專利名稱：：一種檢測牛細小病毒的熒光定量pcr試劑盒及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種檢測牛細小病毒的熒光定量PCR試劑盒，同時還涉及熒光定量PCR試劑盒的用途，適用于對血清制品中的牛細小病毒污染進行實時監(jiān)控，同時廣泛用于該病毒感染的流行病學(xué)調(diào)査，還可以為相關(guān)基礎(chǔ)研究提供技術(shù)支持。
背景技術(shù)：
：牛細小病毒(Bovineparvovirus,BPV)屬于細小病毒科細小病毒屬，基因組是單鏈的DNA分子，主要引起牛的呼吸道和腸道疾病，其主要特征是引發(fā)牛腹瀉另外致母牛流產(chǎn)。人工經(jīng)口或靜脈感染未吃初乳、體內(nèi)不含抗體的新生牛犢，于2448小時出現(xiàn)腹瀉，腹瀉同時伴有病毒血癥。且該病毒潛伏期不易被發(fā)覺，其易感和潛伏性給畜牧業(yè)及其國際貿(mào)易帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。因此，該病歷來都是國際社會最為關(guān)注的傳染病之一。牛細小病毒的快速檢測是控制和消滅該病的前提，但細小病毒的常規(guī)檢測方法有一些不足之處，檢測技術(shù)一般來說有血清學(xué)診斷技術(shù)、生物學(xué)試驗、分子生物學(xué)診斷技術(shù)三類1.血清學(xué)診斷技術(shù)包括補體結(jié)合實驗、中和實驗、凝集實驗、免疫擴散、沉淀實驗、免疫電泳技術(shù)、免疫熒光技術(shù)、放射免疫試驗和免疫電鏡技術(shù)等。在這些方法中得到普遍承認、采用并且廣泛應(yīng)用的有補體結(jié)合實驗、間接血凝實驗、瓊脂擴散實驗、中和實驗。但由于所有實驗均用到抗血清和抗原免疫反應(yīng)，反應(yīng)時間長，材料多，準(zhǔn)備周期長，檢測具有明顯的滯后性，只能定性不能定量，而且重復(fù)性差。2.生物學(xué)試驗包括動物實驗、雞胚接種和細胞培養(yǎng)。這種檢測方法存在不敏感問題，而且有些樣品中存在抗補體活性，影響檢測效果。動物實驗成本高，周期長，浪費生物資源和人力物力。3.分子生物學(xué)診斷技術(shù)包括核酸雜交、等電點聚焦電泳、寡核苷酸指紋圖譜分析、聚丙烯酰胺凝膠電泳、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、單克隆抗體技術(shù)等。核酸雜交、等電點聚焦電泳、寡核苷酸指紋圖譜分析、聚丙烯酰胺凝膠電泳3等檢測方法更適用于對病毒特性進行更加深入的研究，由于整個系統(tǒng)操作復(fù)雜，過程繁多，成本高，不適宜同時進行大批量檢測，因而受到很大限制。相比之下，普通PCR方法特異性好，檢測靈敏度高，不但可以檢測活病毒核酸，也能直接檢測滅活的核酸片段。樣品可以是牛血清，也可以是扁桃體、淋巴結(jié)、脊髓、肌肉和皮膚等組織，這是免疫學(xué)方法無法替代的。但這種傳統(tǒng)的定量方法測定的都是PCR的終產(chǎn)物，而不是起始DNA拷貝數(shù)。由于PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，所以根據(jù)最終的PCR產(chǎn)物量不能計算出起始DNA拷貝數(shù)。因此，如何快速、準(zhǔn)確測定牛腺病毒是面臨的主要難題之一。近年來發(fā)展起來的熒光定量PCR(FluorogeneticQuantitativePCR,FQ-PCR)技術(shù)以其靈敏度高、速度快、特異性強等優(yōu)點在基因表達水平分析(NellemannC,VinggaardAM，DalgaardM,etal.QuantificationofAntiandrogenEffectDeterminedbyLightCyclerTechnology[J].Toxicology,2001,163:29-38)、病原體的定性(McGoldrickA,LowingsJP,IbataG,etal.ANovelApproachtotheDetectionofClassicalSwineFeverVirusbyRT-PCRwithaFluorogenicProbe(TaqMan)[J].J.Virol.Methods,1998,72:125-135.;BhudeviB,WdnstockD.FluorogenicRT陽PCRassay(TaqMan)forDetectionandClassificationofBovineViralDiarrheaVirus[J].Vet.Microbiol.,2001,83:1-10.)