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檢測(cè)甲砜霉素、氯霉素及氟苯尼考三合一膠體金層析試紙條及其制備方法
【專(zhuān)利摘要】一種檢測(cè)甲砜霉素、氯霉素及氟苯尼考的三合一膠體金免疫層析試紙條及其制備方法，屬于免疫學(xué)檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明包括單克隆抗體的制備和膠體金免疫層析試紙條的制備兩部分。該單克隆抗體可同時(shí)識(shí)別甲砜霉素、氯霉素及氟苯尼考，并具有高的靈敏度；膠體金免疫層析試紙條包括聚氯乙烯背襯，聚氯乙烯背襯前端設(shè)置樣品墊，樣品墊與硝酸纖維素膜前端連接，硝酸纖維素膜后端與吸水墊連接；結(jié)合墊為膠體金標(biāo)記的單克隆抗體；硝酸纖維素膜上依次包被有氯霉素琥珀酸鈉-BSA抗原檢測(cè)線(xiàn)T線(xiàn)和羊抗鼠IgG控制線(xiàn)C線(xiàn)。本發(fā)明檢測(cè)快速，僅需要3-5min；便攜，適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)；操作簡(jiǎn)便，不需要專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員。
【專(zhuān)利說(shuō)明】檢測(cè)甲砜霉素、氯霉素及氟苯尼考三合一膠體金層析試紙條及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種檢測(cè)甲砜霉素、氯霉素及氟苯尼考的三合一膠體金免疫層析試紙條及其制備方法，屬于免疫學(xué)檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002]氯霉素類(lèi)抗生素是廣泛使用的獸藥之一。目前主要有氯霉素(CAP)、甲砜霉素(TAP)和氟苯尼考(FF)三種藥物，其中甲砜霉素是氟苯尼考的衍生物，它們的抗菌作用與氯霉素相似。氯霉素會(huì)導(dǎo)致人體再生障礙性貧血，這種毒性作用與劑量和療程無(wú)關(guān)，國(guó)際上相繼禁止或嚴(yán)格限制使用氯霉素。氟苯尼考和甲砜霉素是氯霉素的替代物，但大量使用導(dǎo)致其在畜產(chǎn)品以及奶制品中大量殘留，危害人體健康。因此，我國(guó)規(guī)定氯霉素禁止使用，甲砜霉素在各動(dòng)物組織的最大殘留限量為50μ g/kg，氟苯尼考胺為氟苯尼考的標(biāo)志殘留物，在肌肉中的最大殘留限量為1000 μ g/kg。
[0003]動(dòng)物飼料和組織中氯霉素類(lèi)藥物殘留是獸藥殘留研究領(lǐng)域的重點(diǎn)監(jiān)控對(duì)象，因此，亟待建立一種快速、靈敏、準(zhǔn)確的氯霉素類(lèi)藥物殘留檢測(cè)方法，確保動(dòng)物性食品的安全。
[0004]目前的檢測(cè)方法主要是儀器分析法和免疫分析法。儀器分析方法主要包括高效液相色譜法、液質(zhì)聯(lián)用(HPLC-MS)、氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)等，這些方法精密度高但需要昂貴的儀器設(shè)備，操作需要專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員，且不能適應(yīng)高通量、現(xiàn)場(chǎng)的快速檢測(cè)。免疫分析法主要為酶聯(lián)免疫檢測(cè)法，其檢測(cè)成本高，并不適合企業(yè)低成本檢測(cè)的需要。因此實(shí)現(xiàn)具有快速、便于攜帶、低成本的多殘留檢測(cè)具有現(xiàn)實(shí)意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種能夠檢測(cè)甲砜霉素、氯霉素及氟苯尼考的膠體金免疫層析試紙條及其制備方法，該方法是基于能同時(shí)識(shí)別甲砜霉素、氯霉素及氟苯尼考三種藥物，并具有高靈敏度的單克隆抗體。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案，一種檢測(cè)甲砜霉素、氯霉素及氟苯尼考的三合一膠體金免疫層析試紙條，包括聚氯乙烯PVC背襯，聚氯乙烯PVC背襯前端設(shè)置樣品墊，樣品墊通過(guò)結(jié)合墊與硝酸纖維素膜前端連接，硝酸纖維素膜后端與吸水墊連接；所述結(jié)合墊上含有膠體金標(biāo)記的單克隆抗體；硝酸纖維素膜上包被有氯霉素琥珀酸鈉-BSA檢測(cè)線(xiàn)T線(xiàn)和羊抗鼠IgG控制線(xiàn)C線(xiàn)。
