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溪黃草藥材hplc指紋圖譜的建立及其指紋圖譜的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種溪黃草藥材指紋圖譜的建立及其指紋圖譜，涉及中藥藥材的質(zhì)量控制方法，具體是建立HPLC指紋圖譜以檢測溪黃草藥材提取液的方法。本發(fā)明步驟為，對照品溶液的制備；提取溶劑與方法的選擇；樣品溶液的制備；色譜條件考察：色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料，采用梯度洗脫，流動相為0.1%～0.3%乙腈-磷酸組成的梯度洗脫液，柱溫：25～40℃，紫外檢測波長為230～270nm，時間100～120min；不同品種溪黃草藥材HPLC指紋圖譜測定；特征峰的標記與參照峰的選擇。本發(fā)明的有益效果：解決溪黃草的入藥基源爭議。綜合運用了指紋圖譜的共有峰比較、聚類分析和特有峰分析等方法對三個品種溪黃草HPLC指紋圖譜進行鑒別，實現(xiàn)對溪黃草藥材的基源鑒別，劃分了產(chǎn)地歸類，為溪黃草藥材的質(zhì)量控制、臨床正確使用提供依據(jù)。
【專利說明】溪黃草藥材HPLC指紋圖譜的建立及其指紋圖譜
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及中藥藥材的質(zhì)量控制方法，具體涉及溪黃草藥材高效液相色譜法指紋圖譜的構(gòu)建方法和標準指紋圖譜。
【背景技術(shù)】
[0002]溪黃草原植物為唇形科香茶菜屬植物線紋香茶菜Isodon 1phanthoides(Buch.-Ham.ex D.Don)H.Hara.的干燥地上部分。主產(chǎn)于長江以南的湖南、湖北、四川、云南、江西、廣東、廣西、福建等省區(qū)。性味苦、甘、寒，歸肝、膽經(jīng)，具有清熱利濕、退黃、涼血散瘀的功效，用于治療濕熱黃疸、濕熱瀉痢、跌打瘀痛、急性黃疸型肝炎、急性膽囊炎、痢疾、腸炎等疾病。
[0003]溪黃草為華南地區(qū)民間習用草藥。溪黃草作為清肝利膽藥在廣東大部分地區(qū)民間有著很長的使用歷史。民間和歷代名醫(yī)把溪黃草用作清熱祛濕、利膽退黃藥，治療急性黃疸型肝炎、急性膽囊炎，為預防和治療肝膽疾病的常用藥。
[0004]現(xiàn)作商品“溪黃草”入藥的除線紋香茶菜外，還有同屬植物狹基線紋香茶菜R.1ophanthoides (Buch.-Ham ex D.Don) Hara var.gerardiana (Benth.) Hara、纖花香茶菜R.1ophanthoides (Buch.-Ham ex D.Don) Hara var.gracilifl ora (Benth.) Hara 和溪黃草R.serra(Maxim.)Hara0廣東部頒標準和國家藥典2010版(附錄)對溪黃草的基源收載以及學者間都存在爭議。中藥溪黃草來源復雜，同名異物、品種混亂普遍，且這類植物外形類似，開花前和干品都不易鑒別。為保證和提高藥材質(zhì)量，促進中藥標準化，在研究過程中應重視對所用藥材作基源鑒定；并應對多來源藥材在鑒定、化學、藥理和臨床進一步比較研究，以便在各種藥材之間找出功效、主效異同點，為臨床用藥的安全、有效提供準確可靠的依據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的為溪黃草藥材的質(zhì)量控制和真?zhèn)舞b別提供一個新的方法，通過建立溪黃草藥材指紋圖譜的方法，并由此方法得到溪黃草藥材共有模式的指紋圖譜。
[0006]為達到本發(fā)明的目的所采用的技術(shù)方案:用高效液相色譜法建立溪黃草藥材指紋圖譜的方法，具體包括如下步驟:
①、對照品溶液的制備:精密稱取對照品咖啡酸、6-C-吡喃阿拉伯糖基-8-C-吡喃葡萄糖基芹菜素、牡荊苷和迷迭香酸，以甲醇為溶劑，配成咖啡酸濃度為0.092mg/mL、6-C-吡喃阿拉伯糖基-8-C-吡喃葡萄糖基芹菜素為0.238mg/mL、牡荊苷為0.179mg/mL和迷迭香酸為
0.115mg/mL的混合對照品溶液。；
②、樣品溶液的制備:精密稱定溪黃草藥材粉末，精密加入50%乙醇20mL，稱搖勻，濾過，作為供試品溶液；
③、色譜條件:色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料，采用梯度洗脫，流動相為乙腈-磷酸組成的梯度洗脫液，紫外檢測波長為230?270nm ；
