久久一区二区免费播放,国产在线欧美日韩一区二区,国产综合色在线视频,精品伊人久久久香线蕉,精品视频麻豆网站,玖玖国产,国内精品久久久久影,在线观看精品视频一区二区三区,午夜久久影院,国产精品一区久久

一種j亞群禽白血病免疫膠體金抗體檢測(cè)試紙條的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種J亞群禽白血病免疫膠體金抗體檢測(cè)試紙條，其中最主要的是采用了原核表達(dá)后純化的J亞群禽白血病病毒表面蛋白偶聯(lián)免疫膠體金，利用該膠體金可以快速檢測(cè)血清中的J亞群禽白血病抗體，進(jìn)而為雞群J亞群禽白血病精準(zhǔn)快速診斷提供技術(shù)保障。通過(guò)Western?Blot檢測(cè)表達(dá)的gp85蛋白能夠與JE9單抗和抗HIS標(biāo)簽抗體發(fā)生特異性反應(yīng)，表明具有良好的特異性。
【專利說(shuō)明】一種J亞群禽白血病免疫膠體金抗體檢測(cè)試紙條
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及預(yù)防獸醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域，具體涉及了一種J亞群禽白血病免疫膠體金抗體檢測(cè)試紙條。
【背景技術(shù)】
[0002]J亞群禽白血病是由J亞群禽白血病病毒(ALV-J)引起的一種腫瘤性疾病，臨床上主要以髓細(xì)胞性白血病多見(jiàn)，研究發(fā)現(xiàn)J亞群禽白血病毒還能誘發(fā)淋巴細(xì)胞性白血病、成髓細(xì)胞性白血病、成紅細(xì)胞性白血病等多種腫瘤性疾病。J亞群禽白血病已經(jīng)從最初的感染肉雞到現(xiàn)在的感染蛋雞、火雞及地方雞品種。近幾年，禽白血病的流行呈現(xiàn)高感染率、高發(fā)病率，早期感染普遍、發(fā)病日齡明顯提前，混合感染促使病毒重組頻率增高，宿主范圍擴(kuò)展、腫瘤趨于多樣化等新特點(diǎn)。目前，與J亞群白血病密切相關(guān)的血管瘤病在蛋種雞群及商品蛋雞群中的爆發(fā)，給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的損失?；谄洳《咎匦?，一直未有行之有效的疫苗、藥物防治此病。國(guó)外通過(guò)凈化控制本病的發(fā)生。由于凈化周期長(zhǎng)、成本高，在我國(guó)目前還未能有效實(shí)施，只能通過(guò)淘汰感染雞只進(jìn)行大群凈化，快速精準(zhǔn)檢測(cè)J亞群禽白血病的感染對(duì)于凈化控制J亞群禽白血病具有極其重要的意義。
[0003](I) ALV-J表面蛋白(SU)的生物學(xué)功能
[0004]ALV-J屬于反轉(zhuǎn)錄病毒。病毒囊膜蛋白可分為由gp85基因編碼的表面蛋白(surface protein, SU)和 gp37 基因編碼的跨膜蛋白(transm-embrane protein, TM), 二者在一起形成二聚體，病毒囊膜蛋白決定亞群的特異性。SU含有病毒一受體決定簇，負(fù)責(zé)識(shí)別靶細(xì)胞膜上的特異性受體，TM負(fù)責(zé)介導(dǎo)病毒與細(xì)胞的融合過(guò)程。SU刺激機(jī)體產(chǎn)生的中和抗體具有亞群特異性。ALV-J表面蛋白的核酸序列與其它ALV亞群同源性只有40%。ALV-J囊膜蛋白的SU可特異性識(shí)別J亞群禽白血病毒刺激機(jī)體產(chǎn)生的中和抗體，對(duì)于J亞群禽白血病的診斷具有重要意義。
[0005](2) J亞群禽白血病診斷方法研究現(xiàn)狀
[0006]對(duì)于J亞群禽白血病的診斷方法國(guó)內(nèi)外都有過(guò)許多報(bào)道，主要為病毒分離與鑒定、免疫學(xué)檢測(cè)方法、核酸分子檢測(cè)方法。病毒的分離與鑒定耗費(fèi)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)且只適用于實(shí)驗(yàn)室診斷；免疫學(xué)檢測(cè)方法如間接免疫熒光、ELISA方法等都需要一定的專業(yè)知識(shí)和設(shè)備，不適用于養(yǎng)殖場(chǎng)的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)；核酸分子檢測(cè)方法如PCR等容易受到假陽(yáng)性、假陰性及抗原變異的干擾，且上述檢測(cè)方法均建立在實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)上并需要專業(yè)操作人員操作。