久久一区二区免费播放,国产在线欧美日韩一区二区,国产综合色在线视频,精品伊人久久久香线蕉,精品视频麻豆网站,玖玖国产,国内精品久久久久影,在线观看精品视频一区二区三区,午夜久久影院,国产精品一区久久

抗牛γ干擾素雙抗體夾心ELISA試劑盒及其制備方法
【專利摘要】抗牛γ干擾素雙抗體夾心ELISA試劑盒及其制備方法，屬于生物技術(shù)檢測(cè)領(lǐng)域，從雜交瘤細(xì)胞株BovinIFNgamma-3E1分泌獲得抗牛γ干擾素單克隆抗體3E1，從雜交瘤細(xì)胞株BovinIFNgamma-6E5分泌獲得抗牛γ干擾素單克隆抗體6E5，將抗牛γ干擾素單克隆抗體3E1包被在酶標(biāo)板上，在抗牛γ干擾素單克隆抗體6E5上標(biāo)記酶。以此制備具有包被抗牛γ干擾素單克隆抗體3E1的酶標(biāo)板和酶標(biāo)記抗牛γ干擾素單克隆抗體6E5的檢測(cè)牛γ干擾素的雙抗體夾心ELISA試劑盒，具有操作簡(jiǎn)便，不需要精密儀器，普通實(shí)驗(yàn)室即可進(jìn)行的特點(diǎn)。
【專利說(shuō)明】抗牛Y干擾素雙抗體夾心ELISA試劑盒及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)牛Y干擾素的雙抗體夾心ELISA試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]干擾素是一組具有多種功能的活性蛋白質(zhì)(主要是糖蛋白)，一般由干擾素誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)產(chǎn)生，它是一種由單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，其類型分為三類，α-(白細(xì)胞)型、(成纖維細(xì)胞)型，Y-(淋巴細(xì)胞)型；它們?cè)谕N細(xì)胞上具有廣譜的抗病毒、影響細(xì)胞生長(zhǎng)，以及分化、調(diào)節(jié)免疫功能等多種生物活性。干擾素可增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)、巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的活力，從而起到免疫調(diào)節(jié)作用，并增強(qiáng)抗病毒能力。
[0003]干擾素(IFN)作為一種廣譜抗病毒劑，并不直接殺傷或抑制病毒，而主要是通過(guò)細(xì)胞表面受體作用使細(xì)胞產(chǎn)生抗病毒蛋白，從而抑制病毒的復(fù)制。
[0004]牛結(jié)核病是由牛結(jié)核分枝桿菌所引起的一種慢性消耗性傳染病，可通過(guò)病畜傳播給人類或其它動(dòng)物。結(jié)核病除了感染人外，還能感染50多種哺乳動(dòng)物和20多種禽類。牛結(jié)核病在世界各國(guó)均有發(fā)生，在我國(guó)依然是常見(jiàn)的多發(fā)性疾病，其傳播流行不但影響到畜牧業(yè)的持續(xù)發(fā)展，更嚴(yán)重影響著人類的健康。目前，國(guó)內(nèi)外用于診斷牛結(jié)核病的檢驗(yàn)方法，大體上可分為三類:一是細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)方法，如涂片鏡檢、細(xì)菌培養(yǎng)和動(dòng)物接種等；第二類為采用分子生物學(xué)檢驗(yàn)方法，如生物探針?lè)?、PCR法等；第三類是采用免疫學(xué)方法檢測(cè)，如皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)、ELISA和ELISP0T法等。皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)曾在牛結(jié)核病的診斷與防治過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用，但該方法的欠缺之處在于干擾結(jié)核病檢疫的因素很多，既有物理性的，也有化學(xué)性的，更多的是非典型分支桿菌的干擾，因?yàn)楦鞣种U菌均表現(xiàn)出相互交叉的變態(tài)反應(yīng)，常造成非特異性反應(yīng)的發(fā)生。