和定量檢測(KathyF丄Tang,JunWang,DonaldV丄ightner.QuantitationofTaurasyndromevirusbyreal-timeRT-PCRwithaTaqManassay[J].J.Virol.Methods,115(2004)109國114.;MichaelaSchwaiger,PascalCassinotti.Developmentofaquantitativereal-timeRT-PCRassaywithinternalcontrolforthelaboratorydetectionoftickborneencephalitisvirus(TBEV)RNA[J].J.Clin.Microbiol.,27(2003)136-145.;R.FrankCookc,S丄Cooka，etal.Developmentofamultiplexreal-timereversetranscriptase-polymerasechainreactionforequineinfectiousanemiavirus(EIAN)[J].J.Virol.Methods,105(2002;)171-179.;BirgitLiss*.Improvedquantitativereal-timeRT-PCRforexpressionprofilingofindividualcells[J].NucleicAcidsRes"2002,Vol.30No.17e89.;FranckHousseau3,1imberlyR丄indseya''，etal.Quantitativereal-timeRT-PCRasamethodformonitoringTlymphocytereactivitytofull-lengthtyrosinaseproteininvaccinatedmelanomapatients[J].J.Immunol.Methods266(2002)87-103.;DesireN,DeheeA,SchneiderV,etal.QuantificationofHumanImmunodeficiencyVirusType1ProviralLoadbyaTaqManReal-TimePCRAssay[J].J.Clin.Microbiol,2001,39:1303國1310,;MartellM,GomezJ,EstebanJI,etal.High-ThroughputReal-TimeReverseTranscription-PCRQuantitationofHepatitisCVirusRNA[J].J.Clin.Microbiol,1999，37:327-332.;KearnsAM，TurnerAJL，EltringhamGJA,etal.RapidDetectionandQuantificationofCMVDNAinUrineusingLightcycler-basedReal-timePCR[J],J.Clin.Virol,2002,24:131-134;FlorenceKP,GlauciaPB，MireilleS,etal.QuantitationofHCVRNAusingreal-timePCRandfluorimetry[J].J.Virol.Methods,2001,95:111-119;ZakhartchoukA，ConnorsW，vanKesselA,etal.Bovineadenovirustype3containingheterologousproteinintheC-termi皿sofminorcapsidproteinIX.Virology,2004,320(2):291-300.)等方面得到廣泛應(yīng)用，并且已經(jīng)成為當(dāng)前病毒核酸定量主要方法，國內(nèi)目前已有關(guān)于丙肝、乙肝、支原體、艾滋病、結(jié)核定量檢測的試劑盒上市。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是在于提供了一種檢測牛細小病毒的熒光定量PCR試劑盒，該PCR試劑盒適用于目前市場上的所有類型熒光定量基因擴增儀，靈敏度高、定量快速準(zhǔn)確、檢測范圍廣，穩(wěn)定性好。本發(fā)明的另一個目的是在于提供了一種檢測牛細小病毒的熒光定量PCR試劑盒在奶牛感染細小病毒流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用，可高效方便地對血清制品中的牛細小病毒污染進行實時監(jiān)控，還可以為相關(guān)基礎(chǔ)研究提供技術(shù)支持。