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一種高爾基體蛋白73(gp73)抗原硅基磁珠結(jié)合物的制備及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種GP73抗原硅基磁珠結(jié)合物，并以此結(jié)合物作為組份之一，搭配其他組份組成了一種競爭法GP73定量檢測試劑盒。本發(fā)明的試劑盒由高爾基體蛋白73(GP73)抗原硅基磁珠結(jié)合物工作液、高爾基體蛋白73(GP73)校準品、堿性磷酸酶標記抗高爾基體蛋白73(GP73)單克隆抗體工作液、清洗液和化學(xué)發(fā)光底物組成。同時本發(fā)明提供了上述GP73抗原硅基磁珠結(jié)合物的制備方法以及試劑盒各組份的制備方法，包括GP73抗原硅基磁珠結(jié)合物工作液的配制、酶標記抗體、校準品配制、清洗液、發(fā)光底物配制等步驟。本發(fā)明的試劑盒主要可應(yīng)用于原發(fā)性肝癌的診斷，具有靈敏度高、線性范圍寬、無hook效應(yīng)、成本低檢驗耗時短等優(yōu)點。
【專利說明】一種高爾基體蛋白73(GP73)抗原硅基磁珠結(jié)合物的制備及應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及免疫分析醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明提供了一種穩(wěn)定性高的高爾基體蛋白73 (Golgi Protein-73,以下簡寫為GP73)抗原硅基磁珠結(jié)合物的制備方法及其在免疫診斷試劑盒中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是常見的惡性腫瘤之一，由于其發(fā)病隱匿，臨床上約有2/3的HCC患者初診時已屬中晚期。據(jù)統(tǒng)計，肝癌在世界范圍內(nèi)發(fā)病人數(shù)超過50萬，該人數(shù)在逐年增加，其中中國肝癌人數(shù)將約占去其中的50%，在惡性腫瘤死亡順位中占第二位。醫(yī)學(xué)研究表明，如若早期發(fā)現(xiàn)肝癌并且及時治療大概可以提高患者的5年存活率，因此肝癌的早期發(fā)現(xiàn)具有重要的臨床意義。
[0003]原發(fā)性肝細胞癌通常發(fā)生于有慢性病毒性肝炎、肝硬化基礎(chǔ)的人群，能夠及時的跟蹤監(jiān)測隨訪這部分人群，對提高肝癌的早期診斷率有著重要的意義。目前，對于HCC常用的檢測手段包括肝超聲影像分析和血清學(xué)標志物檢測，其中最常使用的血清學(xué)標志物是甲胎蛋白(AFP)，但是AFP在早期肝癌診斷中靈敏度不高，只有50 %?60 %的肝癌患者AFP呈陽性，并且慢性肝炎、肝硬化患者等肝癌高危人群也可引起甲胎蛋白的升高。因此，臨床需要一種更理想的血清標志物。
[0004]近年來，隨著基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、腫瘤免疫等相關(guān)研究的飛速發(fā)展，與肝癌相關(guān)的新的腫瘤標志物相繼出現(xiàn)，其中高爾基體糖蛋白73(GP73)是最值得期待的血清標志物之一。
[0005]高爾基體糖蛋白73(GP73)又稱II型高爾基體跨膜蛋白(Golgiphosphoprotein2, G0LPH2)和GOLMl，因其在SDS-PAGE中顯示相對分子質(zhì)量為?.3xl04，所以稱為GPTSt5Kladney等證明GP73主要表達于上皮細胞，在正常肝臟，GP73主要在膽管上皮細胞中表達，而在干細胞則很少表達甚至不表達，但是其在各種急、慢性肝炎及肝硬化患者中GP73水平明顯上調(diào)。2004年Iftikhar等研究發(fā)現(xiàn)GP73在急性肝炎(包括病毒性和自身免疫性)和進行性肝硬化患者(慢性丙型肝炎和酒精性肝病)中表達明顯增高(IftikharR, Kladney RD, Havl1glu N, et al.Disease and cell specific express1n of GP73inhuman liver disease [J].Am J Gastroenterol2004,99(6):1087-1095)。
[0006]2005年，Block等研究發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性肝癌患者血清中的GP73含量明顯升高(BlockTM, et al.Proc Natl Acad Sci USA, 2005,102(3):779-784.)，同年，Marrero 等通過臨床血清標本分析測定，發(fā)現(xiàn)GP73用于診斷肝癌的靈敏度和特異性均超過70%，診斷早期肝癌的靈敏度為AFP的2.55倍，在AFP < 20ng/L的肝癌患者中，超過一半的人群GP73明顯升高(Marrero JA, et al.J Hepatol, 2005,43 (6):1007-1012)。因此，對 AFP 陰性的肝癌患者，GP73的應(yīng)用能夠明顯提高肝癌的檢出率。