④、測定:精密吸取供試品溶液注入高效液相色譜儀，照高效液相色譜法測定，得到指紋圖譜。
[0007]進一步優(yōu)選的方法可以通過下述步驟實施:
①、對照品溶液的制備:精密稱取對照品咖啡酸、6-C-吡喃阿拉伯糖基-8-C-吡喃葡萄糖基芹菜素、牡荊苷和迷迭香酸，以甲醇為溶劑，配成咖啡酸濃度為0.092mg/mL、6-C-吡喃阿拉伯糖基-8-C-吡喃葡萄糖基芹菜素為0.238mg/mL、牡荊苷為0.179mg/mL和迷迭香酸為
0.115mg/mL的混合對照品溶液。；
②、樣品溶液的制備，取溪黃草藥材粉末1.0g，精密稱定，置50mL具塞錐形瓶中，精密加入50%乙醇20mL，稱定重量，超聲提取30min，放冷，再稱定重量，用50%乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，用0.22 μ m微孔濾膜濾過，作為樣品溶液；
所述步驟；
③、色譜條件，色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料，采用梯度洗脫，流動相為
0.1%?0.3%乙腈-磷酸組成的梯度洗脫液，柱溫:25?40°C，紫外檢測波長為230?270nm，時間 100 ?120min ；
④、測定，采用精密吸取樣品溶液10?20μ L注入高效液相色譜儀，照高效液相色譜法測定，得到指紋圖譜。
[0008]本發(fā)明最佳的檢測方法可以通過下述步驟實施:
步驟②樣品溶液的制備，取溪黃草藥材粉末1.0g,精密稱定，置50mL具塞錐形瓶中，精密加入50%乙醇20mL，稱定重量，超聲提取30min，放冷，再稱定重量，用50%乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，用0.22 μ m微孔濾膜濾過，作為樣品溶液；步驟③色譜條件中流動相為0.3%乙腈-磷酸組成的梯度洗脫液，流速為0.8mL/min，柱溫:30°C，紫外檢測波長為254nm,分析時間 120min ；
在步驟③中，所述的梯度洗脫，優(yōu)選梯度洗脫程序以如下體積濃度配置進行:
O分鐘時，流動相A為8%的乙腈溶液、流動相B為92%的0.3%的磷酸溶液；
5分鐘時，流動相A為12%的乙腈溶液、流動相B為88%的0.3%的磷酸溶液；
30分鐘時，流動相A為18%的乙腈溶液、流動相B為82%的0.3%的磷酸溶液；
60分鐘時，流動相A為23%的乙腈溶液、流動相B為77%的0.3%的磷酸溶液；
80分鐘時，流動相A為50%的乙腈溶液、流動相B為50%的0.3%的磷酸溶液；
100分鐘時，流動相A為70%的乙腈溶液、流動相B為30%的0.3%的磷酸溶液；
120分鐘時，流動相A為90%的乙腈溶液、流動相B為10%的0.3%的磷酸溶液。
[0009]具體見下表:
【權(quán)利要求】
1.一種溪黃草藥材指紋圖譜的建立方法，其特征在于采用高效液相色譜法，具體包括如下步驟: ①、對照品溶液的制備:精密稱取對照品咖啡酸、6-C-吡喃阿拉伯糖基-8-C-吡喃葡萄糖基芹菜素、牡荊苷和迷迭香酸，以甲醇為溶劑，配成咖啡酸濃度為0.092mg/mL、6-C-吡喃阿拉伯糖基-8-C-吡喃葡萄糖基芹菜素為0.238mg/mL、牡荊苷為0.179mg/mL和迷迭香酸為0.115mg/mL的混合對照品溶液； ②、樣品溶液的制備:準確稱定溪黃草藥材粉末，精密加入50%乙醇20mL，搖勻，濾過，作為供試品溶液； ③、色譜條件:色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料，采用梯度洗脫，流動相為乙腈-磷酸組成的梯度洗脫液，紫外檢測波長為230~270nm ； ④、測定:精密吸取供試品溶液注入高效液相色譜儀，照高效液相色譜法測定，得到指紋圖譜。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種溪黃草藥材指紋圖譜的建立方法，其特征在于: 所述步驟②樣品溶液的制備，取溪黃草藥材粉末1.0g，精密稱定，置50mL具塞錐形瓶中，精密加入50%乙醇20mL，稱定重量，超聲提取30min，放冷，再稱定重量，用50%乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，用0.22 μ m微孔濾膜濾過，作為供試品； 所述步驟③色譜條件，色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料，采用梯度洗脫，流動相為乙腈-0.1%~0.3%磷酸組成的梯度洗脫液，柱溫:25~40°C，紫外檢測波長為230~270nm，時間 100 ~120min ； 所述步驟④測定，采用精密吸取樣品溶液10~20 μ L注入高效液相色譜儀，照高效液相色譜法測定，得到指紋圖譜。