世界各國(guó)都傾力于牛結(jié)核病的快速診斷方法研究，建立了一些新型、快速、準(zhǔn)確、可靠的檢測(cè)方法，并在這個(gè)領(lǐng)域取得了矚目的進(jìn)展。20世紀(jì)90年代Wood等證明牛結(jié)核分枝桿菌侵染機(jī)體后會(huì)刺激機(jī)體淋巴細(xì)胞形成記憶淋巴細(xì)胞，使淋巴細(xì)胞致敏，將無(wú)菌采集到的牛血用牛結(jié)核分枝桿菌的特異性抗原(BPPD)再次刺激，就會(huì)導(dǎo)致全血中的致敏淋巴細(xì)胞被活化，釋放出大量的Y-干擾素，因此可以通過(guò)檢測(cè)牛全血上清中的Y-干擾素來(lái)達(dá)到檢測(cè)牛結(jié)核病的目的。這種全血Y干擾素測(cè)定法已顯示出能為人、猴、牛、水牛、綿羊和山羊等動(dòng)物一系列疾病的診斷提供快速靈敏的手段，并且牛Y干擾素測(cè)定法的廣泛性田間試驗(yàn)已在世界上許多國(guó)家(包括澳大利亞、愛(ài)爾蘭、新西蘭、阿根廷、西班牙、意大利和美國(guó))完成，正逐步取代結(jié)合菌素皮內(nèi)試驗(yàn)，Y-干擾素診斷法的敏感性為81.8%?100%，特異性為94%?100%，比皮試更敏感。然而，建立快速、準(zhǔn)確、敏感、特異以及簡(jiǎn)便的診斷方法的關(guān)鍵是高特異性和親和力的單克隆抗體的獲得。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明目的是提供一種快速、準(zhǔn)確、敏感、特異以及簡(jiǎn)便的診斷方法的檢測(cè)牛Y干擾素雙抗體夾心ELISA試劑盒。[0006]本發(fā)明包括:
(1)包被抗牛Y干擾素單克隆抗體3E1(捕獲抗體)的酶標(biāo)板；
(2)酶標(biāo)記抗牛Y干擾素單克隆抗體6E5(檢測(cè)抗體)；
其中，包被在酶標(biāo)板的抗牛Y干擾素單克隆抗體與酶標(biāo)記抗牛Y干擾素單克隆抗體分別針對(duì)牛Y干擾素不同表位。
[0007]此外，本發(fā)明試劑盒還可以包括以下試劑中的一種或多種:稀釋液、洗滌液、底物顯色液、終止液等。
[0008]運(yùn)用本發(fā)明檢測(cè)試劑盒可檢測(cè)天然的牛Y干擾素，以及人工表達(dá)的重組牛Y干擾素。本發(fā)明為牛細(xì)胞免疫研究和牛結(jié)核病的快速檢測(cè)提供了可靠的手段。本發(fā)明試劑盒便于操作、使用成本低、重復(fù)性好，適合大規(guī)模推廣應(yīng)用。
[0009]本發(fā)明以合成肽和GST-牛Y干擾素純化的蛋白作為抗原制備抗牛Y干擾素單克隆抗體，得到一系列不同抗原表位的單克隆抗體，通過(guò)進(jìn)一步篩選，結(jié)果獲得2株針對(duì)牛Y干擾素抗原不同表位的雜交瘤細(xì)胞株，該細(xì)胞株分泌的單克隆抗體效價(jià)高，特異性強(qiáng)，檢測(cè)反應(yīng)性效果好。
[0010]本發(fā)明為牛Y干擾素的快速檢測(cè)提供了可靠的手段。該試劑盒操作簡(jiǎn)便、快速，可以用于牛細(xì)胞免疫學(xué)研究和牛結(jié)核病的快速檢測(cè)。適用于高等學(xué)校，科研單位、市級(jí)以上獸醫(yī)部門和出入境檢驗(yàn)檢疫局的科學(xué)研究和牛結(jié)核病的檢測(cè)。該方法所需成本低廉，經(jīng)濟(jì)效益顯著、應(yīng)用前景廣泛。
[0011]本發(fā)明還提出以上試劑盒的制備方法:` 從雜交瘤細(xì)胞株Bovin IFN gamma_3El分泌獲得抗牛、干擾素單克隆抗體3E1,從雜交瘤細(xì)胞株Bovin IFN gamma_6E5分泌獲得抗牛、干擾素單克隆抗體6E5,將抗牛、干擾素單克隆抗體3E1包被在酶標(biāo)板上，在抗牛Y干擾素單克隆抗體6E5上進(jìn)行酶標(biāo)記。