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施，該熒光定量PCR試劑盒包括a)DNA提取試劑，b)熱啟動TaqDNA聚合酶，c)引物和TaqMan探針，d)標(biāo)準(zhǔn)陽性DNA模板，e)PCR熒光定量反應(yīng)液，其特征在于引物序列分別為正義引物(FP):5'-CCAGTACCAGGAAACGGAGAC-3'，反義引物(RT):5'-GCATGTATTCCGGTCTCCAA-3'，擴增子大小為118bp，熒光探針序列為5'-FAM-CCTCAACATCTACGTCACCGGACAA陽TAMRA-3'(SEQIDNO:3)，探針的5'端標(biāo)記熒光發(fā)射基團FAM，靠近3'端標(biāo)記熒光淬滅基團TAMRA，標(biāo)準(zhǔn)陽性DNA模板由己插入細小病毒VP3蛋白編碼區(qū)118bp片段的pGEM-T載體(購自Pramega公司)轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a(購自Invitrogen公司，普通大腸桿菌DH5a)，增殖后提取質(zhì)粒制備，并于紫外分光光度計測A26o定量并10倍梯度稀5釋。所述的PCR熒光定量反應(yīng)液由10xbuffer、10pM的正義引物和反義引物、10pM的熒光探針和熱啟動TaqDNA聚合酶、無核酸酶的無菌水組成。所述的標(biāo)準(zhǔn)陽性模板DNA序列為GGAGACCGGAATACATGC。在本發(fā)明的一個優(yōu)選方案中，熒光定量反應(yīng)液由正義引物(FP)，反義引物(RT)，熒光探針(TaqMan)，10xbuffer溶液，熱啟動TaqDNA聚合酶，無核酸酶的滅菌雙蒸水組成；在本發(fā)明的一個具體方案中，熒光定量反應(yīng)液由10xbuffer溶液2.5^1，10nmol/L正義(FP)、反義(RP)引物各3fil，10|amol/L熒光探針0.75|il，dNTPs(10mM)l(il，熱啟動TaqDNA聚合酶0.25^1，Mg2SO4(50mM)0.5pl，無核酸酶的滅菌雙蒸水9nl組成。其中熒光探針為(SEQIDNO:3)所示的核苷酸序列，熒光探針5"端標(biāo)記的熒光報告基團是FAM，3'端標(biāo)記熒光淬滅基團TAMRA。在本發(fā)明的一個優(yōu)選方案中，標(biāo)準(zhǔn)陽性DNA模板由含有插入目的片段的pGEM-T(購自Promega公司)載體制備，于紫外分光光度計測八26()定量并10倍梯度稀釋。實驗所用的標(biāo)準(zhǔn)品制備過程為PCR產(chǎn)物電泳后切下含有目的片段的凝膠，用Omega公司的凝膠純化試劑盒純化，與pGEM-T載體(購自promega公司)4'C過夜連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂平板培養(yǎng)，挑取白斑PCR鑒定陽性后送英駿生物技術(shù)有限公司測序，根據(jù)測序結(jié)果將篩選的陽性克隆菌接種到含氨卞的LB培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，用SDS堿裂解法制備質(zhì)粒DNA，經(jīng)Omega公司的凝膠純化試劑盒純化后，于紫外分光光度計測A26()定量，并稀釋至梯度109-102拷貝/|^，-70匸保存，所用一切物品均無核酸酶。在本發(fā)明提供檢測牛細小病毒的熒光定量PCR試劑盒中，有一條一端標(biāo)記有熒光報告基團另一端標(biāo)記有熒光淬滅基團的特異性熒光探針，在探針完整時，兩基團在空間結(jié)構(gòu)上距離相互靠近，5'端報告基團產(chǎn)生的熒光因為熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)而被3'端淬滅基團淬滅，故體系中沒有熒光信號的變化。在PCR退火和延伸過程中，探針與模板特異性結(jié)合，隨著引物的延伸，TaqDNA聚合酶利用其5'-3'外切活性對探針進行切割釋放出報告基團，這樣破壞了兩基團之間的FRET，報告基團所釋放的熒光可以被內(nèi)置在定量檢測儀內(nèi)的熒光探測器檢測，模板每復(fù)制一次，就有一個探針被切斷，伴隨一個熒光信號的釋放。由于被釋放的熒光基團數(shù)目和PCR產(chǎn)物數(shù)量是一對一的關(guān)系，所以熒光量的增加與PCR產(chǎn)物的積累量呈比例關(guān)系。對BPV的定量可通過與標(biāo)準(zhǔn)品的循環(huán)域值(Ct，ThresholdCycle)相比較得出。Ct值是PCR過程中，熒光量的積累超過基底熒光量的循環(huán)數(shù)，Ct值與起始模數(shù)呈一定比例關(guān)系，Ct值越小，起始模板數(shù)越多，相反，Ct值越大，起始模板數(shù)越少。利用陽性梯度標(biāo)準(zhǔn)模板的a值制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)待測樣品的Ct值可準(zhǔn)確測出該樣品的起始拷貝數(shù)。