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基于微流控系統(tǒng)的單細(xì)胞自動(dòng)分析方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種基于微流控芯片的自動(dòng)化單細(xì)胞分析方法，其特征在于：利用熒光標(biāo)記的單細(xì)胞，受激光激發(fā)所發(fā)出的熒光信號(hào)，以觸發(fā)該激光光束在進(jìn)樣光路和檢測光路雙光路間切換的方法，從而實(shí)現(xiàn)一個(gè)激光器在激光閥門與檢測光源兩個(gè)功能間的自動(dòng)轉(zhuǎn)換。激光閥門結(jié)合液壓泵或電動(dòng)泵，控制單細(xì)胞傳輸，從而在微流控芯片上實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞由進(jìn)樣通道向分離通道引入和進(jìn)樣過程的自動(dòng)化。激光由進(jìn)樣光路切換至檢測光路，又可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)單細(xì)胞計(jì)數(shù)或胞內(nèi)組分檢測。
【專利說明】基于微流控系統(tǒng)的單細(xì)胞自動(dòng)分析方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及單細(xì)胞自動(dòng)分析技術(shù)，特別是涉及基于微流控系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞內(nèi)組分自動(dòng)分析及單細(xì)胞自動(dòng)分揀的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]單細(xì)胞分析無論對于疾病的早期診斷和治療還是藥物的設(shè)計(jì)和副作用控制都具有潛在的重要意義。因此研究高效、簡便的單細(xì)胞分析方法和儀器，在臨床實(shí)踐中顯得尤為重要。但是，單細(xì)胞分析通常包括細(xì)胞進(jìn)樣、衍生、溶膜、分離及檢測等多個(gè)步驟，操作較復(fù)雜。尤其對單細(xì)胞進(jìn)樣和溶膜等步驟的操作，不論其在毛細(xì)管電泳還是在微流控芯片上進(jìn)行，都需依靠實(shí)驗(yàn)人員借助顯微鏡利用各種細(xì)胞操控技術(shù)才能完成。微流控芯片的微米級通道網(wǎng)絡(luò)結(jié)合微泵、微閥等裝置在細(xì)胞分析方面具有廣闊的前景。在微流控芯片上研究細(xì)胞，如何對細(xì)胞進(jìn)行操縱使其在微通道內(nèi)任意轉(zhuǎn)移或停留是首先要解決的問題。人們采取了多種微通道液流控制技術(shù)，主要包括液壓、氣壓等機(jī)械力控制，電壓、介電電泳力等電控制，以及光學(xué)陷阱(或激光鑷子)等，或者上述幾種技術(shù)的結(jié)合。盡管微芯片以其網(wǎng)絡(luò)通道結(jié)合微閥、微泵在單細(xì)胞操控方面可以獲得比毛細(xì)管更大的自由度，但仍存在裝置復(fù)雜、手工操作、效率低等問題，不易實(shí)現(xiàn)連續(xù)和自動(dòng)檢測，不易被更多實(shí)驗(yàn)人員所掌握。同時(shí)也影響了微分析系統(tǒng)在單細(xì)胞分析領(lǐng)域的進(jìn)一步發(fā)展。
[0003]經(jīng)過多年發(fā)展，微流控芯片技術(shù)已廣泛用于細(xì)胞研究，實(shí)現(xiàn)了包括細(xì)胞篩選、分離、操控，以及單細(xì)胞培養(yǎng)、單細(xì)胞分析等多種研究，但用于單細(xì)胞自動(dòng)分析的方法和技術(shù)還未見專利和相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種在微流控芯片上進(jìn)行單細(xì)胞分析的自動(dòng)化分析方法，該方法包括在一塊微流控芯片上自動(dòng)實(shí)現(xiàn)試樣引入、單細(xì)胞進(jìn)樣、溶膜、組分分離檢測全過程。以克服在微流控芯片上進(jìn)行單細(xì)胞分析存在的速度慢、手工操作、裝置復(fù)雜、不易被更多實(shí)驗(yàn)人員所掌握等問題。
[0005]本發(fā)明提供的基于雙光路的微流控芯片自動(dòng)化單細(xì)胞分析方法，其特征在于:
