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基于毛細管整體柱的表面增強拉曼基底的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明基于毛細管整體柱的表面增強拉曼基底的制備方法，包括以下步驟：⑴毛細管的預(yù)處理；⑵整體柱的合成；⑶毛細管整體柱的功能化處理；⑷制備合成反應(yīng)物；⑸修飾金屬納米粒子；⑹拉曼光譜的檢測；本發(fā)明將毛細管色譜分離技術(shù)與表面增強拉曼光譜技術(shù)聯(lián)用，構(gòu)建了微型的納米粒子修飾的整體柱SERS基底，方法簡便，重復(fù)性好；在整體柱材料上修飾的金屬納米粒子具有良好的生物親和力，構(gòu)建的基底對于生物樣品的富集、分離、檢測具有優(yōu)勢：反應(yīng)時間短、易于保存、重復(fù)性和穩(wěn)定性極好，具有檢測靈敏度高、檢測進樣量少、檢測信號均一的優(yōu)點，為實現(xiàn)整體柱上的分離檢測奠定了基礎(chǔ)。
【專利說明】基于毛細管整體柱的表面增強拉曼基底的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分析化學【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及毛細管色譜與拉曼光譜技術(shù)，具體地說，是一種基于毛細管整體柱的表面增強拉曼基底的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]表面增強拉曼光譜(SERS)具有較高的表面物種的檢測靈敏度，能從分子水平上獲得物質(zhì)的結(jié)構(gòu)及化學組成信息，具有識別指紋的特征，其與紅外、熒光等其它光譜手段相比具有不受水干擾、不易猝滅、可用紅光激發(fā)、受生物樣品自身熒光干擾小等優(yōu)點，尤其適合于對生物體系的研究。所涉及的金屬溶膠基底由于制備簡單、增強效果好，是最常用的一種SERS活性基底。
[0003]金屬納米粒子能制備納米級的SERS粗糙表面，在物理、化學很多領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。比較常用的納米粒子有Ag、Au納米顆粒,其粒徑一般在10?IOOnm之間。當分析物分子加入至溶膠溶液之后，溶膠中的納米顆粒得到一定程度的凝聚，這是溶膠作為SERS基底能增強SERS信號的必要條件:其中，銀納米粒子(AgNPs)制備簡單、快速，SERS靈敏度高；金納米粒子(GNPs)具有更好的穩(wěn)定性、小尺寸效應(yīng)、量子效應(yīng)、表面效應(yīng)和良好的生物親和效應(yīng)，可用于從復(fù)雜的基體中萃取和富集目標分析物。
[0004]在分析化學領(lǐng)域，“整體柱”又稱“整體固定相”，是在柱管內(nèi)原位聚合或固定化了的連續(xù)整體多孔結(jié)構(gòu)，人們可根據(jù)需要對整體材料的表面作相應(yīng)的衍生化，是一種新型的用于分離分析或作為反應(yīng)器的多孔介質(zhì)。整體柱材料是多孔性結(jié)構(gòu)，是一種良好的SERS基底的支架結(jié)構(gòu)。整體柱中的空間由聚合物顆粒中的孔和顆粒間的縫隙組成，具有極大的表面積，“分離”是在樣品流經(jīng)孔結(jié)構(gòu)時發(fā)生的。目前，人們可通過控制聚合條件來得到具有理想孔徑分布的整體柱。將整體柱材料與SERS聯(lián)用可實現(xiàn)對于探針分子的微量超靈敏檢測。