[0007]氯霉素琥珀酸鈉-BSA是用于檢測(cè)甲砜霉素、氯霉素及氟苯尼考的抗原，檢測(cè)線(xiàn)與質(zhì)控線(xiàn)平行。
[0008]膠體金標(biāo)記能同時(shí)識(shí)別甲砜霉素、氯霉素及氟苯尼考的單克隆抗體的制備與純化:
以甲砜霉素的類(lèi)似物即1- (4-氨基苯基)-2- 二氯乙胺-1，3-丙二醇TAP-NH2作為半抗原，采用重氮化法將其與牛血清蛋白BSA偶聯(lián)得到免疫原，混合弗氏佐劑免疫BALB/c小鼠；取合格的免疫小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞sp/20融合，經(jīng)過(guò)三次亞克隆和間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA的篩選得到能穩(wěn)定分泌可同時(shí)識(shí)別甲砜霉素、氯霉素及氟苯尼考的單克隆抗體的細(xì)胞株，將其進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)后，注射到小鼠體內(nèi)誘發(fā)產(chǎn)生腹水；采用辛酸-飽和硫酸銨法純化腹水即得到單克隆抗體。
[0009]所述檢測(cè)甲砜霉素、氯霉素及氟苯尼考的三合一膠體金免疫層析試紙條的制備方法，步驟為:
(1)可同時(shí)識(shí)別甲砜霉素、氯霉素及氟苯尼考的單克隆抗體的制備與純化:
(2)檢測(cè)抗原氯霉素琥珀酸鈉-BSA偶聯(lián)物的制備:將氯霉素琥珀酸鈉與水溶性碳二亞胺EDC以摩爾比1: 3溶于0.lmol/L、pH 6.5的2-(N-嗎啡啉)MES緩沖溶液中，室溫活化6h，之后將活化物逐滴加入溶解了牛血清蛋白BSA的0.01mol/L、pH 7.0的磷酸鹽緩沖液PBS中，牛血清蛋白BSA和氯霉素琥珀酸鈉的摩爾比為1: 40，室溫反應(yīng)12h，4°C透析3天，形成氯霉素琥珀酸鈉-BSA偶聯(lián)物；
(3)膠體金溶液的制備:用朽1檬酸三鈉還原劑將氯金酸還原制成20-40nm膠體金顆粒；
(4)該單抗標(biāo)記的膠體金溶液的制備:取步驟(3)制備的4mL膠體金調(diào)至pH9.0，攪拌下逐滴加入蛋白濃度為0.lmg/mL的單克隆抗體0.4mL,放置30min后加入牛血清蛋白BSA使終濃度為1%，放置至少30min后，10000r/min離心50min,并用0.002mol/L、pH 9.0的硼酸鹽緩沖液4mL重懸兩次，最后用該硼酸鹽緩沖液0.4mL重懸，得到穩(wěn)定的單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物；
(5)小鼠血清-膠體金標(biāo)記物的制備:將步驟(4)中的受體替換為陰性小鼠的純化血清，重復(fù)步驟(4)，得到小鼠血清-膠體金標(biāo)記物；
(6)硝酸纖維素膜的處理:將氯霉素琥珀酸鈉-BSA偶聯(lián)物和羊抗鼠IgG分別包被在作為反應(yīng)墊的硝酸纖維素膜的檢測(cè)線(xiàn)T線(xiàn)和控制線(xiàn)C線(xiàn)，在37°C烘箱干燥；即得到包被后的硝酸纖維素膜；
(7)三合一試紙條的組裝:將樣品墊(2)、結(jié)合墊(3)、硝酸纖維素膜(4)、吸水墊(5)由一端依次黏附在PVC背襯(I)上，即得到用于檢測(cè)的免疫層析試紙條。
[0010]所述的檢測(cè)甲砜霉素、氯霉素及氟苯尼考的三合一膠體金免疫層析試紙條，其對(duì)甲砜霉素、氟苯尼考及氯霉素的最低檢測(cè)限分別是lng/mL,2.5ng/mL, Ing/mL。