單細(xì)胞進(jìn)樣和檢測分別由進(jìn)樣光路和檢測光路完成，即利用熒光標(biāo)記的單細(xì)胞受激光激發(fā)所發(fā)出的熒光信號(hào)觸發(fā)該激光光束在進(jìn)樣光路和檢測光路雙光路間切換的方法，實(shí)現(xiàn)單一激光器在激光閥門與激發(fā)光源兩個(gè)功能間的自動(dòng)轉(zhuǎn)換，見圖1;
利用液壓泵、電動(dòng)泵結(jié)合激光閥門控制單細(xì)胞傳輸?shù)男录夹g(shù)，由計(jì)算機(jī)控制高壓電源，在微流控芯片上實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞由進(jìn)樣通道向分離通道引入和進(jìn)樣過程的自動(dòng)化，見圖2，3 ;利用程控電源結(jié)合芯片網(wǎng)絡(luò)控制單細(xì)胞輸送或單細(xì)胞的溶膜及組分分離過程的自動(dòng)
化；
最終實(shí)現(xiàn)微流控芯片上單細(xì)胞計(jì)數(shù)或單細(xì)胞組分分離檢測全過程的自動(dòng)化，制成適用于單細(xì)胞組分分析的自動(dòng)化微流控分析系統(tǒng)。[0006]本發(fā)明的微流控芯片單細(xì)胞的自動(dòng)分析方法步驟如下:
一個(gè)具有進(jìn)樣光路和檢測光路的雙光路裝置，利用熒光標(biāo)記的單細(xì)胞受激光激發(fā)后發(fā)出的熒光作為控制信號(hào)，使同一激光光源既作為單細(xì)胞進(jìn)樣的光控閥門，又作為被分離組分的激發(fā)光源。具體設(shè)計(jì)方案見圖1，圖中微流控芯片以十字型芯片為例。
[0007]采用懸液稀釋結(jié)合電動(dòng)驅(qū)動(dòng)的細(xì)胞分散方法，也可適量添加羥丙基甲基纖維素(HPMC)，使細(xì)胞分散且不易沉降和聚集。在十字型微流控芯片通道出口處用環(huán)氧樹脂粘合微量移液管頭，作為儲(chǔ)液池。在較短通道即進(jìn)樣通道兩端安裝儲(chǔ)液池S、SW。在較長通道即分離通道兩端安裝B、BW。在儲(chǔ)液池S中加入按一定比例稀釋的細(xì)胞懸液，在儲(chǔ)液池B、SW、BW中加入一定體積的電泳緩沖溶液。在進(jìn)樣通道(S-SW)施加一組較高電壓，在分離通道(B-BW)施加一組夾流電壓，使細(xì)胞成單行間隔一定距離以一定流速成單行通過進(jìn)樣通道(S-SW)，見圖 2。
[0008]進(jìn)行單細(xì)胞分析之前，首先要將單細(xì)胞從進(jìn)樣通道(S-SW)引入分離通道(B-BW)，即實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞自動(dòng)進(jìn)樣，本發(fā)明利用進(jìn)樣光路實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞自動(dòng)進(jìn)樣，具體做法是，光源
(101)發(fā)出的光束沿OX軸穿過光路轉(zhuǎn)換盤(102)上的圓孔，經(jīng)平面反射鏡(103~105)反射至顯微鏡物鏡(106)，在通道交叉點(diǎn)聚焦成直徑10-20 μ m的光斑(圖1)，當(dāng)被熒光物質(zhì)標(biāo)記的某個(gè)單個(gè)細(xì)胞經(jīng)過激光斑點(diǎn)(圖2)，發(fā)出熒光，熒光和激光經(jīng)聚光透鏡(107)匯聚到達(dá)半透半反鏡(108)，在此，激光透過(108)，而熒光被反射至平面反射鏡(109)，然后，熒光被反射至凹面反射鏡(110)，將熒光平行反射至針孔(117)，熒光經(jīng)過針孔(117)過濾并透過長波通濾光片(118)，最終到達(dá)光電倍增管(119)，檢測器將此單細(xì)胞信號(hào)送至數(shù)據(jù)處理單元(2)(圖1)，由數(shù)據(jù)處理單元(2)控制多通道高壓直流電源(4)，改變通道兩端電壓差，使該單細(xì)胞運(yùn)輸方向改變，即由S-SW變?yōu)锽-BW，從而實(shí)現(xiàn)光控閥門作用，完成單細(xì)胞進(jìn)自動(dòng)進(jìn)樣(圖3);為避免細(xì)胞成團(tuán)經(jīng)過影響單細(xì)胞進(jìn)樣，通過編制峰值程序由數(shù)據(jù)處理單元(2)判斷信號(hào)大小，從而剔除過大信號(hào)，因此不會(huì)對成團(tuán)細(xì)胞進(jìn)行響應(yīng)，避免出現(xiàn)多個(gè)細(xì)胞進(jìn)入分離通道的情況。