同時，結(jié)合納米粒子后的整體柱材料也具有良好的富集、分離特性。作為有機聚合整體柱的一類，基于甲基丙烯酸縮水甘油酯和硅膠整體柱在高效液相色譜中已得到了廣泛應(yīng)用。但是，傳統(tǒng)的表面增強拉曼光譜基底在穩(wěn)定性、均一性和重復(fù)性上存在一些不足，對表面增強拉曼光譜的研究與應(yīng)用有一定的影響。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明目的在于解決上述問題，提供一種基于毛細管整體柱的表面增強拉曼基底的制備方法，用其制備的表面增強拉曼基底具有測靈敏度高、檢測進樣量少、重復(fù)性和穩(wěn)定性好的優(yōu)點，能將毛細管色譜的分離、富集功能與表面增強拉曼光譜的在線檢測相結(jié)合，實現(xiàn)在整體柱上的在線分離和富集檢測。
[0006]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取了以下技術(shù)方案。
[0007]—種基于毛細管整體柱的表面增強拉曼基底的制備方法，其特征是，包括以下步驟:
(I)毛細管的預(yù)處理 ①將毛細管依次用稀堿、水、稀酸、去離子水和無水乙醇沖洗，沖洗后用氮氣吹干；
②通入硅烷化試劑，將毛細管兩端封口在室溫下放置24小時；
③洗凈后用氮氣吹干毛細管以備用；
(2)整體柱的合成
在步驟(I)預(yù)處理的毛細管內(nèi)合成聚丙烯酸酯類、聚苯乙烯類和聚丙烯酰胺類整體柱材料，得到有多孔結(jié)構(gòu)的毛細管整體柱；
(3)毛細管整體柱的功能化處理
利用功能化溶液對步驟(2)得到的毛細管整體柱進行處理，使毛細管整體柱的表面具有特定的功能基團，對金屬納米粒子具有鍵合或者吸附能力；
所述特定的功能化基團包括氨基或巰基；
(4)制備合成反應(yīng)物
將硝酸銀、氯金酸或者兩者混合溶于超純水中，另取檸檬酸三鈉溶液:將硝酸銀、氯金酸或者兩者混合溶液加熱至沸騰，邊攪拌邊將檸檬酸三鈉溶液逐滴緩慢加入，待檸檬酸三鈉溶液滴加完成后，繼續(xù)不斷攪拌并保持溶液沸騰狀態(tài)10分鐘，之后停止加熱，讓溶液自然冷卻至室溫，得到銀溶膠、金溶膠或金銀復(fù)合溶膠；
(5)修飾金屬納米粒子
利用步驟(4)的合成反應(yīng)物以下面兩種方法修飾金屬納米粒子:
①采用化學還原法在步驟(3)功能化處理后的毛細管整體柱內(nèi)原位合成金屬納米粒
子;
②采用化學還原法合成金屬納米粒子，再通入步驟(3)功能化處理后的毛細管整體柱
內(nèi)；
(6)拉曼光譜的檢測
在步驟(5)修飾了金屬納米粒子基底的毛細管整體柱內(nèi)引入檢測樣品進行表面增強拉曼光譜的檢測。
[0008]進一步，步驟(I)使用的毛細管為石英毛細管，內(nèi)徑為530rtn,長度為I?30cm。
[0009]進一步，步驟(I)硅烷化試劑為甲基丙烯酸氧丙基三甲氧基硅烷(Y-MAPS)的丙酮溶液。
[0010]進一步，步驟(3)所述的功能化溶液包括氨水溶液、乙二胺溶液、硫酸溶液、半胱氨酸溶液或硫化鈉-磷酸鹽緩沖液。
[0011]進一步，步驟(3)功能化處理的多孔結(jié)構(gòu)的毛細管整體柱表面具有活性基團，能被改性；改性的范圍包括聚丙烯酸酯類、聚苯乙烯類或聚丙烯酰胺類整體柱。所述毛細管整體柱的材料具有富集與分離特性。
[0012]進一步，步驟(4)所述的金屬納米粒子包括銀納米粒子、金納米粒子、金銀復(fù)合納米粒子，其粒徑為IOnm?500nm。
[0013]進一步，在步驟(5)的拉曼光譜檢測中，將毛細管整體柱截成長度為5?200mm的短管基底用于表面增強拉曼檢測。