[0007]GP73的臨床檢驗技術(shù)有不少文章和專利。在期刊文章方面所涉及到的GP73檢測方法有很多，排除掉操作方面復(fù)雜、成本高、文章較少的免疫印跡法、配套預(yù)裝離心柱的酶標試劑盒法及抗體芯片法后，目前絕大多數(shù)文獻中的檢測方法是雙抗夾心酶聯(lián)免疫法。專利方面的情況與期刊文章類似，其中CN200810172605《抗高爾基體蛋白單克隆抗體及應(yīng)用》和CN200810181016《一種抗GP73蛋白的單克隆抗體、其制備方法和應(yīng)用》等的技術(shù)重點是抗GP73單克隆抗體的制備及所制備的單克隆抗體的應(yīng)用，其中涉及到的檢測試劑盒一般均采用微孔板包被抗體，另一抗體標記辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶，使用夾心法測定GP73含量，均屬于比較傳統(tǒng)的微孔板酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)。在臨床檢驗方面，微孔板酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)已逐步被更完善的技術(shù)取代，例如顯色底物被靈敏度更高的發(fā)光底物所取代，做為固相載體的微孔板被反應(yīng)面積更大的免疫磁珠所取代等。在磁珠方面需要說明的是，在酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)中所用的磁珠以羥基或羧基磁珠為主，偶有使用氨基磁珠，表面其他活性基團的磁珠未見在酶聯(lián)免疫檢測中使用，硅基磁珠由于對核酸有吸附力，所以在臨床上主要用于核酸的檢測，沒有用于蛋白質(zhì)檢測的文獻。在GP73酶聯(lián)免疫檢測方面，引入免疫磁珠的文獻很少，在專利CN103499692A中，提出了一種GP73板式磁顆?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析方法，引入了磁顆粒，不過從其具體專利內(nèi)容來看，磁顆粒上的活性基團沒有明確的說明，從交聯(lián)方法來看，磁珠應(yīng)該是羥基或羧基磁珠，其交聯(lián)方式是羥基或羧基磁珠的簡易交聯(lián)方法，其效果不會很理想，從最終試劑盒的介紹來看，性能很一般。
[0008]綜上所述，目前GP73的主流酶聯(lián)免疫法，主要有以下不足:一、靈敏度一般均較低，線性范圍窄，受到微孔板的面積限制，微孔板作為載體可包被的抗體有限，反應(yīng)面積小，較顯著地限制了試劑的線性范圍，要么試劑靈敏度低，要么試劑盒的線性上限低，不能有效滿足臨床的應(yīng)用；個別文獻采用了磁珠作為固相載體，但對磁顆粒沒有明確說明，交聯(lián)方法也屬于簡易方法，不能發(fā)揮出磁珠的優(yōu)勢，從最終試劑盒的介紹來看，仍存在靈敏度低和線性范圍窄的問題；二、所用連接方法采用雙抗夾心反應(yīng)原理，存有Hook效應(yīng)問題，進一步限制了線性范圍；三、反應(yīng)體系中存在兩種抗體及GP73抗原，成本較高；四、反應(yīng)試劑組分一般較多或者反應(yīng)模式較為復(fù)雜，導(dǎo)致反應(yīng)步驟繁瑣、反應(yīng)時間長。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明所需要解決的技術(shù)問題是:彌補現(xiàn)有GP73檢測技術(shù)的不足，建立一種GP73和硅基磁珠連接的新型方法，制備出非特異性極低、穩(wěn)定性高的GP73硅基磁珠連接物，并以此連接物作為組份之一，搭配其他組份組成了一種競爭法GP73定量檢測試劑盒，具有靈敏度高、線性范圍寬、無hook效應(yīng)、成本低檢驗耗時短等優(yōu)點。
[0010]本發(fā)明的技術(shù)問題，通過以下的技術(shù)方案解決:
[0011]1.一種GP73抗原硅基磁珠結(jié)合物的制備方法，優(yōu)選的，包括以下幾個步驟:
[0012]I)稱取一定量的娃基磁珠,將娃基磁珠溶于其質(zhì)量(單位:毫克)數(shù)一半毫升數(shù)的70%乙醇中，加入硅基磁珠質(zhì)量(單位:毫克)數(shù)0.5%毫升數(shù)的氨水、加入3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)使其終濃度為15% (V/V)，室溫攪拌反應(yīng)17?18小時，之后用磁板沉淀磁珠，去除上清，用純化水清洗5次，得到表面修飾有一定量氨基的硅基磁珠；
