線性公式:y=0.01+0.5x，即Ix=0.01+0.5x，Ix為標(biāo)記待測物的熒光信號強(qiáng)度，x為待測物濃度，并以濃度為20，100ng/mL的兩個檢測值分別代入公式繪制出以QD65tl量子點的熒光強(qiáng)度和標(biāo)記二抗體ant1-CA-153分子濃度的函數(shù)曲線，作為標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2(b)；
[0035](3)分別將體積為 500 μ L，濃度分別為 O、20、40、60、80、100ng/mL 的抗原 CA-153分子的buffer緩沖液分別加入第二組市售96孔多微孔板中的6個孔中進(jìn)行免疫結(jié)合反應(yīng)I小時，反應(yīng)后，用水沖清洗；將體積為500 μ L,濃度為lmg/mL的QD65tl量子點標(biāo)記的二抗體ant1-CA-153分子的buffer緩沖液分別加入上述6個孔中進(jìn)行免疫結(jié)合反應(yīng)后,反應(yīng)后再次水沖清洗，在與步驟⑵同樣條件下，對獲得6個孔內(nèi)的標(biāo)記二抗體ant1-CA-153分子的QD650量子點進(jìn)行突光分析，分別得到標(biāo)記二抗體ant1-CA-153分子的QD65tl量子點的突光強(qiáng)度值，將這6個值分別代入步驟(2)獲得的標(biāo)準(zhǔn)線性公式，經(jīng)計算得到相應(yīng)的濃度值，結(jié)果與實際濃度值差異較大，并將這6個值結(jié)合相應(yīng)濃度填充在標(biāo)準(zhǔn)曲線中，在圖2(b)上繪制其對應(yīng)的點，％、，從圖2(b)可以看出，對比例I的標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢測值的擬合值R=0.948，說明本發(fā)明的方法較現(xiàn)有技術(shù)的檢測方法準(zhǔn)確度和精確度更高。
[0036]圖1中，(b)為對比例I中標(biāo)記二抗體ant1-CA-153分子的QD65tl量子點的突光發(fā)射光譜，圖2中，(b)為對比例I中的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0037]顯然，以上實施例的說明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對于所述【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修飾也落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.熒光生物標(biāo)記多微孔板自參考量化檢測方法，其特征在于，該檢測方法是在多微孔板中摻雜稀土銩離子，并以稀土銩離子在685nm處的熒光發(fā)射光譜的熒光信號強(qiáng)度作為待測物的熒光信號強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)參考信號強(qiáng)度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光生物標(biāo)記多微孔板自參考量化檢測方法，其特征在于，還包括，以稀土銩離子在685nm處的熒光信號強(qiáng)度與待測物的熒光信號強(qiáng)度之比/差作為量化光學(xué)分析檢測值，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)而完成待測物的量化檢測。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的熒光生物標(biāo)記多微孔板自參考量化檢測方法，其特征在于，所述在多微孔板中摻雜稀土銩離子的方法是:在多微孔板的前驅(qū)材料中摻雜稀土銩離子后再制備多微孔板。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的熒光生物標(biāo)記多微孔板自參考量化檢測方法，其特征在于，所述多微孔板的前驅(qū)材料為高分子或玻璃。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的熒光生物標(biāo)記多微孔板自參考量化檢測方法，其特征在于，所述待測物為生化細(xì)菌戰(zhàn)劑分子、DNA分子或蛋白質(zhì)分子。
【文檔編號】G01N33/533GK103868897SQ201410036560
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年1月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月26日
【發(fā)明者】孔祥貴, 張友林, 涂浪平, 劉曉敏, 常鈺磊, 趙慧穎 申請人:中國科學(xué)院長春光學(xué)精密機(jī)械與物理研究所