[0014]進一步，使用所述短管基底進行檢測時，進樣量在5?2000 I之間，在去除了涂層的檢測窗口位置進行表面增強拉曼檢測。[0015]進一步，步驟(5)所述的檢測樣品為常用的探針分子或者生物分子。
[0016]本發(fā)明基于毛細管整體柱的表面增強拉曼基底的制備方法的積極效果是:
(I)將毛細管色譜分離技術(shù)與表面增強拉曼光譜(SERS)技術(shù)聯(lián)用，構(gòu)建了微型的納米粒子修飾的整體柱SERS基底，方法簡便，重復(fù)性好。
[0017](2)利用功能化溶液處理毛細管整體柱后合成金屬納米粒子，構(gòu)建的表面增強拉曼基底比現(xiàn)有的表面增強拉曼基底更加穩(wěn)定。
[0018](3)本發(fā)明在整體柱材料上修飾的金屬納米粒子具有良好的生物親和力，構(gòu)建的基底對于生物樣品的富集、分離、檢測具有優(yōu)勢。
[0019](4)在毛細管整體柱內(nèi)化學還原合成金屬納米粒子的方法與傳統(tǒng)的方法相比，反應(yīng)時間短，重復(fù)性更好。
[0020](5)將表面增強拉曼基底構(gòu)建在毛細管內(nèi)，與外界空氣的接觸面小，所述基底的穩(wěn)定性極好，而且易于保存。
[0021](6)本發(fā)明的基于毛細管整體柱的表面增強拉曼基底與現(xiàn)有常見的表面增強拉曼基底相比，具有檢測靈敏度高、檢測進樣量少、檢測信號均一和穩(wěn)定性高的優(yōu)點。
[0022](7)本發(fā)明將毛細管色譜的分離、富集功能與SERS在線檢測相結(jié)合，為實現(xiàn)整體柱上的分離檢測奠定了基礎(chǔ)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1為本發(fā)明的用銀納米粒子修飾的整體柱的掃描電子顯微鏡照片。
[0024]圖2為本發(fā)明的用金納米粒子修飾的整體柱的掃描電子顯微鏡照片。
[0025]圖3為10_9mol/L羅丹明6G分子在銀納米粒子修飾的整體柱表面(隨機選取10個點)的拉曼光譜(SERS)譜圖。
[0026]圖4為10_7mol/L4-巰基吡啶分子在金銀復(fù)合納米粒子修飾的整體柱表面(隨機選取10個點)的拉曼光譜(SERS)譜圖。
[0027]圖5為10_6 mo I/L 4_巰基吡啶分子在金納米粒子修飾的整體柱表面(隨機選取10個點)的SERS譜圖。
【具體實施方式】
[0028]以下介紹本發(fā)明基于毛細管整體柱的表面增強拉曼基底的制備方法的【具體實施方式】，提供3個實施例。但是應(yīng)該指出，本發(fā)明的實施不限于以下的實施方式。
[0029]本發(fā)明構(gòu)建了基于毛細管整體柱和金納米粒子的表面增強拉曼光譜(SERS)基底，以下實施例是以探針分子羅丹明6G (R6G)和4-巰基吡啶(4-Mpy)的具體實施方法，其中未注明具體條件的實驗是按照通常的常規(guī)條件或者按照制造廠商建議的條件進行的；所述的“室溫”是指實驗室操作環(huán)境的溫度，一般為25°C ;所用試劑未特別標注的均為本領(lǐng)域技術(shù)人員在一般實驗室常用的試劑，所用原料和試劑除特別說明的之外均為從市場上可購得的原料和試劑。
[0030]實施例1
一種基于毛細管整體柱的表面增強拉曼基底的制備方法，包括以下步驟:
(I)毛細管的預(yù)處理 ①米用內(nèi)徑為530 llITi長度為Icm石英毛細管，依次用0.lmol/L NaOH、水、0.lmol/LHC1、去離子水和無水乙醇沖洗，對石英毛細管進行活化，沖洗后用氮氣吹干。
[0031]②向干燥的石英毛細管內(nèi)注入50% (v/v)甲基丙烯酸氧丙基三甲氧基硅烷(Y-MAPS)的丙酮溶液，將石英毛細管兩端封口放置在室溫下。