[0013]2)將上一步得到的表面修飾有氨基的硅基磁珠溶于其質(zhì)量(單位:毫克)數(shù)一半毫升數(shù)的pH = 8.0±0.05的50mM Tris緩沖液中，加入戊二醛使其濃度為5% (V/V)，室溫震蕩反應(yīng)I小時，之后用磁板沉淀磁珠，去除上清，用純化水清洗5次，得到表面修飾有一定fe基的娃基磁珠；
[0014]3)將上一步得到的表面修飾有一定醛基的硅基磁珠用pH = 7.8±0.05的50mMPBS緩沖液清洗3次后，用磁板沉淀磁珠去上清后待用；
[0015]4)按每400mg硅基磁珠對應(yīng)Img高爾基體蛋白73 (GP73)全長抗原的比例，稱取所需量的GP73全長抗原，溶解于pH = 7.8±0.05的50mM PBS緩沖液制備出濃度為35 μ g/ml的高爾基體蛋白73(GP73)全長抗原溶液，待用；
[0016]5)將步驟3)得到的全部表面修飾有醛基的硅基磁珠加入步驟4)的GP73全長抗原溶液中，室溫震蕩混勻3小時，之后用磁板沉淀磁珠，去除上清，繼續(xù)用pH = 7.8±0.05的50mM PBS緩沖液清洗至上清0D280 < 0.0050。再次用磁板沉淀磁珠，去除上清，得到高爾基體蛋白73(GP73)抗原硅基磁珠結(jié)合物。
[0017]6)將上一步得到的GP73抗原硅基磁珠結(jié)合物加入一定量的保存緩沖液(pH =7.8±0.05，100mMTris,0.85% NaCl，0.5% BSA，0.1% Proclin300)得到 GP73 抗原硅基磁珠結(jié)合物濃溶液，用于日常保存。
[0018]上述方法中所述的GP73抗原硅基磁珠結(jié)合物濃溶液，可采用以下方式測定濃度:將濃溶液混勻，取一定體積的濃溶液，用磁板沉淀磁珠結(jié)合物，去除上清后，對磁珠結(jié)合物進行干燥后稱重，用磁珠結(jié)合物的重量除以所取濃溶液體積，得到GP73抗原硅基磁珠結(jié)合物濃溶液的磁珠結(jié)合物濃度。
[0019]上述方法中所述的GP73抗原，優(yōu)選的，是帶His標簽的高爾基體蛋白73 (GP73)全長抗原。
[0020]上述方法中所述的硅基磁珠，是四氧化三鐵經(jīng)過二氧化硅包裹形成的硅基殼層的磁微粒，可以從外部購買，也可以自制，優(yōu)選的，自制硅基磁珠的制備方法包含如下步驟:
[0021]I)將含F(xiàn)e3+和Fe2+試劑按2.5:1的摩爾比溶于水中形成混合液，其中Fe3+在混合液中可接受的摩爾濃度范圍為0.03?0.3mol/L，在55°C氮氣保護狀態(tài)下攪拌反應(yīng)2小時，攪拌轉(zhuǎn)速為400?650rpm，并通過濃NaOH溶液調(diào)節(jié)混合液pH值為堿性，反應(yīng)得到磁性四氧化三鐵微粒，即磁微粒。
[0022]2)將上一步中制備得到的磁性四氧化三鐵顆粒,利用純化水清洗至中性,之后加入其質(zhì)量(單位:毫克)數(shù)一半毫升數(shù)的90%乙醇，繼續(xù)加入磁微粒質(zhì)量0.5%毫升數(shù)的氨水，在30°C下攪拌，1kHZ超聲30分鐘后緩慢加入90%乙醇體積0.5%體積的正硅酸乙酯(TEOS)，反應(yīng)持續(xù)15-16小時，結(jié)束后之后用磁板沉淀磁珠，去除上清，用純化水清洗5次即得到二氧化硅包裹四氧化三鐵的磁性顆粒，即自制硅基磁珠。
[0023]在自制娃基磁珠制備過程中，取磁微粒和自制娃基磁珠進行電鏡粒徑測試，計算二氧化硅殼層厚度，優(yōu)選的，磁微粒直徑在I?3.5 μ m，二氧化硅殼層厚度為15?20nm。
[0024]2.一種競爭法酶促化學(xué)發(fā)光高爾基體蛋白73(GP73)定量檢測試劑盒，其組份包括:
[0025]I)高爾基體蛋白73(GP73)校準品；
[0026]2)堿性磷酸酶標記抗高爾基體蛋白73(GP73)單克隆抗體工作液；
[0027]3)高爾基體蛋白73(GP73)抗原硅基磁珠結(jié)合物工作液；
[0028]4)清洗液；
[0029]5)化學(xué)發(fā)光底物。
[0030]優(yōu)選的，高爾基體蛋白73 (GP73)抗原硅基磁珠結(jié)合物工作液的配制方法為:使用上述步驟制備而成的GP73抗原硅基磁珠結(jié)合物濃溶液加入保存緩沖液(pH = 7.8±0.05，10mM Tris,0.85% NaCl,0.5% BSA,0.1 % Proclin300)配制成一定濃度得到的，工作液中磁珠結(jié)合物可接受的濃度范圍為0.5?2mg/ml。
[0031]優(yōu)選的，競爭法GP73定量檢測試劑盒GP73校準品的制備過程包括如下步驟:
[0032]I)校準品緩沖液制備:準確稱取Tris堿0.6g,NaC10.85g,海藻糖3g,Proclin300
0.lg，添加80g純化水混勻后，用高濃度鹽酸或氫氧化鈉調(diào)整pH = 7.8±0.05，添加BSA6g，混勻后定重至100g，繼續(xù)混勻30分鐘后0.22 μ m過濾。