[0012]包被在酶標(biāo)板的抗牛Y干擾素單克隆抗體3E1為雜交瘤細(xì)胞株Bovin IFNgamma-3El (分類命名:雜交瘤細(xì)胞株，保藏號(hào):CGMCC N0.7105)分泌獲得；酶標(biāo)記抗牛、干擾素單克隆抗體6E5為雜交瘤細(xì)胞株Bovin IFN gamma-6E5 (分類命名:雜交瘤細(xì)胞株，保藏號(hào):CGMCC N0.7104)分泌獲得。
[0013]本發(fā)明所述酶標(biāo)記抗牛Y干擾素單克隆抗體6E5，是采用商品化酶標(biāo)記試劑盒通過(guò)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記而成。
[0014]單克隆抗體可按照如下方法包被到酶標(biāo)板:將單克隆抗體用碳酸氫鈉緩沖液稀釋到0.35Pg/mL，按?οομL孔加入到酶標(biāo)板中，4°C放置12_16h，用PBST洗滌后，用5%脫脂乳、350μL7孔，37 °C封閉2h，再用PBST洗滌。
【具體實(shí)施方式】
[0015]以下實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。
[0016]若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
[0017]1.抗牛Y干擾素單克隆抗體的細(xì)胞株
抗牛Y干擾素單克隆抗體細(xì)胞株Bovin IFN gamma_3El,分類命名:雜交瘤細(xì)胞株，由中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保存，保藏號(hào)=CGMCC N0.7105，保藏地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)。
[0018]抗牛Y干擾素單克隆抗體細(xì)胞株Bovin IFN gamma_6E5,分類命名:雜交瘤細(xì)胞株，由中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保存，保藏號(hào)=CGMCC N0.7104，保藏地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)。
[0019]包被在酶標(biāo)板的抗牛Y干擾素單克隆抗體為上述雜交瘤細(xì)胞株Bovin IFNgamma-3El (細(xì)胞保藏號(hào):CGMCC N0.7105)分泌獲得。
[0020]酶標(biāo)記抗牛Y干擾素單克隆抗體為上述雜交瘤細(xì)胞株Bovin IFN gamma_6E5(細(xì)胞保藏號(hào)=CGMCC N0.7104)分泌獲得。[0021]2.抗牛Y干擾素單克隆抗體3E1和6E5的制備
(I)將保存的能分泌抗牛Y干擾素單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株Bovin IFN gamma_3El(分類命名:雜交瘤細(xì)胞株，保藏號(hào)=CGMCC N0.7105)的細(xì)胞株從液氮中取出，37°C復(fù)蘇，待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好后，準(zhǔn)備制備小鼠腹水抗體。即取10周齡Balb/c母鼠，腹腔注射石蠟油，每只注射0.5ml，10天后，取用DMEM培養(yǎng)基稀釋雜交瘤細(xì)胞，每只小鼠腹腔注射300萬(wàn)雜交瘤細(xì)胞，待小鼠腹部明顯膨大后采腹水，將采集的腹水1000Orpm離心5min，取上清，于_20°C保存。用protein G親和柱純化抗體并測(cè)定濃度和效價(jià)，分裝，_70°C凍存。