[0032]③在常溫下反應(yīng)24小時后，利用甲醇將剩余溶液沖洗干凈；再利用氮氣將處理好的石英毛細管干燥30分鐘，密封備用。
[0033](2)整體柱的合成
稱取甲基丙烯酸縮水甘油酯GMA 0.864g、二甲基丙烯酸乙二酯EDMA 0.576g (單體)、十二醇0.3456g和環(huán)己醇1.8144g (致孔劑)、過氧化苯甲酰BPO (引發(fā)劑)0.0144g,通氮氣至過氧化苯甲酰完全溶解；再將所述溶液注射入步驟(I)預(yù)處理的石英毛細管中，封口后放入72°C的水浴中，恒溫反應(yīng)24小時后取出；用乙醇洗凈，得到有多孔結(jié)構(gòu)的毛細管整體柱。
[0034](3)毛細管整體柱的功能化處理
配制lmol/L乙二胺溶液:將0.2mL乙二胺溶液以0.2mL/h流速通入步驟(2)得到的多孔結(jié)構(gòu)的毛細管整體柱內(nèi)，使所述毛細管整體柱的表面具有氨基，對金屬納米粒子具有鍵合或者吸附能力；
然后用去離子水清洗毛細管整體柱至流出液體為中性；
將清洗后的毛細管整體柱切割成5-20mm小段備用。
[0035](4)制備合成反應(yīng)物
利用檸檬酸三鈉還原硝酸銀制備銀溶膠:稱取18mg硝酸銀溶于IOOmL超純水中，充分溶解；另取3mL的檸檬酸三鈉溶液(質(zhì)量分數(shù)1%):將硝酸銀溶液加熱至沸騰，邊攪拌邊將檸檬酸三鈉溶液逐滴緩慢加入，待檸檬酸三鈉溶液滴加完成后，繼續(xù)不斷攪拌并保持溶液沸騰狀態(tài)10分鐘，之后停止加熱，讓溶液自然冷卻至室溫，得到呈灰綠色的銀溶膠。
[0036](5)修飾金屬納米粒子(SERS基底的制備)
取步驟(4)得到的銀溶膠0.1mL以0.6mL/h的流速通入步驟(3)處理后的毛細管整體柱中，得到目標產(chǎn)物——基于修飾了銀納米顆粒的毛細管整體柱的表面增強拉曼基底。
[0037](6)拉曼光譜的檢測
采用羅丹明6G (R6G)作為探針分子，取IOOyL l(T9mol/L R6G引入步驟(5)修飾了銀納米顆粒的毛細管整體柱的表面增強拉曼基底，再將毛細管整體柱直立置于拉曼激光下，隨機測量10個點的SERS信號。
[0038]實施例1制備的基于修飾了銀納米顆粒的毛細管整體柱的表面增強拉曼基底的微觀形貌見圖1 ;拉曼光譜見圖3。
[0039]實施例2
一種基于毛細管整體柱的表面增強拉曼基底的制備方法，包括以下步驟:
(I)毛細管的預(yù)處理
采用內(nèi)徑為530 %ι長度為5cm石英毛細管，其余參見實施例1。
[0040](2)整體柱的合成(參見實施例1)。
[0041](3)毛細管整體柱的功能化處理
配制lmol/L半胱氨酸溶液:將0.1mL半胱氨酸溶液以0.2mL/h流速通入步驟(2)得到的多孔結(jié)構(gòu)的毛細管整體柱內(nèi)，使毛細管整體柱的表面具有巰基，對金納米粒子具有鍵合或者吸附能力；
然后用去離子水清洗毛細管整體柱至流出液體為中性；
將清洗后的毛細管整體柱切割成0.5-lcm小段備用。
[0042](4)制備合成反應(yīng)物
利用檸檬酸三鈉還原氯金酸制備金銀復(fù)合溶膠:取50mL lmmol/L氯金酸與Immol/L硝酸銀混合溶液置于250mL的圓底燒瓶中，加熱攪拌至沸騰，保持沸騰狀態(tài)下快速加入
1.85mL檸檬酸鈉溶液(質(zhì)量分數(shù)1%)后持續(xù)加熱保持沸騰狀態(tài)15分鐘，繼續(xù)不斷攪拌，之后移除熱源，繼續(xù)攪拌20分鐘；冷卻至室溫后，將合成的金銀復(fù)合溶膠置于棕色廣口瓶中避光保存。
[0043](5)修飾金納米粒子(SERS基底的制備)