[0011]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明提供一種便攜、快速、適合進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的免疫層析色譜檢測(cè)法(gold immunochromatography assay ;GICA),能實(shí)現(xiàn)甲砜霉素、氯霉素及氟苯尼考的同時(shí)檢測(cè)。本發(fā)明檢測(cè)快速，僅需要3-5分鐘；便攜，適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)；操作簡(jiǎn)便，不需要專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0012]圖1組裝完成的免疫層析試紙條俯視圖。
[0013]圖2該試紙條對(duì)甲砜霉素的檢測(cè)結(jié)果。
[0014]圖3該試紙條對(duì)氟苯尼考的檢測(cè)結(jié)果。
[0015]圖4該試紙條對(duì)氯霉素的檢測(cè)結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0016]實(shí)施例1
如圖1所示，一種檢測(cè)甲砜霉素、氯霉素及氟苯尼考的三合一膠體金免疫層析試紙條，包括聚氯乙烯PVC背襯1，聚氯乙烯PVC背襯I前端設(shè)置樣品墊2，樣品墊2通過(guò)結(jié)合墊3與硝酸纖維素膜4前端連接，硝酸纖維素膜4后端與吸水墊5連接；所述結(jié)合墊3上含有膠體金標(biāo)記的單克隆抗體；硝酸纖維素膜4上包被有氯霉素琥珀酸鈉-BSA檢測(cè)線(xiàn)T線(xiàn)6和羊抗鼠IgG控制線(xiàn)C線(xiàn)7。
[0017]實(shí)施例2
所述檢測(cè)甲砜霉素、氯霉素及氟苯尼考的三合一膠體金免疫層析試紙條的制備方法，步驟為:
(1)可同時(shí)識(shí)別甲砜霉素、氯霉素和氟苯尼考的單克隆抗體的制備與純化:以甲砜霉素的類(lèi)似物，即1-(4-氨基苯基)-2- 二氯乙胺-1，3-丙二醇(TAP-NH2)作為半抗原,米用重氮化法將其與牛血清蛋白(BSA)偶聯(lián)得到免疫原，混合弗氏佐劑免疫BALB/c小鼠；取合格的免疫小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞sp2/0融合，經(jīng)過(guò)三次亞克隆和間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA的篩選得到能穩(wěn)定分泌可同時(shí)識(shí)別甲砜霉素、氯霉素及氟苯尼考的單克隆抗體的細(xì)胞株，將其進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)后，注射到小鼠體內(nèi)誘發(fā)產(chǎn)生腹水；采用辛酸-飽和硫酸銨法純化腹水即得到單克隆抗體；
(2)檢測(cè)抗原氯霉素琥珀酸鈉-BSA偶聯(lián)物的制備:將氯霉素琥珀酸鈉與水溶性碳二亞胺EDC以摩爾比1: 3溶于0.lmol/L、pH 6.5的2-(N-嗎啡啉)MES緩沖溶液中，室溫活化6h，之后將活化物逐滴加入溶解了牛血清蛋白BSA的0.01mol/L、pH 7.0的磷酸鹽緩沖液PBS中，牛血清蛋白BSA和氯霉素琥珀酸鈉的摩爾比為1: 40，室溫反應(yīng)12h，4°C透析3天，形成氯霉素琥珀酸鈉-BSA偶聯(lián)物；
(3)膠體金溶液的制備:用朽1檬酸三鈉還原劑將氯金酸還原制成20-40nm膠體金顆粒；
(4)該單抗標(biāo)記的膠體金溶液的制備:取步驟(3)制備的4mL膠體金調(diào)至pH9.0，攪拌下逐滴加入蛋白濃度為0.lmg/mL的單克隆抗體0.4mL,放置30min后加入牛血清蛋白BSA使終濃度為1%，放置至少30min后，10000r/min離心50min,并用0.002mol/L、pH 9.0的硼酸鹽緩沖液4mL重懸兩次，最后用該硼酸鹽緩沖液0.4mL重懸，得到穩(wěn)定的單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物；
