一種松蘿鳳梨細(xì)胞核懸液制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種松蘿鳳梨細(xì)胞核懸液制備方法。步驟如下：1）取松蘿鳳梨嫩葉50mg，置于塑料培養(yǎng)皿中加入1ml提取液，所述提取液主要由終濃度如下的組分組成：21g/L一水檸檬酸，10g/L聚乙烯吡咯烷酮K-30，以及體積濃度0.5%吐溫20）使用刀片在提取液中切碎松蘿鳳梨嫩葉，然后收集提取液經(jīng)350目尼龍網(wǎng)過濾，獲得松蘿鳳梨細(xì)胞核懸液。本發(fā)明的有益效果：1）最大限度地減少了有害試劑的使用，如巰基乙醇，減輕了提取液對人體的危害；2）提取液成分簡單，只有三種，均為常規(guī)實(shí)驗(yàn)室試劑，成本低廉，配置容易，可大大降低成本；3）步驟簡單，無需離心，節(jié)省了時間提高了效率，可以在短時間內(nèi)獲得高質(zhì)量的細(xì)胞核懸液用于流式細(xì)胞儀檢測。
【專利說明】一種松蘿鳳梨細(xì)胞核懸液制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種適用于流式細(xì)胞儀分析的松蘿鳳梨細(xì)胞核懸液制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]松蘿鳳梨(TYJJaflWa usuneoides L.),是一種生長在空氣中、不需要土壤、生長所需的水分和營養(yǎng)可以全部來自空氣的特殊植物。松蘿鳳梨抗逆性強(qiáng)又可吸收有毒有害物質(zhì)，已應(yīng)用于環(huán)境指示、室內(nèi)觀賞、裝飾，市場前景廣闊，發(fā)展?jié)摿薮?。但由于松蘿鳳梨特殊的生長方式，相關(guān)分子生物學(xué)、細(xì)胞學(xué)及遺傳育種研究極少，新品種培育也因此受到限制。隨著研究深入，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行植株倍性鑒定、基因組大小測定以及細(xì)胞周期等應(yīng)用和基礎(chǔ)研究對拓寬松蘿鳳梨育種基礎(chǔ)具有重要意義。而其中獲得適用于流式細(xì)胞儀分析的松蘿鳳梨細(xì)胞核懸液成為其中關(guān)鍵技術(shù)。
[0003]松蘿鳳梨葉片含有較多次生代謝物質(zhì)，采用已報(bào)道的方法難以獲得適用于流式細(xì)胞儀分析的松蘿鳳梨細(xì)胞核懸液，或相關(guān)方法繁瑣、含有對人體有害的試劑，這些都阻礙了相關(guān)研究的進(jìn)行。為了對松蘿鳳梨更深入的研究，必須找到一種高效、快捷而又經(jīng)濟(jì)的松蘿鳳梨細(xì)胞核懸液制備方法，這樣才能更有利于松蘿鳳梨相關(guān)研究的開展。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004]本發(fā)明目的是提供一種適用于流式細(xì)胞儀分析的松蘿鳳梨細(xì)胞核懸液，該方法高效、快捷、經(jīng)濟(jì)。
[0005]本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:
一種松蘿鳳梨細(xì)胞核懸液制備方法，步驟如下:
1)取松蘿鳳梨嫩葉50mg，置于塑料培養(yǎng)皿中加入I ml提取液，所述提取液主要由終濃度如下的組分組成:21g/L —水檸檬酸，10g/L聚乙烯吡咯烷酮K-30，以及體積濃度0.5%吐溫20 ；
2)使用刀片在提取液中切碎松蘿鳳梨嫩葉，然后收集提取液經(jīng)350目尼龍網(wǎng)過濾，獲得松蘿鳳梨細(xì)胞核懸液。
[0006]在步驟2)所述的松蘿鳳梨細(xì)胞核懸液中加入DNA突光染料碘化丙錠(propidiumiodide ,終濃度為50 μ g/ ml)，及Rnase (終濃度為50 μ g/ ml)，染色后的提取液用于流式細(xì)胞儀的檢測。
[0007]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在于:
1)最大限度地減少了有害試劑的使用，如巰基乙醇，減輕了提取液對人體的危害；
2)提取液成分簡單，只有三種，均為常規(guī)實(shí)驗(yàn)室試劑，成本低廉，配置容易，可大大降低成本；
3)步驟簡單，無需離心，節(jié)省了時間提高了效率，可以在短時間內(nèi)獲得細(xì)胞核懸液用于流式細(xì)胞儀檢測；
4)可獲得較高質(zhì)量細(xì)胞核懸液用于流式細(xì)胞儀檢測?！緦＠綀D】