因此研制快速精準(zhǔn)并易于操作攜帶的J亞群禽白血病免疫膠體金抗體檢測(cè)試紙條，對(duì)于我國(guó)雞群J亞型禽白血病的凈化防制具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]針對(duì)現(xiàn)有存在的上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種J亞群禽白血病免疫膠體金抗體檢測(cè)試紙條，其中最主要的是采用了原核表達(dá)后純化的J亞群禽白血病病毒表面蛋白偶聯(lián)免疫膠體金，利用該膠體金可以快速檢測(cè)血清中的J亞群禽白血病抗體，進(jìn)而為雞群J亞群禽白血病精準(zhǔn)快速診斷提供技術(shù)保障。通過(guò)Western Blot檢測(cè)表達(dá)的gp85蛋白能夠與JE9單抗和抗HIS標(biāo)簽抗體發(fā)生特異性反應(yīng)，表明具有良好的特異性。
[0008]本發(fā)明所采用的具體技術(shù)方案是:
[0009]通過(guò)比對(duì)臨床病例，特別是混合腫瘤、單純髓細(xì)胞瘤、血管瘤、纖維肉瘤、組織肉瘤、成紅細(xì)胞瘤、腎瘤等病例，通過(guò)抗體及PCR檢測(cè)確定ALV-J感染，DF-1細(xì)胞培養(yǎng)并分離病毒，比對(duì)分析各病毒表面蛋白的關(guān)鍵保守基因序列，最終確定采用ALV-J gp85基因片段，并根據(jù)上述表面蛋白的關(guān)鍵保守基因序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增保守序列，最終原核表達(dá)的SU蛋白制備試紙條，所獲得的試紙條可以完全實(shí)現(xiàn)J亞群禽白血病的精準(zhǔn)診斷。
[0010]其具體過(guò)程如下:
[0011]根據(jù)現(xiàn)有的ALV-J設(shè)計(jì)特異性引物，所述的正向引物為5’-GCGGATCCATCAAGAACGGAACAACACG-3’，含BamH I酶切位點(diǎn)，其基因序列如SEQ ID N0.2所示；反向引物為5’-GCGCGCAAGCTTGTCCCCACAAATCAAGAAAATA-3’，含 Hind III 酶切位點(diǎn)，其基因序列如 SEQ ID N0.3所示。
[0012]利用上述一對(duì)引物以J亞群禽白血病病毒的DNA為模版進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中優(yōu)選采用 NX0101 (ALV-J, DQl 15805.1)的 DNA 為模板；
[0013]PCR反應(yīng)條件為:95°C 5min，充分變性后進(jìn)入循環(huán)體系:95°C 40s，65°C lmin,72°C lmin，循環(huán) 35 次后 72°C延伸 IOmin0
[0014]擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序，其基因序列如SEQ ID N0.1所示；
[0015]利用該基因片段連接pET30a載體，得到了重組載體pET30a — gp85重組質(zhì)粒，使用ImmoL IPTG誘導(dǎo)表達(dá)得到帶有HIS標(biāo)簽的融合蛋白His-gp85，進(jìn)而利用該蛋白與膠體金偶聯(lián)后涂布于硝酸纖維素膜上，制成試紙條采用間接法測(cè)抗體。
[0016]本發(fā)明的這種試紙條適用于大規(guī)模批量生產(chǎn)，易于操作攜帶，可快速診斷J亞群禽白血病，檢測(cè)時(shí)間只需5分鐘，一個(gè)中等養(yǎng)殖規(guī)模的雞場(chǎng)，從制備血清到檢測(cè)，只需在二十分鐘內(nèi)即可快速確定其雞群J亞群禽白血病的感染狀態(tài)，對(duì)于我國(guó)J亞群禽白血病及時(shí)發(fā)現(xiàn)和適時(shí)凈化具有重要意義，且特異性強(qiáng)可以完全實(shí)現(xiàn)J亞群禽白血病的精準(zhǔn)診斷。
[0017]與現(xiàn)有技術(shù)相比，如“ J亞群禽白血病抗體快速檢測(cè)試紙卡及其應(yīng)用”，其所用鼠抗雞IgGFc片段單克隆抗體較多抗具有良好的特異性，但只能針對(duì)某一特定的抗原決定簇，用途單一；
[0018]而我們所用的多克隆抗體所使用的是SU蛋白，含有多個(gè)抗原位點(diǎn)，能夠與不同的抗原決定簇進(jìn)行結(jié)合，因而更加準(zhǔn)確的檢測(cè)到血清中的抗體從而確定雞群的感染狀況，較之現(xiàn)有的檢測(cè)試紙能夠更加有效準(zhǔn)確的檢測(cè)出雞群感染狀況
[0019]本發(fā)明所獲得的試紙條具體結(jié)構(gòu)如下:
[0020]一種J亞群禽白血病免疫膠體金抗體檢測(cè)試紙條，包括支撐層和吸附層，吸附層固定在支撐層上，吸附層從測(cè)試端依次為樣品吸附纖維層、金標(biāo)SU蛋白纖維層、纖維素膜層及吸水材料層。在所述的纖維素膜層中部有一條包被J亞群禽白血病SU蛋白的檢測(cè)線和一條包被SU蛋白兔多克隆抗體的質(zhì)控線，所述的纖維素膜層一端嵌入金標(biāo)SU蛋白纖維層，另一端嵌入吸水材料層中。
[0021]其中，所述的支撐層用不吸水的硬質(zhì)塑料條制成；
[0022]所述的測(cè)試端的樣品吸附纖維層用玻璃纖維制成；[0023]所述的金標(biāo)SU蛋白纖維層吸附有膠體金標(biāo)記的高純度的SU蛋白；
[0024]所述的纖維素膜層用硝酸纖維素膜制成；
[0025]所述的吸水材料層用吸水紙制成；
[0026]所述的SU蛋白兔多克隆抗體為采用常規(guī)技術(shù)，利用多克隆抗體制備技術(shù)將SU蛋白免疫新西蘭大白兔獲得，為現(xiàn)有技術(shù)，在此不再贅述。
[0027]上述的各種材料均為市購(gòu)。
[0028]本發(fā)明所述膠體金試紙條的制備方法如下:具體步驟:
[0029]I)在纖維素膜層的不同位置上分別包被SU蛋白和SU蛋白的多克隆抗體，分別形成檢測(cè)線和質(zhì)控線；具體步驟為:將包被濃度為2mg/ml的SU蛋白溶液按2ul/cm的速度噴于檢測(cè)層上作為檢測(cè)線，將包被濃度為2mg/ml的SU蛋白多克隆抗體按2ul/cm的速度噴于檢測(cè)線下方的檢測(cè)層上作為質(zhì)控線，37°C下干燥30min，從而制備得到檢測(cè)線和質(zhì)控線；
[0030]其中所述的2mg/ml的SU蛋白溶液用pH為7.5,0.02M的PBS緩沖液稀釋獲得的；
[0031]2)金標(biāo)抗體纖維層的制備，具體步驟為:以檸檬酸鈉還原法制備金溶液，即在IOOml沸騰的0.02wt%氯金酸水溶液中加入Iml的lwt%檸檬酸三鈉溶液，可獲得直徑在45nm左右的膠體金；
[0032]通過(guò)直接混合的方式以0.2mo 1/L的K2C03溶液調(diào)節(jié)上述獲得的膠體金pH至7.0-8.5，以1:1000的標(biāo)記比例將待標(biāo)記的SU蛋白加入到上述調(diào)整pH之后的膠體金中，標(biāo)記20min后，再向上述標(biāo)記后的膠體金溶液中加入10wt%的PEG10000水溶液；至PEG10000的終濃度為0.lwt%, 4°C >3000rpm離心30min,除去未結(jié)合的膠體金顆粒,4°C、13000rpm離心30min,棄上清液,獲得初步純化的金標(biāo)抗體；
[0033]其中所采用的10wt%的PEG10000水溶液是利用市售的PEG10000，用雙蒸水把它稀釋成10wt%的水溶液獲得的；之后利用上述獲得的10wt%的PEG10000溶液加入到標(biāo)記后的膠體金溶液中，利用膠體金溶液對(duì)其進(jìn)行稀釋，使PEG10000的最終濃度變成0.lwt%即可；
[0034]按2mg/ml為1:100的的比例用含0.l_2wt%BSA的0.001-0.2mol/L磷酸鹽緩沖液稀釋膠體金標(biāo)記的SU蛋白，將上述稀釋后的金標(biāo)抗體液按50ul/cm2的速度噴于玻璃纖維素膜中，4°C低溫真空干燥；
[0035]3)采用現(xiàn)有工藝和設(shè)備組裝支撐層、纖維素膜層、金標(biāo)SU蛋白纖維層、吸水材料層和樣品吸附纖維層既得目標(biāo)試紙條。
[0036]綜上所述，采用本發(fā)明的這種J亞群禽白血病免疫膠體金抗體檢測(cè)試紙條,其中最主要的是采用了原核表達(dá)后純化的J亞群禽白血病病毒表面蛋白偶聯(lián)免疫膠體金，利用該膠體金可以快速檢測(cè)血清中的J亞群禽白血病抗體，進(jìn)而為雞群J亞群禽白血病精準(zhǔn)快速診斷提供技術(shù)保障。通過(guò)Western Blot檢測(cè)表達(dá)的gp85蛋白能夠與JE9單抗和抗HIS標(biāo)簽抗體發(fā)生特異性反應(yīng)，表明具有良好的特異性，具有廣泛的推廣和應(yīng)用價(jià)值。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0037]圖1為PCR擴(kuò)增ALV-J gp85基因片段電泳圖，
[0038]途中M 為 DL2500marker; I 為 ALV-J gp85 基因片段；
[0039]圖2為pET30a_gp85重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果電泳圖；
[0040]圖中M 為 DL5000marker ；1 為使用 BamH I 和 Hind III 酶切 pET30a_gp85 后獲得的片段；