[0033]2)校準品的配制:在上述緩沖液中加入GP73抗原配制而成。
[0034]優(yōu)選的，堿性磷酸酶標記抗高爾基體蛋白73(GP73)單克隆抗體工作液的制備包括以下步驟:
[0035]I)稱取 3mg2IT，用含有 50mM Tris,0.1M NaCl 和 0.005M EDTA, pH = 8.5±0.05水溶液溶解至10mg/ml ;準確量取GP73單克隆抗體0.5mg，通過濃縮或定容的方式使溶液中抗體濃度為3.5mg/ml，溶劑使用上述2IT溶液的溶劑，置于反應(yīng)試管底部；在含有3.5mg/mlGP73單克隆抗體溶液的試管中加入其體積1/20比例的2IT溶液進行活化?；靹?，在室溫下反應(yīng)20分鐘，結(jié)束后利用分子篩層析方式去除溶液中的過量的2IT，得到活化的抗體；
[0036]2)準確量取堿性磷酸酶0.4mg,置于反應(yīng)試管底部；稱取3mg的SMCC用二甲基甲酰胺(DMF)溶解至5mg/ml ;在含有堿性磷酸酶的試管中加入其體積1/20的SMCC溶液，混勻后，室溫下反應(yīng)15分鐘，結(jié)束后利用分子篩層析去除溶液中的過量的SMCC，得到活化的堿性磷酸酶；
[0037]3)將以上步驟中活化的抗體和活化的堿性磷酸酶按質(zhì)量比1: 0.8混合，加入6μ I的IM MgCl2溶液,混勻后在2?8°C環(huán)境下反應(yīng)24小時。反應(yīng)結(jié)束后，用分子篩層析的方法純化得到最終抗體-酶連接物；
[0038]4)工作液緩沖液制備:準確稱取 Tris 堿 0.6g，NaCl0.85g，Proclin300 0.lg，添加80g純化水15分鐘混勻后用高濃度鹽酸或氫氧化鈉溶液調(diào)整pH = 7.2±0.05，繼續(xù)加入IM MgCl20.35ml, 0.1M ZnCl20.05ml, BSA0.5g，純水定重至 100g，30 分鐘混勻后 0.22 μ m 過濾，即得到工作液緩沖液；
[0039]5)將以上步驟中得到的抗體-酶連接物，利用工作液緩沖液稀釋至抗體-酶連接物濃度為3.0μ g/ml，即得到堿性磷酸酶標記抗高爾基體蛋白73(GP73)單克隆抗體工作液。
[0040]優(yōu)選的，清洗液的配制方法如下:
[0041]稱取Trisl211.4mg, NaC19g,吐溫-20 lg,加入純化水約900ml，混勻至各試劑溶解，用高濃度鹽酸溶液或高濃度氫氧化鈉溶液調(diào)整溶液PH值到8.0±0.5，補加純化水定容至1000ml，混勻30分鐘，過濾后待用。
[0042]優(yōu)選的，化學(xué)發(fā)光底物的配制包括以下步驟:
[0043]準確稱取AMPH) (3-(2-螺旋金剛烷)_4_甲氧基_4_(3_磷氧酰)-苯基_1，2_ 二氧環(huán)乙烷二鈉鹽)或APS-51g，Tris24g，氯化鈉(NaCl) 160g，CTAC0.0255g，加入純化水約900ml，混勻15分鐘，用高濃鹽酸溶液或高濃氫氧化鈉溶液調(diào)整溶液pH值到9.7±0.05，之后補加純化水定容至1000ml，混勻待用。本化學(xué)發(fā)光底物為針對堿性磷酸酶的化學(xué)發(fā)光底物，需要在2-8 °C條件下避光保存，用時緩慢混勻。
[0044]本GP73-硅基磁珠結(jié)合物及相應(yīng)試劑盒的創(chuàng)新性和突出技術(shù)優(yōu)勢具體在于:
[0045]I)將硅基磁珠引入到了酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)中并通過創(chuàng)新的方法對硅基磁珠的表面進行了一定的氨基化和醛基化，既保留了硅基磁珠對蛋白質(zhì)有一定物理吸附力的特性，又使硅基磁珠表面具備了與蛋白質(zhì)進行化學(xué)鍵結(jié)合的能力；利用了 GP73抗原對二氧化硅較強的物理吸附特性，GP73抗原首先與磁珠表面吸附，之后GP73抗原與磁珠表面的氨基及醛基的化學(xué)鍵連接由于距離近而完成得更充分；最終的結(jié)合物同時有化學(xué)鍵和物理吸附力兩種作用力，穩(wěn)定性很好，同時由于磁珠的上述特性，GP73抗原在磁珠表面的封閉效果很好，磁珠結(jié)合物的非特異性極低；此GP73-硅基磁珠結(jié)合物被配制成工作液加入到GP73檢測試劑盒中，使試劑盒具備更高的靈敏度和線性范圍，同時有效期更長。
[0046]2)試劑盒的反應(yīng)模式是競爭法，無hook效應(yīng)問題，明顯拓展了檢測試劑盒的線性范圍；
[0047]3)試劑盒的反應(yīng)體系均一，能夠極大提高抗原抗體的結(jié)合速率，樣本測定耗時短。

【具體實施方式】
[0048]實施例1自制硅基磁珠的制備