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種溪黃草藥材指紋圖譜的建立方法，其特征在于: 所述步驟②樣品溶液的制備，取溪黃草藥材粉末1.0g,精密稱定，置50mL具塞錐形瓶中，精密加入50%乙醇20mL，稱定重量，超聲提取30min，放冷，再稱定重量，用50%乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，用0.22 μ m微孔濾膜濾過，作為樣品溶液； 所述步驟③色譜條件中流動相為乙腈-0.3%磷酸組成的梯度洗脫液，流速為0.SmL/min，柱溫:30°C，紫外檢測波長為254nm，分析時間120min。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的一種溪黃草藥材指紋圖譜的建立方法，其特征在于: 所述步驟③色譜條件中所述的梯度洗脫，梯度洗脫程序以如下體積濃度配置進行: O分鐘時，流動相A為8%的乙腈溶液、流動相B為92%的0.3%的磷酸溶液； 5分鐘時，流動相A為12%的乙腈溶液、流動相B為88%的0.3%的磷酸溶液； 30分鐘時，流動相A為18%的乙腈溶液、流動相B為82%的0.3%的磷酸溶液； 60分鐘時，流動相A為23%的乙腈溶液、流動相B為77%的0.3%的磷酸溶液； 80分鐘時，流動相A為50%的乙腈溶液、流動相B為50%的0.3%的磷酸溶液； 100分鐘時，流動相A為70%的乙腈溶液、流動相B為30%的0.3%的磷酸溶液； 120分鐘時，流動相A為90%的乙腈溶液、流動相B為10%的0.3%的磷酸溶液。
5.一種溪黃草藥材的指紋圖譜，其特征在于: 溪黃草藥材指紋圖譜的建立，具體包括如下步驟 ①、對照品溶液的制備:精密稱取對照品咖啡酸、6-C-吡喃阿拉伯糖基-8-C-吡喃葡萄糖基芹菜素、牡荊苷和迷迭香酸，以甲醇為溶劑，配成咖啡酸濃度為0.092mg/mL、6-C-吡喃阿拉伯糖基-8-C-吡喃葡萄糖基芹菜素為0.238mg/mL、牡荊苷為0.179mg/mL和迷迭香酸為0.115mg/mL的混合對照品溶液； ②、樣品溶液的制備:精密稱定溪黃草藥材粉末，精密加入50%乙醇20mL，搖勻，濾過，作為供試品溶液； ③、色譜條件:色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料，采用梯度洗脫，流動相為乙腈-磷酸組成的梯度洗脫液，紫外檢測波長為230~270nm ； ④、測定:精密吸取供試品溶液注入高效液相色譜儀，照高效液相色譜法測定，得到指紋圖譜。
6.一種溪黃草藥材的指紋圖譜，其特征在于:通過高效液相色譜儀獲得的指紋圖譜是聯(lián)合運用色譜峰保留時間(t)和二極陣列檢測器采集各色譜峰紫外光譜(UV)確定4個特征峰(見圖2和圖3);其中，S4號峰(迷迭香酸)的峰高最高(見圖1)，且均為4個品種溪黃草藥材均含有的色譜峰，峰面積最大，與相鄰峰分離度較好，在測定時比較穩(wěn)定，因此選作參照峰；咖啡酸、6-C-吡喃阿拉伯糖基-8-C-吡喃葡萄糖基芹菜素、牡荊苷和迷迭香酸均為線紋香茶菜、狹基線紋香茶菜和纖花線紋香茶菜共有的色譜峰(分別為2-Sl、3-S2、5-S3、9-S4峰)，而溪黃草僅有咖啡酸和迷迭香酸峰(分別為3-S1U5-S4峰)；指紋圖譜中特征峰的差異可作為區(qū)別溪黃草與正品線紋香茶的標準。
【文檔編號】G01N30/02GK103776926SQ201410008547
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2014年1月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月8日
【發(fā)明者】賴小平, 黃松, 蔣東旭 申請人:東莞廣州中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥數(shù)理工程研究院