在本發(fā)明提供檢測牛細小病毒的熒光定量PCR試劑盒中，針對牛細小病毒的基因組的靶片段核苷酸排列的特殊性，將反應(yīng)體系(引物和探針濃度、Mg2+濃度、擴增程序等)優(yōu)化，并將熒光定量PCR技術(shù)和定量檢測系統(tǒng)(包括LigthCycler系統(tǒng)，Roche,ABIPrism系統(tǒng)，PEAppliedBioasystems)相結(jié)合，將其用于各種來源的牛細小病毒樣品的定量檢測。通過優(yōu)化方案，反復(fù)實驗，以及與傳統(tǒng)檢測方法進行比較，建立了定量檢測BPV的方法，并研制出牛細小病毒的定量檢測試劑盒，該試劑盒的靈敏度可在每個反應(yīng)體系中檢出IOO個病毒基因拷貝數(shù)，檢測范圍可以達到八個數(shù)量級，是其它任何方法無法比擬的。在本發(fā)明的另外一個方面，還提供了一種檢測牛細小病毒的熒光定量PCR試劑盒在奶牛感染細小病毒流行病學(xué)調(diào)査中的應(yīng)用，熒光定量PCR試劑盒對牛細小病毒進行檢測的方法，該方法包括下列步驟-A)用e)標(biāo)準(zhǔn)陽性DNA模板由插入目的片段的pGEM-T(購自Promega公司)載體制備，并用紫外分光光度計定量；B)用a)DNA抽提液從待測標(biāo)本和陰陽性標(biāo)準(zhǔn)品中提取DNA，然后加C)e)PCR熒光定量反應(yīng)液及其優(yōu)化試劑，b)熱啟動TaqDNA聚合酶，c)引物和TaqMan探針；D)將C)步中已加入了標(biāo)準(zhǔn)品及待測樣品的熒光定量反應(yīng)液PCR反應(yīng)體系上機，用熒光定量檢測儀進行PCR檢測；E)通過比較待測樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的循環(huán)域值根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出待測樣品的起始拷貝數(shù)。在本發(fā)明中提供的檢測牛細小病毒的熒光定量PCR試劑盒可對各種來源的牛血清樣品進行準(zhǔn)確定量檢測，從而可對疫情進行實時監(jiān)控，可廣泛用于動物產(chǎn)品的進出口及動物食品的安全檢測和質(zhì)量監(jiān)控，可為相關(guān)基礎(chǔ)研究提供技術(shù)支持。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點和效果1.與傳統(tǒng)定量方法相比，此實時熒光定量PCR具有高靈敏性，高特異性和高準(zhǔn)確性的特點，直接對PCR每循環(huán)一次就收集一個數(shù)據(jù)，建立實時擴增曲線，準(zhǔn)確地確定Ct值，從而根據(jù)Ct值確定起始DNA拷貝數(shù)，做到了真正意義上的DNA2.檢測范圍廣，在109-102copies/reactiOn濃度范圍內(nèi)有極好的線性關(guān)系(R=0.999)，檢測范圍可以達到八個數(shù)量級，巳達到國際先進水平，其靈敏度可檢測100copies的水平，是其它任何方法無法比擬的。3.適用于各種型號的熒光定量擴增儀，一次實驗中三個重復(fù)樣品相應(yīng)的變異系數(shù)(CV)小于2%，說明其極高的重復(fù)性和穩(wěn)定性。4.該實時熒光定量PCR利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線，是迄今為止定量最準(zhǔn)確，重現(xiàn)性最好的定量方法，廣泛用于血清制品中的病毒污染、流行病檢查和基礎(chǔ)研究等領(lǐng)域。具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明要求保護的范圍，下列實施例中未注明的具體實驗條件和方法，通常按照常規(guī)條件如精編分子生物學(xué)指南，F(xiàn).M.奧斯柏等主編，科學(xué)出版社，1995，分子克隆實驗指南(第三版)；D丄.斯佩克特等，科學(xué)出版社，2001，細胞實驗指南；呂鴻聲，科學(xué)出版社，1982，或接照制造廠商所建議的條件。實施例1牛細小病毒的熒光定量PCR試劑盒組成及其反應(yīng)條件A).試劑盒組成a)試劑盒組成如下(IO次反應(yīng))DNA提取液A(4ml/管)DNA提取液B(2ml/管)DNA提取液C(2.6ml/管)DNA提取液D(2.5ml/管)RNaseA(40ul/管)蛋白酶K溶液(2ml/管)PCR擴增反應(yīng)液(220pl/管)強陽性標(biāo)準(zhǔn)品(IOO倍稀釋定值準(zhǔn)品20pl/管，共四管)陰性標(biāo)準(zhǔn)品(50^11/管)熱啟動TaqDNA聚合酶(2.75nl/管)PCR反應(yīng)管(無菌、無RNA酶和DNA酶)無核酸酶H20(2ml/管)臨界陽性標(biāo)準(zhǔn)品(50pl/管)(DNA提取液A、B、C、D為TIANGEN公司產(chǎn)品。