[0049]l)Fe3+在混合液中摩爾濃度為0.3mol/L的制備磁微粒1:準確稱取FeCl3.6H2040.54g和FeCl2.4H2011.93g溶于500ml純化水中，在55°C氮氣保護狀態(tài)下攪拌反應(yīng)2小時，攪拌轉(zhuǎn)速為400?650rpm，并通過濃NaOH溶液調(diào)節(jié)混合液pH為堿性，反應(yīng)得到磁性四氧化三鐵微粒，即磁微粒,稱為磁微粒I。結(jié)束后用純化水清洗磁微粒至中性。將磁微粒浸泡于一定純化水中混勻，取出一些磁微粒溶液利用烘干法(即取一定體積磁微粒溶液烘干稱量干燥后的磁微粒質(zhì)量，除以原體積)，測定四氧化三鐵濃度。
[0050]2) Fe3+在混合液中摩爾濃度為0.03mol/L的制備磁微粒2:準確稱取FeCl3.6H204.054g和FeCl2.4H201.193g溶于500ml純化水中，在55°C氮氣保護狀態(tài)下攪拌反應(yīng)2小時，攪拌轉(zhuǎn)速為400?650rpm，并通過濃NaOH溶液調(diào)節(jié)混合液pH為堿性，反應(yīng)得到磁性四氧化三鐵微粒，即磁微粒,稱為磁微粒2。結(jié)束后用純化水清洗磁微粒至中性。將磁微粒浸泡于一定純化水中混勻，取出一些磁微粒溶液利用烘干法(即取一定體積磁微粒溶液烘干稱量干燥后的磁微粒質(zhì)量，除以原體積)，測定四氧化三鐵濃度。
[0051]3)準確量取步驟I)得到磁微粒I 200mg，磁分離去除其中的水分，添加90%乙醇100ml、氨水1ml，在30°C下機械攪拌1kHZ超聲30分鐘后緩慢加入0.5ml的TE0S，反應(yīng)持續(xù)15-16小時，結(jié)束后用純化水清洗5次即得到二氧化硅包裹四氧化三鐵的磁性顆粒，命名為硅基磁珠I。
[0052]4)準備量取步驟2)得到磁微粒2200mg，磁分離去除其中的水分，添加90%乙醇100ml、氨水1ml，在30°C下機械攪拌1kHZ超聲30分鐘后緩慢加入0.5ml的TE0S，反應(yīng)持續(xù)15-16小時，結(jié)束后用純化水清洗5次即得到二氧化硅包裹四氧化三鐵的磁性顆粒，命名為硅基磁珠2。
[0053]5)利用電鏡檢測確定磁微粒1、磁微粒2、硅基磁珠I和硅基磁珠2的粒徑并計算，磁微粒粒徑在I μ m-3.5 μ m,硅基磁珠的二氧化硅殼層厚度在15_20nm。
[0054]實施例2 GP73抗原硅基磁珠結(jié)合物的制備
[0055]I)準確量取硅基磁珠200mg，溶于100ml70%乙醇中，加入Iml的氨水、加入3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)使其終濃度為15% (V/V)，室溫機械攪拌反應(yīng)17?18小時，之后用磁板沉淀磁珠，去除上清，用純化水清洗5次，即得到表面修飾有一定量氨基的磁微粒。
[0056]2)將步驟I)得到的修飾有氨基的磁微粒溶于100ml pH = 8.0±0.05的50mMTris緩沖液中，加入戊二醛使其濃度為5% (V/V)，室溫震蕩反應(yīng)I小時，結(jié)束后用磁板沉淀磁珠，去除上清，用純化水清洗5次，得到表面修飾有一定醛基的硅基磁珠。
[0057]3)將步驟2)得到的修飾有醛基的硅基磁珠用pH = 7.8±0.05的50mM PBS緩沖液清洗3次后，用磁板沉淀磁珠去上清后，待用；
[0058]4)稱取0.5mg帶His標簽的GP73全長抗原，溶解于14.28ml pH = 7.8±0.05的50mM PBS緩沖液中，制備出14.28ml濃度為35 μ g/ml的GP73全長抗原溶液，待用；
[0059]5)將步驟3)得到的修飾有醛基的硅基磁珠加入步驟4)的14.28ml GP73全長抗原溶液中，室溫震蕩混勻3小時，繼續(xù)用pH = 7.8±0.05的50mM PBS緩沖液清洗至上清OD< 0.0050。再次用磁板沉淀磁珠，去除上清，得到高爾基體蛋白73(GP73)抗原硅基磁珠結(jié)合物。
[0060]6)將步驟5)得到的GP73抗原硅基磁珠結(jié)合物加入一定量的保存緩沖液(pH =7.8±0.05，100mMTris,0.85% NaCl,0.5% BSA，0.1% Proclin300)得到 GP73 抗原硅基磁珠結(jié)合物濃溶液，用于日常保存；
[0061]7)將濃溶液混勻，取一定體積的濃溶液，用磁板沉淀磁珠結(jié)合物，去除上清后，對磁珠結(jié)合物進行干燥后稱重，用磁珠結(jié)合物的重量除以所取體積，得到GP73抗原硅基磁珠結(jié)合物濃溶液的磁珠結(jié)合物濃度；
[0062]8)工作液的配制:參照步驟7)得到的GP73抗原硅基磁珠結(jié)合物濃溶液的濃度，用保存緩沖液(pH = 7.8±0.05，10mM Tris,0.85% NaCl，0.5% BSA，0.1% Proclin300)稀釋GP73抗原硅基磁珠結(jié)合物濃溶液，得到所需濃度的GP73抗原硅基磁珠結(jié)合物的工作液。
[0063]米用娃基磁珠1、娃基磁珠2及外購于河南惠爾納米科技有限公司的娃基磁珠(簡稱為硅基磁珠3)，按上述步驟分別制備出GP73抗原硅基磁珠結(jié)合物的工作液1-1 (濃度為