(5)小鼠血清-膠體金標(biāo)記物的制備:將步驟(4)中的受體替換為陰性小鼠的純化血清，重復(fù)步驟(4)，得到小鼠血清-膠體金標(biāo)記物；
(6)硝酸纖維素膜的處理:將氯霉素琥珀酸鈉-BSA偶聯(lián)物和羊抗鼠IgG分別包被在作為反應(yīng)墊的硝酸纖維素膜的檢測(cè)線(xiàn)T線(xiàn)和控制線(xiàn)C線(xiàn)，在37°C烘箱干燥；即得到包被后的硝酸纖維素膜；
(7)三合一試紙條的組裝:將樣品墊2、結(jié)合墊3、硝酸纖維素膜4、吸水墊5由一端依次黏附在PVC背襯I上，即得到用于檢測(cè)的免疫層析試紙條。
[0018]應(yīng)用實(shí)施例1
驗(yàn)證本發(fā)明的可靠性試驗(yàn):(如圖2-圖4所示)
(I)用甲醇分別溶解甲砜霉素、氯霉素及氟苯尼考，分別得到濃度為lmg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品母液，然后用0.01M、pH為7.4的磷酸鹽緩沖液分別進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)鳛闃悠废♂屢骸D2中 l、0ppbTAP，2、0.5ppbTAP，3、lppbTAP，4、2.5ppbTAP ;圖 3 中為 l、0ppbFF，2、IppbFF，3、2.5ppbFF，4、5ppbFF ;圖 4 中為 l、OppbCAP，2、0.125ppbCAP，3、0.25ppbCAP，4、0.5ppbCAP，5、IppbCAP。
[0019](2)吸取待測(cè)樣品溶液中100 μ L滴加到試紙條的樣品墊上，滴加樣品后開(kāi)始計(jì)時(shí)；
(3)在滴加樣品后3-5min讀取結(jié)果，讀取時(shí)，將試紙條以樣品墊一端向下的方式垂直于觀察者正面；
(4)結(jié)果判斷:如果在硝酸纖維素膜上僅有C線(xiàn)一條紅線(xiàn)顯現(xiàn)，表示檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性；如果在硝酸纖維素膜上C線(xiàn)和T線(xiàn)兩條紅線(xiàn)都顯現(xiàn)，表示檢測(cè)結(jié)果為陰性；如果在硝酸纖維素膜上C線(xiàn)紅線(xiàn)不顯現(xiàn)，則表明試紙條已失效。
[0020]應(yīng)用實(shí)施例2
(I)將純牛奶與0.0lM PBS按1:9混合得到牛奶混合液。
[0021](2)檢測(cè)時(shí)取100 μ L上述稀釋液，滴加到試紙條的樣品墊上，加樣后開(kāi)始計(jì)時(shí)。
[0022](3)在滴加樣品后3_5min讀取結(jié)果，讀取時(shí)，將試紙條以樣品墊一端向下的方式垂直于觀察者正面；
(4)結(jié)果判斷:如果在硝酸纖維素膜上僅有C線(xiàn)一條紅線(xiàn)顯現(xiàn)，表示檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性；如果在硝酸纖維素膜上C線(xiàn)和T線(xiàn)兩條紅線(xiàn)都顯現(xiàn)，表示檢測(cè)結(jié)果為陰性；如果在硝酸纖維素膜上C線(xiàn)紅線(xiàn)不顯現(xiàn)，則表明試紙條已失效。
[0023]上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種檢測(cè)甲砜霉素、氯霉素及氟苯尼考的三合一膠體金免疫層析試紙條，其特征在于:包括聚氯乙烯PVC背襯(1)，聚氯乙烯PVC背襯(I)前端設(shè)置樣品墊(2)，樣品墊(2)通過(guò)結(jié)合墊(3)與硝酸纖維素膜(4)前端連接，硝酸纖維素膜(4)后端與吸水墊(5)連接； 所述結(jié)合墊(3)上含有膠體金標(biāo)記的單克隆抗體；硝酸纖維素膜(4)上包被有氯霉素琥珀酸鈉-BSA檢測(cè)線(xiàn)T線(xiàn)(6)和羊抗鼠IgG控制線(xiàn)C線(xiàn)(7)； 氯霉素琥珀酸鈉-BSA是用于檢測(cè)甲砜霉素、氯霉素及氟苯尼考的抗原，檢測(cè)線(xiàn)與質(zhì)控線(xiàn)平行。