[0041]圖3為pET30a_gp85重組質(zhì)粒在BL21中誘導(dǎo)表達(dá)電泳圖譜；
[0042]圖中 M 為 170KD protein marker ； I 為加入 IPTGOh 后;2 為加入 IPTGlh 后；3 為加入IPTG2h后；4為加入IPTG3h后；
[0043]圖4為SU蛋白純化后的SDS-PAGE分析結(jié)果圖，
[0044]圖中M為170KD protein marker; I為SU蛋白純化產(chǎn)物；
[0045]圖5Western blot 法檢測(cè) SU 蛋白，
[0046]圖中M為170KD protein marker; I為雜蛋白;2為目的蛋白；
[0047]圖6ALV-J抗體檢測(cè)試紙條檢測(cè)結(jié)果示意圖，
[0048]上方為陰性血清樣品檢測(cè)結(jié)果呈陰性，下方為陽(yáng)性血清樣品檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性?！揪唧w實(shí)施方式】
[0049]本實(shí)施例中所采用的具體試劑和儀器為:
[0050](I)主要試劑
[0051]HRP酶標(biāo)二抗為博奧森生物有限公司產(chǎn)品；
[0052]TMB單組份底物顯色溶液，DAB顯色試劑盒為天根公司產(chǎn)品；
[0053]Taq聚合酶，限制性內(nèi)切酶Hind II1、BamH 1、T4連接酶、dNTP、DNA Marker為大連寶生物有限公司產(chǎn)品；
[0054]PCR產(chǎn)物純化試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒為OMEGA公司產(chǎn)品；
[0055]蛋白預(yù)染Marker為北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；
[0056]胰蛋白胨(Tryptone)及酵母抽提物(Yeast Extract)為Oxiod公司產(chǎn)品；
[0057]其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?br> [0058](2)主要儀器
[0059]PCR儀、分光光度計(jì)為Eppendorf公司產(chǎn)品；
[0060]低溫高速離心機(jī)為湖北湘儀公司產(chǎn)品；
[0061]凝膠成像系統(tǒng)為北京君意公司產(chǎn)品；
[0062]酶標(biāo)儀為T(mén)hermo公司產(chǎn)品；
[0063]恒溫?fù)u床為上海申能博彩公司產(chǎn)品；
[0064]恒溫培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)為上海博迅公司產(chǎn)品；
[0065]電泳儀、SDS-PAGE電泳槽、Western-blot膜轉(zhuǎn)印裝置為北京六一公司產(chǎn)品；
[0066]細(xì)胞超聲波粉碎機(jī)為寧波新芝生物有限公司產(chǎn)品。
[0067]除上述列出內(nèi)容外，本發(fā)明為提及的部分均采用現(xiàn)有技術(shù)。
[0068]實(shí)施例1ALV-J gp85基因的克隆及測(cè)序
[0069]根據(jù)現(xiàn)有ALV-J前病毒基因組DNA gp85囊膜蛋白基因設(shè)計(jì)引物，正向引物為5’-GCGGATCCATCAAGAACGGAACAACACG-3，,含BamH I酶切位點(diǎn)(下劃線部分)其基因序列如SEQID N0.2 所示；反向引物為 5，-GCGCGCAAGCTTGTCCCCACAAATCAAGAAAATA-3，.含 Hind III 酶切位點(diǎn)(下劃線部分)，其基因序列如SEQ ID N0.3所示。
[0070]利用上述一對(duì)引物以J亞群禽白血病病毒的DNA為模版進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中所選擇的J亞群禽白血病病毒為NX0101 (ALV-J, DQl 15805.1)；[0071]PCR反應(yīng)條件為:95°C 5min，充分變性后進(jìn)入循環(huán)體系:95°C 40s，65°C lmin,72°C lmin，循環(huán) 35 次后 72°C延伸 IOmin0
[0072]將PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中電泳，結(jié)果見(jiàn)圖1，獲得了 504bp的片段。