0.5mg/ml，簡稱GP73硅基磁珠工作液1_1)、GP73抗原硅基磁珠結(jié)合物的工作液1_2 (濃度為2mg/ml，簡稱GP73硅基磁珠工作液1_2)、GP73抗原硅基磁珠結(jié)合物的工作液2_1 (濃度為0.5mg/ml，簡稱GP73硅基磁珠工作液2_1)、GP73抗原硅基磁珠結(jié)合物的工作液2_2 (濃度為2mg/ml，簡稱GP73硅基磁珠工作液2_2)、GP73抗原硅基磁珠結(jié)合物的工作液3_1 (濃度為0.5mg/ml,簡稱GP73硅基磁珠工作液3_1)和GP73抗原硅基磁珠結(jié)合物的工作液3-2 (濃度為2mg/ml，簡稱GP73硅基磁珠工作液3-2)。
[0064]實施例3 堿性磷酸酶標記抗高爾基體蛋白73 (GP73)單克隆抗體工作液以及其余試劑組份的制備
[0065]1、堿性磷酸酶標記抗高爾基體蛋白73(GP73)單克隆抗體工作液的制備
[0066]I)稱取 3mg2IT，用含有 50mM Tris,0.1M NaCl 和 0.005M EDTA, pH = 8.5±0.05水溶液溶解至10mg/ml ;準確量取GP73單克隆抗體0.5mg，通過濃縮或定容的方式使溶液中抗體濃度為3.5mg/ml，溶劑使用上述2IT溶液的溶劑，置于反應(yīng)試管底部；在含有3.5mg/mlGP73單克隆抗體溶液的試管中加入其體積1/20比例的2IT溶液進行活化?；靹?，在室溫下反應(yīng)20分鐘，結(jié)束后利用分子篩層析方式去除溶液中的過量的2IT，得到活化的抗體；
[0067]2)準確量取堿性磷酸酶0.4mg,置于反應(yīng)試管底部；稱取3mg的SMCC用二甲基甲酰胺(DMF)溶解至5mg/ml ;在含有堿性磷酸酶的試管中加入其體積1/20的SMCC溶液，混勻后，室溫下反應(yīng)15分鐘，結(jié)束后利用分子篩層析去除溶液中的過量的SMCC，得到活化的堿性磷酸酶；
[0068]3)將步驟I)得到的活化抗體和步驟2)得到的活化堿性磷酸酶按質(zhì)量比1: 0.8混合，加入6μ I的IM MgCl2溶液,混勻后在2?8°C環(huán)境下反應(yīng)24小時。反應(yīng)結(jié)束后,用分子篩層析的方法純化得到最終抗體酶連接物；
[0069]4)工作液緩沖液的配制:準確稱取 Tris 堿 0.6g, NaCl0.85g, Proclin300 0.lg,添加80g純化水15分鐘混勻后用高濃鹽酸或氫氧化鈉調(diào)整pH = 7.2±0.05，繼續(xù)加入IMMgCl20.35ml, 0.1M ZnCl20.05ml, BSA0.5g，純水定重至 100g，30 分鐘混勻后 0.22 μ m 過濾，即得到工作液緩沖液；
[0070]5)將步驟3)得到的抗體酶連接物，利用步驟4)得到的試劑緩沖液稀釋至
3.0 μ g/ml,即得到堿性磷酸酶標記抗高爾基體蛋白73(GP73)單克隆抗體工作液，簡稱GP73酶標抗體工作液。
[0071]2、化學(xué)發(fā)光底物的配制包括以下步驟:
[0072]I)準確稱取AMPPDlg，Tris24g，NaC1160g，十六烷基三甲基氯化銨0.0255g，加入純化水約900ml，混勻15分鐘，用高濃鹽酸溶液或高濃氫氧化鈉溶液調(diào)整溶液pH值到
9.7±0.05，之后補加純化水定容至1000ml，混勻待用。此發(fā)光底物在2_8°C條件下避光保存，使用前輕輕震蕩混勻，得到化學(xué)發(fā)光底物I。
[0073]2)按照以上步驟，除了將AMPH)替換成等量的APS-5外，底物中其他成份的量和配制方法一致，配制得到化學(xué)發(fā)光底物2。
[0074]3、高爾基體蛋白73(GP73)校準品
[0075]校準品緩沖液制備:準確稱取Tris堿0.6g, NaCl0.85g,海藻糖3g, Proclin300
0.1g,添加80g純化水混勻后，用高濃鹽酸調(diào)整pH = 7.8±0.05，添加BSA6g，混勻后定重至10g,繼續(xù)混勻30分鐘后0.22 μ m過濾。用校準品緩沖液將帶His標簽的GP73全長抗原分別配制成0，10，50，150，500，2000ng/ml，5個濃度點，共6瓶待用。
[0076]4、清洗液的配制
[0077]依次向容器內(nèi)加入Trisl211.4mg，NaC19g，吐溫-20 lg，加入純化水約900ml，混勻至各試劑溶解，用高濃鹽酸溶液或氫氧化鈉溶液調(diào)pH至8.0±0.5，補加純水定容至1000ml，混勻30分鐘，0.22 μ m過濾即得到清洗液。
[0078]實施例4酶促化學(xué)發(fā)光GP73定量檢測試劑盒的組合
[0079]將實施例2制備的各GP73抗原硅基磁珠結(jié)合物工作液分別與實施例3中所制備的試劑盒其余組分，配套組合為試劑盒。詳細組合見下表:
[0080]

【權(quán)利要求】