[0022](2)將保存的能分泌抗牛Y干擾素單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株Bovin IFNgamma-6E5 (分類命名:雜交瘤細(xì)胞株，保藏號(hào):CGMCC N0.7104)的細(xì)胞株從液氮中取出，37°C復(fù)蘇，待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好后，準(zhǔn)備制備小鼠腹水抗體。即取10周齡Balb/c母鼠，腹腔注射石蠟油，每只注射0.5ml, 10天后，取用DMEM培養(yǎng)基稀釋雜交瘤細(xì)胞，每只小鼠腹腔注射300萬(wàn)雜交瘤細(xì)胞，待小鼠腹部明顯膨大后采腹水，將采集的腹水1000Orpm離心5min，取上清，于_20°C保存。用protein G親和柱純化抗體并測(cè)定濃度和效價(jià)，分裝，_70°C凍存。
[0023]3.抗牛Y干擾素單克隆抗體6E5的酶標(biāo)記
用Thermo公司的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記試劑盒對(duì)純化好并能與天然牛Y干擾素反應(yīng)的單抗6E5進(jìn)行標(biāo)記。具體的步驟如下:將Img的IgG溶于體積為0.5-lml的PBS中；再將Img 的 lyophilized EZ-Link Plus Activated Peroxidase 溶解在 100mL 的去離子水中，然后將IgG加到其中；即刻加入10μ1的Sodium Cyanoborohydride于反應(yīng)體系中，讓其室溫反應(yīng)I小時(shí)；然后加入20μ1 quenching Buffer,讓其室溫反應(yīng)15分鐘；將標(biāo)記好的樣品用GE公司的Protein G柱純化。
[0024]4.酶標(biāo)板包被抗牛Y干擾素單克隆抗體3E1
(1)將抗牛Y干擾素單克隆抗體3E1用碳酸鹽緩沖液稀釋至0.35Pg/mL，取100μL7孔的量加入ELISA板中，4°C包被約12h，再37°C水浴包被30~60 min ；
(2)棄包被液，IXPBST洗滌I次，加入5%的脫脂乳，37°C水浴，封閉2h；
(3 )棄去封閉液，用I X PBST洗滌3次，待檢測(cè)用。
[0025]5.天然牛Y干擾素的誘導(dǎo)產(chǎn)生 牛全血培養(yǎng)
①米血
無(wú)菌采集至少5mL牛血液，抗凝，輕輕顛倒幾次充分混合。采血后30個(gè)小時(shí)內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。注:抗凝血不能貯存于冰箱中。[0026]②血液培養(yǎng)
血液培養(yǎng)前輕輕顛倒，充分混勻。由于本試驗(yàn)需要活的淋巴細(xì)胞，因此需要將細(xì)胞損傷降至最低。將抗凝血加入24孔培養(yǎng)板，每頭動(dòng)物加兩孔，每孔1.5mL (見(jiàn)下表)。用一次性自動(dòng)移液器或吸管在無(wú)菌條件下進(jìn)行操作。
[0027]吸取血液或刺激原至24孔培養(yǎng)板的推薦操作
【權(quán)利要求】
1.抗牛Y干擾素雙抗體夾心ELISA試劑盒，其特征在于包括: 1)包被抗牛Y干擾素單克隆抗體3E1的酶標(biāo)板； 2)酶標(biāo)記抗牛Y干擾素單克隆抗體6E5; 其中，包被在酶標(biāo)板的抗牛Y干擾素單克隆抗體3E1與酶標(biāo)記抗牛Y干擾素單克隆抗體6E5分別針對(duì)牛Y干擾素不同的抗原表位。
2.如權(quán)利要求1所述試劑盒的制備方法，其特征在于:從雜交瘤細(xì)胞株BovinIFNgamma_3El分泌獲得抗牛\干擾素單克隆抗體3E1,從雜交瘤細(xì)胞株Bovin IFN gamma_6E5分泌獲得抗牛Y干擾素單克隆抗體6E5，將抗牛Y干擾素單克隆抗體3E1包被在酶標(biāo)板上，在抗牛Y干擾素單克隆抗體6E5上進(jìn)行酶標(biāo)記。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK103869084SQ201410132953
【公開(kāi)日】2014年6月18日 申請(qǐng)日期:2014年4月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月3日
【發(fā)明者】秦愛(ài)建, 黃健, 邵紅霞, 錢錕, 黃大盧 申請(qǐng)人:揚(yáng)州大學(xué)