[0073]擴(kuò)增的片段采用常規(guī)方法連接于PTZ57R/T克隆載體進(jìn)行基因測(cè)序，將對(duì)應(yīng)的氨基酸序列與近三年我國(guó)分離得到的16株不同腫瘤型ALV-J氨基酸保守序列進(jìn)行分析比對(duì):與其中9株的同源性高于98%，最低同源性也可達(dá)87%，確保所制備的gp85蛋白可與我國(guó)ALV-J流行毒株感染雞只產(chǎn)生抗原抗體反應(yīng)。
[0074]將pET30a和連接了目的基因的PTZ57R/T克隆載體分別用限制性內(nèi)切酶BamH I和Hind III進(jìn)行雙酶切l(wèi)Omin，按照膠回收試劑盒說(shuō)明書(shū)的要求分別回收大片段和目的基因片段；
[0075]將上述獲得的目標(biāo)物22°C過(guò)夜連接，其中連接體系為:pET30a載體0.5μ 1，gp85基因片段 1μ 1，(1Η2020μ 1，T4DNA連接酶 1μ l，10x buffer2.5 μ 1，總體積共 25 μ 1，獲得連接產(chǎn)物pET30a — gp85重組質(zhì)粒。
[0076]將連接產(chǎn)物pET30a — gp85重組質(zhì)粒按照常規(guī)方法轉(zhuǎn)入CaC12制備的感受態(tài)細(xì)菌BL21中，涂布于含有卡那霉素的LB平板中，370C過(guò)夜生長(zhǎng)，次日挑取單菌落，搖菌，提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定后送去測(cè)序，確認(rèn)其中具有如SEQ ID N0.3所示的序列，可見(jiàn)獲得的gp85保守基因504bp的片段已經(jīng)成功克隆入pET30a — gp85重組質(zhì)粒中。
[0077]實(shí)施例2gp85蛋白的表達(dá)和純化
[0078]將測(cè)序后含有重組質(zhì)粒的陽(yáng)性BL21菌接種于含Kan (終濃度為10 μ g/ml)的LB液體培養(yǎng)基中(市購(gòu)常規(guī)培養(yǎng)基，其中含有l(wèi)%(w/v) Tryptone, 0.5% (w/v) Yeast Extract,l%(w/v)NaCl,0.lmg/ml Kanamycin), 37°C振蕩(200rpm),培養(yǎng)至 0D600=1.0,加入濃度為500mMol的IPTG至整個(gè)培養(yǎng)基中IPTG的終濃度為lmmol/L，37°C繼續(xù)培養(yǎng)3h，同時(shí)設(shè)未誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21菌作為對(duì)照。
[0079]經(jīng)SDS-PAGE分析顯示，檢測(cè)步驟如下:收集培養(yǎng)的工程菌菌液，5000rpm，離心5min,棄上清,沉淀按照IOOml初始培養(yǎng)基加入標(biāo)準(zhǔn)PBS3ml的比例，向沉淀中加入標(biāo)準(zhǔn)的PBS獲得重懸液，沉淀重懸后分裝與5ml離心管中每管3ml。將離心管置于冰水混合物的燒杯內(nèi)，用超聲破菌儀超聲破菌，120W，工作ls，間歇2s，超聲2個(gè)循環(huán)；將超聲破菌液轉(zhuǎn)入50ml離心管中，配平,放入高速冷卻離心機(jī)中，8000rpm,4°C,離心IOmin,然后用SDS-PAGE電泳檢測(cè)；結(jié)果上清中無(wú)蛋白(未顯示)，蛋白存在于沉淀中，說(shuō)明目的蛋白gp85以包涵體形式表達(dá)，如圖3所示，目的SU蛋白大小約為18KD ；
[0080]SU蛋白的純化步驟如下:
[0081]將上述離心獲得的沉淀用9倍體積的洗滌液I重懸沉淀，靜置5min后，8000rpm，5min棄上清。用9倍體積的洗漆液II重懸沉淀，靜置5min后,8000rpm, 5min,棄上清,保留沉淀。用9倍體積的洗漆液III重懸沉淀，靜置5min后,8000rpm, 5min,棄上清,保留沉淀。按IOOml菌液加8ml溶解液，4°C過(guò)夜。8000rpm，離心5min。取上清，即為純化蛋白。
[0082]包涵體純化所述試劑配制方法:
[0083](I)細(xì)菌重懸液(250ml): PBS (NaCl2g, KC10.05g, Na2HPO40.36g KH2PO40.06g)，lmm/L EDTA.[0084](3)溶液 I (250ml):500mmol/L Tris-Cl (pH=6.0), 50mmo I /T, NaCl, 50mmo I /T,EDTA
[0085](3)溶液 II (250ml):溶液 I，IM 尿素
[0086](4)溶液 III (250ml):溶液 I，2M 尿素
[0087](5)包涵體溶解液(250ml):溶液I，4M尿素