b)熱啟動TaqDNA聚合酶(2U1)、c)PCR擴增反應(yīng)液購自Takara公司)B).熒光定量反應(yīng)液(反應(yīng)總體積是25pl):10xbuffer2.5pl，正義引物FP(SEQIDNO:l)和反義引物RP(SEQIDNO:2)各3pl(10pmol/L)，熒光探針0,75p1(10|amol/L)，dNTPs(10mM)lpl，Mg2SO4(50mM)0.5|al，熱啟動TaqDNA聚合酶0.25^1，標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品均為5^1，無核酸酶的滅菌雙蒸水9^1組成。其中熒光探針為(SEQIDNO:3)所示的核苷酸序列，熒光探針5'端標(biāo)記的熒光報告基團是FAM,3'端標(biāo)記熒光淬滅基團TAMRA。C).反應(yīng)條件如下(采用兩步法)PCR:94°C2min94°C30si4060°C90sJCycle在每個循環(huán)的第二步結(jié)束時進行熒光檢測。對BPV的定量可通過與標(biāo)準(zhǔn)品的循環(huán)域值(Ct，ThresholdCycle)相比較并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出待測樣品的起始拷貝數(shù)。D).熒光定量PCR試劑盒檢測細小病毒的靈敏度、檢測范圍及穩(wěn)定性取標(biāo)準(zhǔn)品DNA109-102c/nl濃度范圍，每個濃度三個重復(fù)，分別加入對應(yīng)編號的PCR反應(yīng)管，在熒光定量檢測儀上平行做PCR檢測。循環(huán)條件為94'C預(yù)變性2min;94°C30s，60°C90s，擴增40個循環(huán)。把熒光檢測的程序設(shè)置在每個循環(huán)的第二步結(jié)束時進行，檢測波長為518nm。循環(huán)結(jié)束后，運用Eppendorf公司的MastercyclerepRealplex儀器自帶的分析軟件(Realplex)，讀取待檢樣品拷貝數(shù)。結(jié)果為<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>以上結(jié)果表明該試劑盒檢測范圍廣，在109-102(^濃度范圍內(nèi)有極好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R=0.999，其檢測范圍可以達到八個數(shù)量級，其靈敏度可檢測lOOcopies，且穩(wěn)定性好，一次實驗中三個重復(fù)樣品相應(yīng)的變異系數(shù)(CV)小于2%，說明其極高的重復(fù)性，適用于各種型號的熒光定量擴增儀，是其它任何方法無法比擬的。實施例2熒光定量PCR試劑盒在奶牛感染細小病毒流行病學(xué)調(diào)査中的應(yīng)用A).試劑盒組成a)試劑盒組成如下(IO次反應(yīng))DNA提取液A(4ml/管)DNA提取液B(2ml/管)DNA提取液C(2.6ml/管)DNA提取液D(2.5ml/管)RNaseA(40ul/管)蛋白酶K溶液(2ml/管)PCR擴增反應(yīng)液(220pl/管)強陽性標(biāo)準(zhǔn)品(IOO倍稀釋定值準(zhǔn)品20^/管，共四管)陰性標(biāo)準(zhǔn)品(50pl/管)熱啟動TaqDNA聚合酶(2.75inl/管)PCR反應(yīng)管(無菌、無RNA酶和DNA酶)臨界陽性標(biāo)準(zhǔn)品(50pl/管)無核酸酶H20(2ml/管)(DNA提取液A、B、C、D為TIANGEN公司產(chǎn)品。b)熱啟動TaqDNA聚合酶(2U/pI)、c)PCR反應(yīng)液購自Takara公司)B).熒光定量反應(yīng)液(反應(yīng)總體積是25jil):10xbuffer2.5fi1,正義引物FP(SEQIDNO:l)和反義引物RP(SEQIDNO:2)各3pl(10pmol/L)，熒光探針0.75pi(10pmol/L),dNTPs(10mM)lpl，Mg2SO4(50mM)0.5|al，熱啟動TaqDNA聚合酶0.25^1，抽提的標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品均為5^1，無核酸酶的滅菌雙蒸水9^1組成。其中熒光探針為(SEQIDNO:3)所示的核苷酸序列，熒光探針5'端標(biāo)記的熒光報告基團是FAM，3'端標(biāo)記熒光淬滅基團TAMRA。C).反應(yīng)條件如下(采用兩步法)PCR:94。C2min在每個循環(huán)的第二步結(jié)束時進行熒光檢測。