1.一種高爾基體蛋白73(GP73)抗原硅基磁珠結(jié)合物及其制備方法，其特征在于此結(jié)合物通過硅基磁珠和高爾基體蛋白73(GP73)全長抗原制備而成，其制備包括以下步驟: 1)稱取一定量的娃基磁珠，將娃基磁珠溶于其質(zhì)量(單位:毫克)數(shù)一半毫升數(shù)的70%乙醇中，加入硅基磁珠質(zhì)量(單位:毫克)數(shù)0.5%毫升數(shù)的氨水、加入3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)使其終濃度為15% (V/V)，室溫攪拌反應(yīng)17?18小時，之后用磁板沉淀磁珠，去除上清，用純化水清洗5次，得到表面修飾有一定量氨基的硅基磁珠； 2)將上一步得到的表面修飾有氨基的硅基磁珠溶于其質(zhì)量(單位:毫克)數(shù)一半毫升數(shù)的pH = 8.0±0.05的50mM Tris緩沖液中，加入戊二醛使其濃度為5% (V/V)，室溫震蕩反應(yīng)I小時，之后用磁板沉淀磁珠，去除上清，用純化水清洗5次，得到表面修飾有一定醛基的娃基磁珠； 3)將上一步得到的表面修飾有一定醛基的硅基磁珠用pH= 7.8±0.05的50mM PBS緩沖液清洗3次后，用磁板沉淀磁珠去上清后待用； 4)按每400mg硅基磁珠對應(yīng)Img高爾基體蛋白73(GP73)全長抗原的比例，稱取所需量的GP73全長抗原，溶解于pH = 7.8±0.05的50mM PBS緩沖液制備出濃度為35 μ g/ml的高爾基體蛋白73(GP73)全長抗原溶液，待用； 5)將步驟3)得到的全部表面修飾有醛基的硅基磁珠加入步驟4)的GP73全長抗原溶液中，室溫震蕩混勻3小時，之后用磁板沉淀磁珠，去除上清，繼續(xù)用pH = 7.8±0.05的50mM PBS緩沖液清洗至上清0D280 < 0.0050。再次用磁板沉淀磁珠，去除上清，得到高爾基體蛋白73(GP73)抗原硅基磁珠結(jié)合物。 6)將上一步得到的GP73抗原硅基磁珠結(jié)合物加入一定量的保存緩沖液(pH=7.8±0.05，100mMTris,0.85% NaCl，0.5% BSA，0.1% Proclin300)得到 GP73 抗原硅基磁珠結(jié)合物濃溶液，用于日常保存。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高爾基體蛋白73(GP73)抗原，其特征在于:所述高爾基體蛋白73(GP73)抗原為帶His標簽的高爾基體蛋白73 (GP73)全長抗原。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的硅基磁珠，其特征在于:所述的硅基磁珠是四氧化三鐵經(jīng)過二氧化硅包裹形成的硅基殼層的磁微粒，可以通過外部購買或自制得到。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的自制硅基磁珠，其特征在于，其具體制備方法如下: 1)將含F(xiàn)e3+和Fe2+試劑按2.5:1的摩爾比溶于水中形成混合液，其中Fe3+在混合液中可接受的摩爾濃度范圍為0.03?0.3mol/L，在55°C氮氣保護狀態(tài)下攪拌反應(yīng)2小時，攪拌轉(zhuǎn)速為400?650rpm，并通過濃NaOH溶液調(diào)節(jié)混合液pH為堿性，反應(yīng)得到磁性四氧化三鐵微粒，即磁微粒。 2)將上一步中制備得到的磁性四氧化三鐵顆粒，利用純化水清洗至中性，之后加入其質(zhì)量(單位:毫克)數(shù)一半毫升數(shù)的90%乙醇，繼續(xù)加入磁微粒質(zhì)量(單位:毫克)0.5%毫升數(shù)的氨水，在30°C下攪拌，1kHZ超聲30分鐘后緩慢加入90%乙醇體積0.5%體積的正硅酸乙酯(TEOS)反應(yīng)持續(xù)15-16小時，結(jié)束后之后用磁板沉淀磁珠，去除上清，用純化水清洗5次得到二氧化硅包裹四氧化三鐵的磁性顆粒，即硅基磁珠。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的Fe3+和Fe2+試劑，其特征在于，F(xiàn)e3+試劑是六水氯化鐵、Fe2+試劑是四水氯化亞鐵。
6.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的磁微粒，其特征在于，磁微粒直徑在1-3.5 μ m。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或3或4所述的硅基磁珠，其特征在于，二氧化硅殼層厚度為15_20nmo
8.一種酶促化學(xué)發(fā)光高爾基體蛋白73 (GP73)定量檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括: 1)高爾基體蛋白73(GP73)校準品； 2)堿性磷酸酶標記抗高爾基體蛋白73(GP73)單克隆抗體工作液； 3)高爾基體蛋白73(GP73)抗原硅基磁珠結(jié)合物工作液； 4)清洗液； 5)化學(xué)發(fā)光底物。