[0088]SDS-PAGE法與Western Blot法檢測(cè)純化后的蛋白(附圖4和5)。得到的蛋白經(jīng)過(guò)Bradford法測(cè)定蛋白含量,稀釋到0.5mg/mL來(lái)分裝_8(TC保存?zhèn)溆谩?br> [0089]上述使用的SDS-PAGE法為常規(guī)方法，未提及的試劑為常規(guī)方法規(guī)定使用的試劑，其具體操作步驟如下:
[0090]I)將玻璃板洗干凈，用夾子固定，垂直放置，配置12%分尚膠,快速注入到兩玻璃板之間，膠上部加蒸餾水封口，以保持膠面平整。待分離膠凝固后，倒去分離膠表面的蒸餾水，用濾紙吸去殘留水。注入濃縮膠，快速插入梳子，并注意防止氣泡的產(chǎn)生；
[0091]2)取純化后的SU蛋白加入15-20 μ 14x SDS上樣buffer，煮沸IOmin ；
[0092]3)往電泳槽加入I XTris-甘氨酸緩沖液，待濃縮膠凝固，小心拔掉梳子，用緩沖液沖洗加樣孔，用微量進(jìn)樣器上樣，10μ I/孔，正確連接電泳槽正負(fù)極，打開(kāi)電源。120V電壓電泳，電泳至溴酚藍(lán)到達(dá)膠的底部時(shí)停止電泳；
[0093]4)染色:取下凝膠，用蒸餾水沖洗，放入考馬斯亮藍(lán)染色液中，染色4h以上；
[0094]5)脫色:將凝膠放入脫色液中，置于搖床上脫色，期間更換3次以上脫色液，待凝膠藍(lán)色背景全部脫去停止，將凝膠放入蒸餾水中終止脫色；拍照保存，如圖4所示，出現(xiàn)了大小約為18KD的目的SU蛋白條帶；
[0095]6)剪一張與Western Blot凝膠大小相同的NC膜，用去離子水浸透，同時(shí)將與凝膠大小相同的兩張濾紙及纖維墊用轉(zhuǎn)印緩沖液浸透；
[0096]7)按三明治法安裝轉(zhuǎn)印裝置，即負(fù)極夾-纖維墊-濾紙-凝膠-NC膜-濾紙-纖維墊-正極夾，使NC膜位于轉(zhuǎn)印的正極面，凝膠位于負(fù)極面，其間無(wú)任何氣泡間隙。將轉(zhuǎn)印裝置放入轉(zhuǎn)移電泳儀中，加入轉(zhuǎn)移緩沖液，140mA電泳2h。
[0097]8)轉(zhuǎn)印結(jié)束后，將轉(zhuǎn)移后的NC膜用去離子水漂洗一遍，將NC膜浸泡于封閉液中，4°C封閉過(guò)夜；
[0098]9)用PBST洗滌NC膜三遍，每次IOmin ；
[0099]10)使用免疫小鼠陽(yáng)性血清為一抗，NC膜與一抗37°C反應(yīng)lh，用PBST洗膜三次，IOmin/ 次；
[0100]11 )NC膜置于過(guò)HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG中，37°C反應(yīng)lh，用PBST洗膜三次，IOmin/次；
[0101]12)使用DAB顯色試劑盒避光顯色；此時(shí)應(yīng)密切觀察顯色過(guò)程，并在較淺本底且達(dá)到適當(dāng)顯色強(qiáng)度時(shí)流水終止顯色；拍照保存，如圖5所示，出現(xiàn)了大小約為18KD的目的SU蛋白條帶。
[0102]實(shí)施例3gp85蛋白的活性檢測(cè)
[0103]使用上述純化得到的Hi s-gp85蛋白包被ELISA板，使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)該蛋白的生物學(xué)活性。以IDEXX公司生產(chǎn)的ALV-J抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)為陽(yáng)性的雞血清為陽(yáng)性對(duì)照，健康SPF雞血清為陰性對(duì)照，HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG酶標(biāo)二抗按說(shuō)明書(shū)使用。結(jié)果顯示陽(yáng)性對(duì)照與陰性對(duì)照的OD值比值大于2.1，說(shuō)明該蛋白有良好的生物學(xué)活性和抗原性。[0104]ELISA具體步驟如下:
[0105]I)包被:取純化的重組SU蛋白，以生理鹽水稀釋至最佳濃度，包被反應(yīng)板，100 μ I/孔，4°C過(guò)夜；
[0106]2)洗滌:甩去酶標(biāo)板中的包被液，用PBST (PBS，0.05%Tween-20)加滿各孔，搖床震蕩3min,棄去PBST，洗滌3次，3min/次，拍干；
[0107]3)封閉:各孔加入封閉液(3%脫脂乳)，350 μ I/孔，置37°C培養(yǎng)箱孵育0.5h，洗滌3次，3min/次,拍干；
[0108]4)加樣:將待待檢血清按梯度稀釋后加入包被板，100 μ I/孔，同時(shí)設(shè)立陰陽(yáng)性血清對(duì)照；置37°C培養(yǎng)箱孵育lh，洗滌3次，3min/次，拍干；