對BPV的定量可通過與標(biāo)準(zhǔn)品的循環(huán)域值(Ct，ThresholdCycle)相比較并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出待測樣品的起始拷貝數(shù)。D).熒光定量PCR試劑盒檢測細小病毒.-(1)不同來源的奶牛血清原料樣本，經(jīng)(X2tiM濾器過濾后，分別配制成5%(體積比)奶牛血清(FetalBovineSerum,FBS)的MEM培養(yǎng)基(lmlFBS加入19mlMEM)，分別編號為A1A25;(2)將狀態(tài)良好的原代牛腎細胞BKC接入6孔板，匯合度約25%，待細胞貼壁后(約6h)，更換為待檢的5%(體積比)FBSMEM樣本，同時設(shè)陰性對照和陽性對照，于37°C，5%(體積比)C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天后2000rpm離心5min收集細胞；(3)上述收集得到的細胞，倒盡上清，加入200^1DNA提取液A，振蕩至徹底懸浮，加入4plRNaseA(100mg/ml)，振蕩15s，室溫(2025°C，以下相同)放置5min;(4)加入20pl蛋白酶K，混勻(5至20次)；7(TC放置10min，至溶液變清亮，瞬時離心，去除管內(nèi)壁的水珠；(5)加入200pl無水乙醇，充分混勻15s，瞬時離心；(6)將上一歩溶液和絮狀沉淀都加入吸附柱中，12000rpm離心30s，棄廢液；(7)吸附柱中加入500plDNA提取液C(使用前加入3.4ml無水乙醇)，12000rpm離心30s，棄廢液；(8)吸附柱中加入700^1DNA提取液D(使用前加入10ml無水乙醇)，12000rpm離心30s，棄廢液；(9)吸附柱中加入500nlDNA提取液D，12000rpm離心30s，棄廢液；(10)空離吸附柱，12000rpm離心2min，室溫(20~25°C)涼干；(11)20^1無核酸酶水加入吸附柱，室溫放置2-5min，12000rpm離心2min;(12)得到的DNA用于下游的熒光定量PCR實驗。E)取D步所提DNA5pd,熒光定量反應(yīng)液(反應(yīng)總體積是25^1):10xbuffer2.5pl，正義引物FP(SEQIDN0:1)和反義引物RP(SEQIDNO:2)各3pl(10^unol/L)，熒光探針0.75pl(10|imol/L)，dNTPs(10mM)lnl，Mg2SO4(50mM)0.5pl，熱啟動TaqDNA聚合酶0.25W，標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品均為5^1，無核酸酶的滅菌雙蒸水9pl，分別加入對應(yīng)編號的PCR反應(yīng)管，在熒光定量檢測儀上平行做PCR檢領(lǐng)U。循環(huán)條件為94。C預(yù)變性2min;94°C30s，60°C90s，擴增40個循環(huán)。把熒光檢測的程序設(shè)置在每個循環(huán)的第二步結(jié)束時進行，檢測波長為518nm。循環(huán)結(jié)束后，運用Eppendorf公司的MastercyclerepRealplex儀器自帶的分析軟件(Realplex),讀取待檢樣品拷貝數(shù)。結(jié)果為血清樣品編號奶牛編號BPV變異系數(shù)％12<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>以上結(jié)果表明，奶牛編號為7-021的奶牛血清中含有BPV，表明奶牛群中存在少量的奶牛攜帶BPV,同時證實了牛細小病毒熒光定量PCR試劑盒能成功應(yīng)用于BPV流行病學(xué)調(diào)査，牛血清以及牛血液制品的監(jiān)測，重復(fù)性好，CV值均小于2%。實施例3熒光定量PCR試劑盒在市售牛血清產(chǎn)品中質(zhì)量監(jiān)測的應(yīng)用A).試劑盒組成a)試劑盒組成如下(IO次反應(yīng))DNA提取液A(4ml/管)DNA提取液B(2ml/管)DNA提取液C(2.6ml/管)DNA提取液D(2.5ml/管)RNaseA(40ul/管)蛋白酶K溶液(2ml/管)PCR擴增反應(yīng)液(220pl/管)熱啟動TaqDNA聚合酶(2.75pl/管)強陽性標(biāo)準(zhǔn)品(100倍稀PCR反應(yīng)管(無菌、無RNA酶和DNA酶)釋定值準(zhǔn)品20pl/管，共四管)無核酸酶1120(2ml/管)陰性標(biāo)準(zhǔn)品(50pl/管)臨界陽性標(biāo)準(zhǔn)品(50pl/管)(DNA提取液A、B、C、D為TIANGEN公司產(chǎn)品。b)熱啟動TaqDNA聚合酶(2U/nl)、c)PCR反應(yīng)液購自Takara公司)B).