取步驟(4 )制備金銀復(fù)合溶膠0.1mL通入步驟(3 )處理后的毛細管整體柱內(nèi)，得到目標產(chǎn)物——基于修飾了金銀復(fù)合納米顆粒的毛細管整體柱的表面增強拉曼基底。 [0044](6)拉曼光譜的檢測
將不同濃度(IO-5 mo I/L-1 O^8 mol/L)的探針分子4-巰基吡啶(4-Mpy)溶液100 PL通入步驟(5)修飾了金銀復(fù)合納米顆粒的毛細管整體柱的表面增強拉曼基底，再將毛細管整體柱直立置于拉曼激光下，隨機測量10個點的SERS信號。
[0045]實施例2制備的基于修飾了金銀復(fù)合納米顆粒的毛細管整體柱的表面增強拉曼基底的拉曼光譜見圖4。
[0046]實施例3
一種基于毛細管整體柱的表面增強拉曼基底的制備方法，包括以下步驟:
(I)毛細管的預(yù)處理
采用內(nèi)徑為530 Pm、長度為30cm石英毛細管，其余參見實施例1。
[0047](2)整體柱的合成(參見實施例1)。
[0048](3)毛細管整體柱的功能化處理
配制硫化鈉-磷酸鹽緩沖液:配制0.lmol/L磷酸二氫鈉溶液,取8mL于50mL燒杯中，加入2mL甲醇溶液與4.8g硫化鈉固體,超聲溶解,用5mol/L磷酸溶液調(diào)節(jié)pH至8,使用中速定性濾紙(最大孔徑15~20 PflO過濾備用；
將0.2mL所述硫化鈉-磷酸鹽緩沖液以0.2mL/h流速通入步驟(2)得到的多孔結(jié)構(gòu)的毛細管整體柱內(nèi)，使毛細管整體柱的表面具有巰基，然后用去離子水清洗毛細管整體柱至流出液體為中性；
將清洗后的毛細管整體柱切割成3~15cm小段備用。
[0049](4)制備合成反應(yīng)物并修飾金納米粒子(SERS基底的制備)
采用化學還原法原位還原合成金納米粒子:配制0.01g/mL氯金酸溶液、0.0175g/mL朽1檬酸三鈉溶液，置于5°C低溫下；將氯金酸溶液與檸檬酸三鈉溶液以體積比1:1混合后直接通入步驟(3)所得的多孔結(jié)構(gòu)的毛細管整體柱，將所述毛細管整體柱封口后放入90°C水浴中，反應(yīng)lOmin，得到目標產(chǎn)物一基于修飾了金納米顆粒的毛細管整體柱的表面增強拉曼基底。
[0050](5)拉曼光譜的檢測 將不同濃度(10_5 mo I/L-1O-7 mol/L)的探針分子4-巰基吡啶(4_Mpy)溶液200 PLfflA步驟(5)修飾了金納米粒子基底的毛細管整體柱內(nèi)，再用0.1mL甲醇溶液沖洗，用手術(shù)刀將毛細管表面的涂層刮除，置于拉曼激光下，隨機測量10個點的SERS信號。
[0051]實施例3制備的基于修飾了金納米顆粒的毛細管整體柱的表面增強拉曼基底的微觀形貌見圖2 ;拉曼光譜見圖5。
【權(quán)利要求】
1.一種基于毛細管整體柱的表面增強拉曼基底的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)毛細管的預(yù)處理 ①將毛細管依次用稀堿、水、稀酸、去離子水和無水乙醇沖洗，沖洗后用氮氣吹干； ②通入硅烷化試劑，將毛細管兩端封口在室溫下放置24小時； ③洗凈后用氮氣吹干毛細管以備用； (2)整體柱的合成 在步驟(1)預(yù)處理的毛細管內(nèi)合成聚丙烯酸酯類、聚苯乙烯類和聚丙烯酰胺類整體柱材料，得到有多孔結(jié)構(gòu)的毛細管整體柱； (3)毛細管整體柱的功能化處理 利用功能化溶液對步驟(2)得到的毛細管整體柱進行處理，使毛細管整體柱的表面具有特定的功能基團，對金屬納米粒子具有鍵合或者吸附能力； 所述特定的功能化基團包括氨基或巰基； (4)制備合成反應(yīng)物 