9.如權(quán)利要求8所述的試劑盒，其特征在于，所述的高爾基體蛋白73(GP73)抗原硅基磁珠結(jié)合物工作液是用權(quán)利要求1中所述的GP73抗原硅基磁珠結(jié)合物濃溶液加入適量的保存緩沖液(pH = 7.8±0.05，10mM Tris,0.85% NaCl,0.5% BSA,0.1% Proclin300)配制成一定濃度得到的，工作液中磁珠結(jié)合物可接受的濃度范圍為0.5?2mg/ml。
10.如權(quán)利要求8所述的試劑盒，其特征在于，所述清洗液的配制包括以下步驟: 稱取Trisl211.4mg, NaC19g,吐溫-20 lg，加入純化水約900ml，混勻至各試劑溶解，用高濃度鹽酸溶液或高濃度氫氧化鈉溶液調(diào)整溶液PH值到8.0±0.5，補加純化水定容至100ml，混勻30分鐘，過濾后待用。
11.根據(jù)權(quán)利8要求所述的化學(xué)發(fā)光底物的配制包括以下步驟:準確稱取AMPPD (3- (2-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4- (3-磷氧酰)-苯基-1，2- 二氧環(huán)乙烷二鈉鹽)或APS-5 lg，Tris24g，氯化鈉(NaCl) 160g, CTAC 0.0255g，加入純化水約 900ml，混勻 15 分鐘，用高濃鹽酸溶液或高濃氫氧化鈉溶液調(diào)整溶液PH值到9.7±0.05，之后補加純化水定容至1000ml，混勻待用。
12.如權(quán)利要求8所述的試劑盒，其特征在于，所述的GP73校準品的制備過程包括如下步驟: 1)校準品緩沖液制備:準確稱取Tris堿0.6g, NaCl0.85g,海藻糖3g, Proclin300.0.1g,添加80g純化水混勻后，用高濃度鹽酸或氫氧化鈉調(diào)整pH = 7.8±0.05，添加BSA6g，混勻后定重至100g，繼續(xù)混勻30分鐘后0.22 μ m過濾。 2)校準品的配制:在上述緩沖液中加入GP73抗原配制而成。
13.如權(quán)利要求8所述的試劑盒，其特征在于，堿性磷酸酶標記抗高爾基體蛋白.73 (GP73)單克隆抗體工作液的制備包括以下步驟:
1)稱取3mg2IT，用含有 50mM Tris, 0.1M NaCl 和 0.005M EDTA，pH = 8.5±0.05 水溶液溶解至10mg/ml ;準確量取GP73單克隆抗體0.5mg，通過濃縮或定容的方式使溶液中抗體濃度為3.5mg/ml，溶劑使用上述2IT溶液的溶劑，置于反應(yīng)試管底部；在含有3.5mg/ml GP73單克隆抗體溶液的試管中加入其體積1/20比例的2IT溶液進行活化?；靹?，在室溫下反應(yīng)20分鐘，結(jié)束后利用分子篩層析方式去除溶液中的過量的2IT，得到活化的抗體； 2)準確量取堿性磷酸酶0.4mg，置于反應(yīng)試管底部；稱取3mg的SMCC用二甲基甲酰胺(DMF)溶解至5mg/ml ;在含有堿性磷酸酶的試管中加入其體積1/20的SMCC溶液，混勻后，室溫下反應(yīng)15分鐘，結(jié)束后利用分子篩層析去除溶液中的過量的SMCC，得到活化的堿性磷酸酶； 3)將以上步驟中活化的抗體和活化的堿性磷酸酶按質(zhì)量比1: 0.8混合，加入6μ I的IM MgCl2溶液，混勻后在2?8°C環(huán)境下反應(yīng)24小時。反應(yīng)結(jié)束后，用分子篩層析的方法純化得到最終抗體-酶連接物； 4)工作液緩沖液制備:準確稱取Tris堿0.6g，NaCl0.85g,Proclin300 0.lg，添加80g純化水15分鐘混勻后用高濃度鹽酸或氫氧化鈉溶液調(diào)整pH = 7.2±0.05，繼續(xù)加入IMMgCl20.35ml, 0.1M ZnCl20.05ml, BSA0.5g，純水定重至 100g，30 分鐘混勻后 0.22 μ m 過濾，即得到工作液緩沖液； 5)將以上步驟中得到的抗體-酶連接物，利用工作液緩沖液稀釋至抗體-酶連接物濃度為3.0μ g/ml，即得到堿性磷酸酶標記抗高爾基體蛋白73(GP73)單克隆抗體工作液。
【文檔編號】G01N33/68GK104198721SQ201410360560
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年7月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月28日
【發(fā)明者】霍萌萌, 劉向祎, 魯辛辛, 路晟 申請人:北京潤諾思醫(yī)療科技有限公司, 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院, 劉向祎