熒光定量反應(yīng)液(反應(yīng)總體積是25pl):10xbuffer2.5jal，正義引物FP(SEQIDNO:l)和反義引物RP(SEQIDNO:2)各3(10^mol/L)，熒光探針0.75pl(10|umol/L)，dNTPs(10mM)lpl，Mg2SO4(50mM)0.5pl，熱啟動TaqDNA聚合酶0.25^1，抽提的標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品均為5^1，無核酸酶的滅菌雙蒸水9^1組成。其中熒光探針為(SEQIDN03)所示的核苷酸序列，熒光探針5"端標(biāo)記的熒光報告基團是FAM，3"端標(biāo)記熒光淬滅基團TAMRA。C).反應(yīng)條件如下(采用兩步法)PCR:94°C2min94。C30s"^4060°C90s^Cycle在每個循環(huán)的第二步結(jié)束時進行熒光檢測。對BPV的定量可通過與標(biāo)準(zhǔn)品的循環(huán)域值(Ct，ThresholdCycle)相比較并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出待測樣品的起始拷貝數(shù)。D).熒光定量PCR試劑盒檢Gibco、Hyclone、杭州四季青、武漢三利生物技14術(shù)有限公司四個產(chǎn)家的血清是否污染有牛細小病毒:1)待檢血清的批號<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>2)實驗方法-(1)培養(yǎng)的原代牛腎細胞鋪制6孔板x4塊，2ml/L，50%(面積比)匯合度；(2)待檢血清用MEM配制為5%(體積比)工作濃度；(3)細胞貼壁后，更換為待檢血清配制的培養(yǎng)基，2ml/孔；(4)同時設(shè)陰性和陽性對照，陽性對照加含有BPV的5%(體積比)FBSMEM;(5)37°C，5%(體積比)C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。(6)細胞培養(yǎng)72h后，收集細胞，2000rpm離心5min暫存于-8(TC。其余樣品同樣方法處理。提取細胞的總DNA，作為熒光定量PCR的模板。3)細胞中總DNA的提取(1)上述收集得到的細胞，倒盡上清，加入200plDNA提取液A，振蕩至徹底懸浮，加入4plRNaseA(100mg/ml)，振蕩15s，室溫(20~25°C)放置5min;(2)加入20pl蛋白酶K，混勻(5至20次)；70。C放置10min，至溶液變清亮，瞬時離心，去除管內(nèi)壁的水珠；(4)加入200W無水乙醇，充分混勻15s，瞬時離心；(5)將上一步溶液和絮狀沉淀都加入吸附柱中，12000rpm離心30s，棄廢液；(6)吸附柱中加入500nlDNA提取液C(使用前加入3.4ml無水乙醇)，12000rpm離心30s,棄廢液；(7)吸附柱中加入700^1DNA提取液D(使用前加入10ml無水乙醇)，12000rpm離心30s，棄廢液；(8)吸附柱中加入500nlDNA提取液D，12000rpm離心30s，棄廢液；(9)空離吸附柱，12000rpm離心2min,室溫(20~25°C)涼干；(10)2(^1無核酸酶水加入吸附柱，室溫放置2-5min，12000rpm離心2min;(11)得到的DNA用于下游的熒光定量PCR實驗。E)取D步所提DNA5pl，熒光定量反應(yīng)液(反應(yīng)總體積是25pl):10xbuffer2.5^1，正義引物FP(SEQIDN0:1)和反義引物RP(SEQIDN0:2)各3(il(10Hmol/L)，熒光探針0.75pl(10|amol/L)，dNTPs(10mM)l|al，Mg2SO4(50mM)0.5pl，熱啟動TaqDNA聚合酶0.25^1，標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品均為5^1，無核酸酶的滅菌雙蒸水9pl，分別加入對應(yīng)編號的PCR反應(yīng)管，在熒光定量檢測儀上平行做PCR檢測。循環(huán)條件為94。C預(yù)變性2min;94°C30s，60°C90s，擴增40個循環(huán)。把熒光檢測的程序設(shè)置在每個循環(huán)的第二步結(jié)束時進行，檢測波長為518nm。循環(huán)結(jié)束后，運用儀器自帶分析軟件，讀取待檢樣品拷貝數(shù)。結(jié)果為:公司名稱血清批號BPV(copies/ml)Gibco749154-949184-719321-719351-7685959D-HycloneNSF0081-NSF0071-NSF0061-NSF0051-NSF0021-杭州四季青080304-080504-080426-080228-080408-武漢三利20080701-060604-20080302-16<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>-以上結(jié)果表明四個公司全部待檢批號的血清均表現(xiàn)為BPV陰性，而陽性對照細胞中檢測出大量的BPV，表明該試劑盒能用于檢測細胞樣品中的病毒。