將硝酸銀、氯金酸或者兩者混合溶于超純水中，另取檸檬酸三鈉溶液:將硝酸銀、氯金酸或者兩者混合溶液加熱至沸騰，邊攪拌邊將檸檬酸三鈉溶液逐滴緩慢加入，待檸檬酸三鈉溶液滴加完成后，繼續(xù)不斷攪拌并保持溶液沸騰狀態(tài)10分鐘，之后停止加熱，讓溶液自然冷卻至室溫，得到銀溶膠、金溶膠或金銀復(fù)合溶膠； (5)修飾金屬納米粒子 利用步驟(4)的合成反應(yīng)物以下面兩種方法修飾金屬納米粒子: ①采用化學還原法在步驟(3)功能化處理后的毛細管整體柱內(nèi)原位合成金屬納米粒子; ②采用化學還原法合成金屬納米粒子，再通入步驟(3)功能化處理后的毛細管整體柱內(nèi)； (6)拉曼光譜的檢測 在步驟(5)修飾了金屬納米粒子基底的毛細管整體柱內(nèi)引入檢測樣品進行表面增強拉曼光譜的檢測。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于毛細管整體柱的表面增強拉曼基底的制備方法，其特征在于，步驟(1)使用的毛細管為石英毛細管，內(nèi)徑為530 rtn,長度為I~30cm。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于毛細管整體柱的表面增強拉曼基底的制備方法，其特征在于，步驟(1)硅烷化試劑為甲基丙烯酸氧丙基三甲氧基硅烷(Y-MAPS)的丙酮溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于毛細管整體柱的表面增強拉曼基底的制備方法，其特征在于，步驟(3)所述的功能化溶液包括氨水溶液、乙二胺溶液、硫酸溶液、半胱氨酸溶液或硫化鈉-磷酸鹽緩沖液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于毛細管整體柱的表面增強拉曼基底的制備方法，其特征在于，步驟(3)功能化處理的多孔結(jié)構(gòu)的毛細管整體柱表面具有活性基團，能被改性；改性的范圍包括聚丙烯酸酯類、聚苯乙烯類或聚丙烯酰胺類整體柱。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于毛細管整體柱的表面增強拉曼基底的制備方法，其特征在于，步驟(4)所述的金屬納米粒子包括銀納米粒子、金納米粒子、金銀復(fù)合納米粒子,其粒徑為 IOnm ~500nm。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于毛細管整體柱的表面增強拉曼基底的制備方法，其特征在于，在步驟(5)的拉曼光譜檢測中，將毛細管整體柱截成長度為5~200mm的短管基底用于表面增強拉曼檢測。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的基于毛細管整體柱的表面增強拉曼基底的制備方法，其特征在于，使用所述短管基底進行檢測時，進樣量在5~2000 I之間，在去除了涂層的檢測窗口位置進行表面增強拉曼檢測。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于毛細管整體柱的表面增強拉曼基底的制備方法，其特征在于，步驟(5)所述的檢測樣品為常用的探針分子或者生物分子。
【文檔編號】G01N21/65GK103994991SQ201410214057
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2014年5月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月21日
【發(fā)明者】杜一平, 潘英騁, 汪宣, 張涵, 徐瑩 申請人:華東理工大學