[0109]5)用封閉液將HRP羊抗鼠IgG酶標(biāo)二抗按1:5000稀釋，100 μ I/孔，置37°C培養(yǎng)箱孵育lh，洗滌3次，3min/次，拍干；
[0110]6)顯色:使用TMB單組份顯色試劑盒(TIANGEN公司產(chǎn)品)按100 μ I/孔加入包被板，室溫下避光顯色20min加終止液，2M H2S04終止顯色；
[0111]7)用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)其在波長(zhǎng)450nm檢測(cè)各個(gè)孔的OD值，陰性對(duì)照0D450值為N，陽(yáng)性對(duì)照0D450值為P。若P/N>2.1判為陽(yáng)性。
[0112]實(shí)施例4J亞群禽白血病免疫膠體金抗體檢測(cè)試紙條的制備
[0113]I)在纖維素膜層的不同位置上分別包被SU蛋白和SU蛋白的多克隆抗體，分別形成檢測(cè)線和質(zhì)控線；具體步驟為:將包被濃度為2mg/ml的SU蛋白溶液按2ul/cm的速度噴于檢測(cè)層上作為檢測(cè)線，將包被濃度為2mg/ml的SU蛋白多克隆抗體按2ul/cm的速度噴于檢測(cè)線下方的檢測(cè)層上作為質(zhì)控線，37°C下干燥30min，從而制備得到檢測(cè)線和質(zhì)控線；
[0114]其中所述的2mg/ml的SU蛋白溶液用pH為7.5,0.02M的PBS緩沖液稀釋獲得的；
[0115]2)金標(biāo)抗體纖維層的制備，具體步驟為:以檸檬酸鈉還原法制備金溶液，即在IOOml沸騰的0.02wt%氯金酸水溶液中加入Iml的lwt%檸檬酸三鈉溶液，可獲得直徑在45nm左右的膠體金；
[0116]通過(guò)直接混合的方式以0.2moI/L的K2C03溶液調(diào)節(jié)上述獲得的膠體金pH至
7.0-8.5，以1:1000的標(biāo)記比例將待標(biāo)記的SU蛋白加入到上述調(diào)整pH之后的膠體金中，標(biāo)記20min后，再向上述標(biāo)記后的膠體金溶液中加入10wt%的PEG10000水溶液；至PEG10000的終濃度為0.lwt%, 4°C >3000rpm離心30min,除去未結(jié)合的膠體金顆粒,4°C、13000rpm離心30min,棄上清液,獲得初步純化的金標(biāo)抗體；
[0117]其中所采用的10wt%的PEG10000水溶液是利用市售的PEG10000，用雙蒸水把它稀釋成10wt%的水溶液獲得的；之后利用上述獲得的10wt%的PEG10000溶液加入到標(biāo)記后的膠體金溶液中，利用膠體金溶液對(duì)其進(jìn)行稀釋，使PEG10000的最終濃度變成0.lwt%即可；
[0118]按2mg/ml為1:100的的比例用含0.l_2wt%BSA的0.001-0.2mol/L磷酸鹽緩沖液稀釋膠體金標(biāo)記的SU蛋白，將上述稀釋后的金標(biāo)抗體液按50ul/cm2的速度噴于玻璃纖維素膜中，4°C低溫真空干燥；
[0119]3)采用現(xiàn)有工藝和設(shè)備組裝支撐層、纖維素膜層、金標(biāo)SU蛋白纖維層、吸水材料層和樣品吸附纖維層既得目標(biāo)試紙條。
[0120]試驗(yàn)例I
[0121]2013年10月山東省濰坊市某養(yǎng)雞場(chǎng)發(fā)生以病雞主要表現(xiàn)為困倦、虛弱、雞冠肉髯蒼白、并有消瘦脫水等癥狀的傳染病，經(jīng)山東農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)室顯微鏡圖片和PCR方法檢查診斷為J亞群禽白血病感染；
[0122]發(fā)明人采集雞場(chǎng)病雞的血清，利用本發(fā)明實(shí)施例4制備的試紙條逐條進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，與經(jīng)山東農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)室顯微鏡圖片和PCR方法檢查診斷完全一致，證明本發(fā)明所提供的試紙條不需要任何的設(shè)備，就可以進(jìn)行臨床樣本的檢測(cè)，且特異性強(qiáng)，操作簡(jiǎn)便、快速，結(jié)果顯示直觀、準(zhǔn)確，能廣泛應(yīng)用于基層對(duì)于J亞群禽白血病的檢測(cè)。
[0123]試驗(yàn)例2
[0124]2013年11月新泰市某養(yǎng)雞場(chǎng)發(fā)生以病雞雞冠肉髯蒼白、消瘦、脫水、腹部膨大、可觸摸到腫大的肝臟為主要特征的疾病，經(jīng)山東農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)室PCR檢測(cè)為J亞群禽白血病。
