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一種測(cè)定原花青素含量及鑒別的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)一種測(cè)定原花青素含量及鑒別的方法，涉及一種用于天然物質(zhì)、保健食品、藥品中原花青素含量的檢測(cè)方法，屬于有機(jī)化學(xué)領(lǐng)域。其特征在于：本發(fā)明用分析純甲醇作為溶劑，將試樣與分析純甲醇混合于40KHz超聲處理20min，以4000r/min離心后取上清液，制得試樣溶液。其有益效果在于：該檢測(cè)過(guò)程運(yùn)用常規(guī)實(shí)驗(yàn)設(shè)備及材料，便于方法推廣和應(yīng)用；含量測(cè)定部分樣品前處理簡(jiǎn)單，確定原花青素B2做為對(duì)照品，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，避免了由于對(duì)照品不同而造成的結(jié)果差異；產(chǎn)品鑒別部分采用了可靠的HPLC方法，建立了不同來(lái)源原花青素類產(chǎn)品的特征譜圖，可有效鑒別其來(lái)源，方法專屬性強(qiáng)。
【專利說(shuō)明】一種測(cè)定原花青素含量及鑒別的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種用于天然物質(zhì)、藥品中原花青素含量的檢測(cè)方法，屬于有機(jī)化學(xué)領(lǐng)域，具體的說(shuō)是一種測(cè)定原花青素含量及鑒別的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]原花青素(Proanthocyanidins),也叫做縮合鞋質(zhì)(condensedtannins)或前花青素，是一種由若干個(gè)兒茶素類化合物聚合而成，具有黃烷-3-醇結(jié)構(gòu)的植物多酚類化合物，存在于自然界多種植物中，銀杏葉、葡萄籽、越橘、松樹(shù)皮、蓮房、玫瑰花等植物中均含有原花青素。研究表明原花青素不僅具有很強(qiáng)的抗氧化活性，同時(shí)還具有良好的抗腫瘤活性、血管內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用、調(diào)節(jié)血壓功能、抗炎癥和過(guò)敏功能，是多種功能性食品的有效成分，因此近年來(lái)從植物中提取的各種原花青素廣泛用于各類保健食品中。
[0003]由于原花青素是一類成分及其復(fù)雜的化合物，同時(shí)又缺少商業(yè)可用的對(duì)照，因此，目前原花青素的含量測(cè)定方法主要有分光光度法、高效液相色譜法；鑒別方法主要有薄層色譜法、高效液相色譜法。
[0004]分光光度法的基本原理是利用原花青素在無(wú)機(jī)酸存在和加熱的條件下被降解，產(chǎn)生紅色花青素，在546nm處有最大吸收，測(cè)定原花青素類化合物。此方法具有代表性的是2007版的《保健食品評(píng)價(jià)與技術(shù)規(guī)范》。分光光度法雖能測(cè)得原花青素總量，但方法中規(guī)定原花青素對(duì)照品過(guò)于籠統(tǒng)，不宜購(gòu)得，且該方法不能鑒別原花青素來(lái)源。
[0005]HPLC的基本原理是利用前處理將原花青素降解成花青素或樣品經(jīng)過(guò)前處理后，再利用HPLC色譜柱將原花青素中的各類組分分離，再用標(biāo)準(zhǔn)品定量。前者雖能測(cè)定原花青素含量，但不能鑒別不同來(lái)源的產(chǎn)品；后者由于原花青素的組成比較復(fù)雜，選定的標(biāo)準(zhǔn)品不同，結(jié)果就不同，因此該方法很難準(zhǔn)確定量絕大部分產(chǎn)品的原花青素。前者具有代表性的是GB/T22244-2008《保健食品中前花青素的測(cè)定》;后者具有代表性的是美國(guó)藥典(USP35)《葡萄籽原花青素》。
[0006]薄層色譜法的基本原理是利用原花青素類成分及其它雜質(zhì)成分對(duì)固定相能力不同，使在移動(dòng)相流過(guò)固定相的過(guò)程中，連續(xù)的產(chǎn)生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附，從而達(dá)到各成分的互相分離的目的，再利用合適的顯色從而達(dá)到鑒別的目的。該方法對(duì)于原花青素類產(chǎn)品鑒別的專屬性差，因此也不能有效鑒別原花青素來(lái)源。具有代表性的是美國(guó)藥典(USP35)《葡萄籽原花青素》。由于不同來(lái)源原花青素的提取物產(chǎn)品價(jià)格差異大，各類原花青素產(chǎn)品大部分無(wú)統(tǒng)一的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)或檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)低，特別是不同來(lái)源原花青素的鑒別報(bào)道甚少，導(dǎo)致一些非法商家用低價(jià)格的原花青素產(chǎn)品摻加到高價(jià)格產(chǎn)品中，以次充好，擾亂市場(chǎng)，并且危害食用者的健康和安全。
[0007]目前最常用的測(cè)定方法檢測(cè)時(shí)間都很長(zhǎng)，反應(yīng)時(shí)間均在半小時(shí)以上，不能做到快速檢測(cè)，由于在線檢測(cè)講究速度與準(zhǔn)確度，目前這幾種方法都不能滿足便于方法推廣和應(yīng)用的需求。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明主要針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提出一種測(cè)定原花青素含量及鑒別的方法，其能對(duì)含原花青素的樣品在常溫常壓下進(jìn)行，所需時(shí)間短且無(wú)毒，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確。