2.權(quán)利要求1中所述的試紙條所用的膠體金標(biāo)記能同時(shí)識(shí)別甲砜霉素、氯霉素及氟苯尼考的單克隆抗體的制備，其特征在于: 以甲砜霉素的類(lèi)似物即1- (4-氨基苯基)-2- 二氯乙胺-1，3-丙二醇TAP-NH2作為半抗原，采用重氮化法將其與牛血清蛋白BSA偶聯(lián)得到免疫原，混合弗氏佐劑免疫BALB/c小鼠；取合格的免疫小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞sp/20融合，經(jīng)過(guò)三次亞克隆和間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA的篩選得到能穩(wěn)定分泌可同時(shí)識(shí)別甲砜霉素、氯霉素及氟苯尼考的單克隆抗體的細(xì)胞株，將其進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)后，注射到小鼠體內(nèi)誘發(fā)產(chǎn)生腹水；采用辛酸-飽和硫酸銨法純化腹水即得到單克隆抗體。
3.權(quán)利要求1所述檢測(cè)甲砜霉素、氯霉素及氟苯尼考的三合一膠體金免疫層析試紙條的制備方法，其特征在于步驟為: (O同時(shí)識(shí)別甲砜霉素、氯霉素及氟苯尼考的單克隆抗體的制備與純化:如權(quán)利要求2所述； (2)檢測(cè)抗原氯霉素琥珀酸鈉-BSA偶聯(lián)物的制備:將氯霉素琥珀酸鈉與水溶性碳二亞胺EDC以摩爾比1: 3溶于0.lmol/L、pH 6.5的2-(N-嗎啡啉)MES緩沖溶液中，室溫活化6h，之后將活化物逐滴加入溶解了牛血清蛋白BSA的0.0lmol/L、pH 7.0的磷酸鹽緩沖液PBS中，牛血清蛋白BSA和氯霉素琥珀酸鈉的摩爾比為1: 40，室溫反應(yīng)12h，4°C透析3天，形成氯霉素琥珀酸鈉-BSA偶聯(lián)物； (3)膠體金溶液的制備:用朽1檬酸三鈉還原劑將氯金酸還原制成20-40nm膠體金顆粒； (4)該單抗標(biāo)記的膠體金溶液的制備:取步驟(3)制備的4mL膠體金調(diào)至pH9.0，攪拌下逐滴加入蛋白濃度為0.lmg/mL的單克隆抗體0.4mL,放置30min后加入牛血清蛋白BSA使終濃度為1%，放置至少30min后，10000r/min離心50min,并用0.002mol/L、pH 9.0的硼酸鹽緩沖液4mL重懸兩次，最后用該硼酸鹽緩沖液0.4mL重懸，得到穩(wěn)定的單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物； (5)小鼠血清-膠體金標(biāo)記物的制備:將步驟(4)中的受體替換為陰性小鼠的純化血清，重復(fù)步驟(4)，得到小鼠血清-膠體金標(biāo)記物； (6)硝酸纖維素膜的處理:將氯霉素琥珀酸鈉-BSA偶聯(lián)物和羊抗鼠IgG分別包被在作為反應(yīng)墊的硝酸纖維素膜的檢測(cè)線(xiàn)T線(xiàn)和控制線(xiàn)C線(xiàn)，在37°C烘箱干燥；即得到包被后的硝酸纖維素膜； (7)三合一試紙條的組裝:將樣品墊(2)、結(jié)合墊(3)、硝酸纖維素膜(4)、吸水墊(5)由一端依次黏附在PVC背襯(I)上，即得到用于檢測(cè)的免疫層析試紙條。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)甲砜霉素、氯霉素及氟苯尼考的三合一膠體金免疫層析試紙條，其特征在于其對(duì)甲砜霉素、氟苯尼考及氯霉素的最低檢測(cè)限分別是lng/mL，2.5ng/



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【文檔編號(hào)】G01N33/577GK104237521SQ201410548219
【公開(kāi)日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2014年10月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月16日
【發(fā)明者】匡華, 郭玲玲, 胥傳來(lái), 徐麗廣, 馬偉, 劉麗強(qiáng), 宋珊珊, 吳曉玲 申請(qǐng)人:江南大學(xué)