[0125]發(fā)明人采集活雞的血清樣本，利用本發(fā)明實(shí)施例4制備的試紙條逐條進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，與經(jīng)山東農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)室PCR方法檢查診斷完全一致，證明本發(fā)明所提供的試紙條不需要任何的設(shè)備，就可以進(jìn)行臨床樣本的檢測(cè)，且特異性強(qiáng)，操作簡(jiǎn)便、快速，結(jié)果顯示直觀、準(zhǔn)確，能廣泛應(yīng)用于基層對(duì)于J亞群禽白血病的檢測(cè)。
【權(quán)利要求】
1.一種J亞群禽白血病免疫膠體金抗體檢測(cè)試紙條，其特征在于:采用了原核表達(dá)后純化的J亞群禽白血病病毒表面蛋白偶聯(lián)免疫膠體金，其中所述的原核表達(dá)后純化的J亞群禽白血病病毒表面蛋白為帶有HIS標(biāo)簽的融合蛋白His-gp85，所述試紙條的制備方法如下: 根據(jù)現(xiàn)有的ALV-J設(shè)計(jì)特異性引物，所述的正向引物為5’-GCGGATCCATCAAGAACGGAACAACACG-3，，含BamH I酶切位點(diǎn)，其基因序列如SEQ ID N0.2所示；反向引物為5，-GCGCGCAAGCTTGTCCCCACAAATCAAGAAAATA-3’，含 Hind III 酶切位點(diǎn)，其基因序列如 SEQ ID N0.3 所示； 利用上述一對(duì)引物以J亞群禽白血病病毒的DNA為模版進(jìn)行PCR擴(kuò)增: PCR反應(yīng)條件為:95 V 5min,充分變性后進(jìn)入循環(huán)體系:95 V 40s, 65 V lmin,72°C lmin，循環(huán) 35 次后 72°C延伸 IOmin ； 擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序，其基因序列如SEQ ID N0.1所示； 利用該基因片段連接pET30a載體，得到了重組載體pET30a — gp85重組質(zhì)粒，使用ImmoL IPTG誘導(dǎo)表達(dá)得到帶有HIS標(biāo)簽的融合蛋白His-gp85，進(jìn)而利用該蛋白與膠體金偶聯(lián)后涂布于硝酸纖維素膜上，制成試紙條。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試紙條，其特征在于:以NXOlOl的DNA為模版進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
3.—種J亞群禽白血病免疫膠體金抗體檢測(cè)試紙條的制備方法，其特征在于:具體步驟如下: 根據(jù)現(xiàn)有的ALV-J設(shè)計(jì)特異性引物，所述的正向引物為5’-GCGGATCCATCAAGAACGGAACAACACG-3’，含BamH I酶切位點(diǎn)，其基因序列如SEQ ID N0.2所示；反向引物為5’ -GCGCGCAAGCTTGTCCCCACAAATCAAGAAAATA-3’，含 Hind III 酶切位點(diǎn)，其基因序列如 SEQ ID N0.3 所示； 利用上述一對(duì)引物以J亞群禽白血病病毒的DNA為模版進(jìn)行PCR擴(kuò)增: PCR反應(yīng)條件為:95 V 5min,充分變性后進(jìn)入循環(huán)體系:95 V 40s, 65 V lmin,72°C lmin，循環(huán) 35 次后 72°C延伸 IOmin ； 擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序，其基因序列如SEQ ID N0.1所示； 利用該基因片段連接pET30a載體，得到了重組載體pET30a — gp85重組質(zhì)粒，使用ImmoL IPTG誘導(dǎo)表達(dá)得到帶有HIS標(biāo)簽的融合蛋白His-gp85，進(jìn)而利用該蛋白與膠體金偶聯(lián)后涂布于硝酸纖維素膜上，制成試紙條； 所述的擴(kuò)增模板DNA為NXOlOl的DNA。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK103808945SQ201410088234
【公開(kāi)日】2014年5月21日 申請(qǐng)日期:2014年3月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月12日
【發(fā)明者】成子強(qiáng), 王言明 申請(qǐng)人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)