【附圖說明】
[0008]圖1采用本發(fā)明制備的松蘿鳳梨細(xì)胞核懸液流式細(xì)胞儀分析直方圖；
圖2采用LBOl法制備的松蘿鳳梨細(xì)胞核懸液流式細(xì)胞儀分析直方圖。
【具體實(shí)施方式】
[0009]下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不僅限于此: 實(shí)施例1
一、試劑的配置
O細(xì)胞核提取液配置:稱取2.1g—水檸檬酸、Ig聚乙烯吡咯烷酮K-30于一干凈的250ml燒杯中，加入體積0.5 ml吐溫20 ;加超純水定容到100ml。用0.22微米濾膜過濾后
4度保存?zhèn)溆谩?br>
[0010]2)突光染料配置:稱取25mg碘化丙錠、25mg核糖核酸酶于一干凈的250ml燒杯中加超純水定容到50ml。用0.22微米濾膜過濾后4度保存?zhèn)溆谩?br>
[0011]二、松蘿鳳梨細(xì)胞核懸液提取方法
(I)取松蘿鳳梨嫩葉(約50 mg)，置于塑料培養(yǎng)皿中加入I ml提取液。(2)使用鋒利剃須刀片在提取液中切碎葉片；(3)收集提取液經(jīng)350目尼龍網(wǎng)過濾，獲得松蘿鳳梨細(xì)胞核懸液；(4)過濾后的提取液中加入DNA熒光染料碘化丙錠(終濃度為50 μ g/ ml)及Rnase(終濃度為SOyg/ ml)。染色后的提取液上流式細(xì)胞儀檢測。
[0012]松蘿鳳梨細(xì)胞核懸液的流式細(xì)胞儀檢測
采用Quanta SC流式細(xì)胞儀(美國貝克曼庫爾特公司),在488 nm激光的激發(fā)下發(fā)出桔紅色熒光，由FL2通道檢測出熒光強(qiáng)度。從隨機(jī)軟件CellLab Quanta SC獲取數(shù)據(jù)，并通過ModFit LT軟件顯示直方圖(橫坐標(biāo)以DNA相對含量反映突光曲線的面積縱坐標(biāo)為細(xì)胞核次數(shù))，結(jié)果見圖1。本發(fā)明制備的松蘿鳳梨細(xì)胞核懸液不僅適用Quanta SC流式細(xì)胞儀，也適用于FACSCalibur (美國Becton-Dickinson公司)等目前市場是所有具有488nm激光器的流式細(xì)胞儀。
[0013]對比例1:采用已報(bào)道的 LBOl 法(Dolezel J, Binarova P, Lucretti S.Analysis of nuclear DNA content in plant cells by flow cytometry.BiologiaPlantarum 1989，31: 113 - 120)提取松蘿鳳梨細(xì)胞核懸液經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測的直方圖，結(jié)果見圖2。無明顯熒光峰，碎片較多，無法用于相關(guān)研究。
【權(quán)利要求】
1.一種松蘿鳳梨細(xì)胞核懸液制備方法，其特征在于，步驟如下: 1)取松蘿鳳梨嫩葉50mg，置于塑料培養(yǎng)皿中加入I ml提取液，所述提取液主要由終濃度如下的組分組成:21g/L —水檸檬酸，10g/L聚乙烯吡咯烷酮K-30，以及體積濃度0.5%吐溫20 ； 2)使用刀片在提取液中切碎松蘿鳳梨嫩葉，然后收集提取液經(jīng)350目尼龍網(wǎng)過濾，獲得松蘿鳳梨細(xì)胞核懸液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，在步驟2)所述的松蘿鳳梨細(xì)胞核懸液中加入DNA突光染料碘化丙錠(propidium iodide ,終濃度為50 μ g/ ml),及Rnase(終濃度為50 μ g/ ml),染色后的提取液用于流式細(xì)胞儀的檢測。
【文檔編號】G01N1/30GK103940656SQ201410115860
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年3月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月26日
【發(fā)明者】金亮, 郁永明, 李小白, 沈福泉, 俞信英, 沈曉嵐, 丁華僑, 王煒勇 申請人:浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究開發(fā)中心
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