[0009]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所述一種測(cè)定原花青素含量及鑒別的方法，其實(shí)現(xiàn)方法如下:
[0010]1、試樣溶液制備:稱取50-100mg試樣置于50mL容量瓶中，加入3OmL甲醇，以40KHz超聲處理20min，放冷至室溫后，加甲醇至刻度，搖勻，以4000r/min離心后取上清液，即試樣溶液；
[0011]2、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:精密稱取原花青素標(biāo)準(zhǔn)品B2 (≥99%) 10mg，溶于IOmL甲醇中，分別吸取該溶液0mL、0.lmL、0.25mL、0.5mL、l.0mLU.5mL置于具塞錐瓶中，采用與試樣相同的測(cè)定方法測(cè)吸光度，以濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)制標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0012]3、試樣測(cè)定:將正丁醇與鹽酸按95:5的體積比混合后，取出6mL置于具塞錐瓶中，再加入0.2mL硫酸鐵銨溶液和ImL試樣溶液，混勻，置98-100°C沸水浴回流，精確加熱40min后，立即置2-10°C冷水中冷卻15min后，于546nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度，用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算試樣中原花青素的含量。
[0013]本發(fā)明所述一種測(cè)定原花青素鑒別的方法，以乙腈作為流動(dòng)相添加劑，通過(guò)梯度洗脫，實(shí)現(xiàn)原花青素試樣 的鑒別，具體步驟如下:
[0014]①標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液制備:稱取樣品200mg置于50mL容量瓶中，加入分析純甲醇40mL,以40KHz超聲振蕩30min后冷卻至室溫定容,用微孔濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣測(cè)定；
[0015]②溶液制備:稱取樣品200mg置于50mL容量瓶中，加入分析純甲醇40mL，以40KHz超聲振蕩30min后冷卻至室溫定容,用0.45 μ m微孔濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣測(cè)定；
[0016]③色譜條件:色譜柱:PRP-125cmX4.6mmX 5 μ m,
[0017]流動(dòng)相A:分析純乙腈
[0018]流動(dòng)相B:0.3%磷酸水溶液
[0019]
【權(quán)利要求】
1.一種測(cè)定原花青素含量的方法，其特征在于: (1)試樣溶液制備:稱取50-100mg試樣置于50mL容量瓶中，加入30mL甲醇，以40KHz超聲處理20min，放冷至室溫后，加甲醇至刻度，搖勻，以4000r/min離心后取上清液，即試樣溶液； (2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:精密稱取原花青素標(biāo)準(zhǔn)品B2(≥99%) 10mg，溶于IOmL甲醇中，分別吸取該溶液OmL、0.lmL、0.25mL、0.5mL、l.0mLU.5mL置于具塞錐瓶中，采用與試樣相同的測(cè)定方法測(cè)吸光度，以濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)制標(biāo)準(zhǔn)曲線； (3)試樣測(cè)定:將正丁醇與鹽酸按95:5的體積比混合后，取出6mL置于具塞容器中，再加入0.2mL硫酸鐵銨溶液和ImL試樣溶液，混勻，置98_100°C沸水浴回流，精確加熱40min后，立即置2-10°C冷水中冷卻15min后，于546nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度，用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算試樣中原花青素的含量。
2.一種利用權(quán)利要求1所述測(cè)定方法鑒別物料中原花青素的方法，其特征在于:包括以下步驟:以乙腈作為流動(dòng)相添加劑，通過(guò)梯度洗脫，實(shí)現(xiàn)原花青素試樣的鑒別，具體步驟如下: ①標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液制備:稱取樣品200mg置于50mL容量瓶中，加入分析純甲醇40mL，以40KHz超聲振蕩30min后冷卻至室溫定容,用微孔濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣測(cè)定； ②溶液制備:稱取樣品200mg置于50mL容量瓶中，加入分析純甲醇40mL，以40KHz超聲振蕩30min后冷卻至室溫定容,用0.45 μ m微孔濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣測(cè)定； ③色譜條件:色譜柱:PRP-125cmX4.6mmX 5 μ m, 流動(dòng)相A:分析純乙腈
3.如權(quán)利要求2所述測(cè)定方法鑒別物料中原花青素的方法，其特征在于:所述微孔濾膜孔徑為0.45 μ m。
【文檔編號(hào)】G01N30/06GK103954700SQ201410146549
【公開(kāi)日】2014年7月30日 申請(qǐng)日期:2014年4月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月12日
【發(fā)明者】秦蓉, 王讓成, 李苗鴿, 錢英, 王濤, 任靜, 孫蕊艷, 萇釗, 翟巧麗 申請(qǐng)人:陜西衡道檢測(cè)技術(shù)有限公司