SEQUENCELISTING〈110>武漢三利生物技術(shù)有限公司〈120〉一種檢測牛細小病毒的熒光定量PCR試劑盒及應(yīng)用〈130>—種檢測牛細小病毒的熒光定量PCR試劑盒及應(yīng)用〈160〉3〈170〉Patentlnversion3.3<210>1〈211〉22〈212〉DNA〈213〉人工合成<400>1CCAGTACCAGGAAACGGAGAC21<210〉2〈211〉20〈212>DNA〈213〉人工合成<■〉2GCATGTATTCCGGTCTCCAA20<210〉3<211〉28<212>DNA<213>人工合成〈400〉3CCTCAACATCTACGTCACCGGACAA2權(quán)利要求1、一種檢測牛細小病毒的熒光定量PCR試劑盒，該試劑盒含有a)DNA提取試劑，b)熱啟動TaqDNA聚合酶，c)引物和TaqMan探針，d)標(biāo)準(zhǔn)陽性DNA模板，e)PCR熒光定量反應(yīng)液，其特征是引物序列分別為正義引物5′-CCAGTACCAGGAAACGGAGAC-3′，反義引物5′-GCATGTATTCCGGTCTCCAA-3′，擴增子大小為118bp，熒光探針序列為5′-FAM-CCTCAACATCTACGTCACCGGACAA-TAMRA-3′，探針的5’端標(biāo)記熒光發(fā)射基團FAM，3’端標(biāo)記熒光淬滅基團TAMRA，標(biāo)準(zhǔn)陽性DNA模板由已插入細小病毒VP3蛋白編碼區(qū)118bp片段的pGEM-T載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，增殖后提取質(zhì)粒制備，并于紫外分光光度計測A260定量并10倍梯度稀釋。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測牛細小病毒的熒光定量PCR試劑盒，其特征在于所述的PCR熒光定量反應(yīng)液由10xbuffer、10pM的正義引物和反義引物、10(iM的熒光探針和熱啟動TaqDNA聚合酶、無核酸酶的無菌水組成。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測牛細小病毒的熒光定量PCR試劑盒，其特征在于所述的標(biāo)準(zhǔn)陽性模板DNA序列為GGAGACCGGAATACATGC4、權(quán)利要求1所述的一種檢測牛細小病毒的熒光定量PCR試劑盒在奶牛感染細小病毒流行病學(xué)調(diào)査中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種檢測牛細小病毒的熒光定量PCR試劑盒及應(yīng)用，該試劑盒含有a)DNA提取試劑，b)熱啟動TaqDNA聚合酶，c)引物和TaqMan探針，d)標(biāo)準(zhǔn)陽性DNA模板，e)PCR熒光定量反應(yīng)液，其特征是引物序列為正義引物5′-CCAGTACCAGGAAACGGAGAC-3′，反義引物5′-GCATGTATTCCGGTCTCCAA-3′，擴增子大小為118bp，熒光探針序列為5′-FAM-CCTCAACATCTACGTCACCGGACAA-TAMRA-3′，探針的5’端標(biāo)記熒光發(fā)射基團FAM，靠近3’端標(biāo)記熒光淬滅基團TAMRA，標(biāo)準(zhǔn)陽性DNA模板由已插入細小病毒VP3蛋白編碼區(qū)118bp片段的pGEM-T載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，增殖后提取質(zhì)粒制備，并于紫外分光光度計測A<sub>260</sub>定量并10倍梯度稀釋。熒光定量PCR試劑盒在奶牛感染細小病毒流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用，高效方便地對血清制品中的牛細小病毒污染進行實時監(jiān)控，廣泛適用于該病毒感染的流行病學(xué)調(diào)查。文檔編號G01N21/64GK101565759SQ200910062398公開日2009年10月28日申請日期2009年6月2日優(yōu)先權(quán)日2009年6月2日發(fā)明者張國榮,勇李,鄭從義,佳郭,璇黃申請人:武漢三利生物技術(shù)有限公司
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