[0009]完成單細(xì)胞進(jìn)樣的同時(shí)，數(shù)據(jù)處理單元(2)控制伺服電機(jī)(3)轉(zhuǎn)動(dòng)光路轉(zhuǎn)換盤
(102),改變激光傳輸方向，即將激光切換至檢測光路。光束經(jīng)平面反射鏡(111，112)反射至顯微鏡物鏡(113)，在分離通道末端聚焦成直徑10-20 μ m的光斑，用作激光誘導(dǎo)熒光檢測。熒光和激光經(jīng)聚光透鏡(114)匯聚到達(dá)半透半反鏡(115)，在此，激光透過半透半反鏡(115)，而熒光被反射至平面反射鏡(116)，之后，熒光被反射至凹面反射鏡(110)，被平行反射至針孔(117)，熒光經(jīng)過針孔(117)過濾并透過長波通濾光片(118)，最終到達(dá)光電倍增管(119)，檢測器將此單 細(xì)胞信號(hào)送至數(shù)據(jù)處理單元(2)(圖1)，并輸出結(jié)果(圖4)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0010]圖1為本發(fā)明微流控自動(dòng)分析系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)圖1:雙光路光學(xué)單元101:激光光源102:光路轉(zhuǎn)換盤
103~105，109，111 ~112，116:平面反射鏡
106、113:顯微鏡物鏡 107、114:聚光透鏡108、115:半透半反鏡
110:凹面反射鏡117:針孔118:長波通濾光片
119:光電倍增管120:樣品臺(tái)2:數(shù)據(jù)處理單元3:伺服電機(jī)4:直流高壓電源
圖2為單細(xì)胞自動(dòng)進(jìn)樣示意圖 圖3為單細(xì)胞檢測示意圖
圖4為連續(xù)自動(dòng)采集5個(gè)單細(xì)胞在進(jìn)樣點(diǎn)和檢測點(diǎn)熒光信號(hào)。
【具體實(shí)施方式】
[0011]以下結(jié)合實(shí)施例和附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但不應(yīng)以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0012]參見圖1，采用一種用于單細(xì)胞自動(dòng)分析的雙光路裝置，此裝置包括雙光路光學(xué)單元、數(shù)據(jù)采集單元、微流控電源、光路控制單元。其中:雙光路光學(xué)單元中的光電倍增管(119)的輸出端與數(shù)據(jù)采集單元中的放大電路(2)連接；數(shù)據(jù)采集單元中的模數(shù)轉(zhuǎn)換器(3)通過RS232接口與數(shù)據(jù)處理單元(4)連接；數(shù)據(jù)處理單元(4)的輸出經(jīng)RS232接口與直流高壓電源(5)連接；數(shù)據(jù)處理單元(4)的輸出經(jīng)RS232接口與光路控制單元的數(shù)模轉(zhuǎn)換器
(6)連接，控制伺服電機(jī)(7)驅(qū)動(dòng)光路轉(zhuǎn)換盤(102)。
[0013]微流控芯片置于樣品臺(tái)(120)，開啟儀器，微調(diào)樣品臺(tái)，激光光斑在微通道內(nèi)精確聚焦。 [0014]細(xì)胞經(jīng)熒光染料染色，調(diào)節(jié)細(xì)胞懸液濃度至0.5~2X IO5 cells/ml。細(xì)胞懸液注入樣品池S，緩沖溶液注入S、SW、BW，調(diào)節(jié)液面高度，使細(xì)胞從S流向SW，參見圖2。當(dāng)單細(xì)胞流經(jīng)位于通道交叉點(diǎn)的激光光斑，被激發(fā)發(fā)出熒光。此熒光信號(hào)經(jīng)進(jìn)樣光路被光電倍增管(119 )采集，經(jīng)模數(shù)轉(zhuǎn)換送至數(shù)據(jù)處理單元(2 )。
[0015]數(shù)據(jù)處理單元(2)接收并處理信號(hào)后，同時(shí)發(fā)出兩個(gè)指令。一方面控制伺服電機(jī)
(3)轉(zhuǎn)動(dòng)光路轉(zhuǎn)換盤(102)，改變激光傳輸方向，將激光切換至檢測光路，激光光斑聚焦于分離通道末端，用作后續(xù)的檢測(細(xì)胞計(jì)數(shù)、胞內(nèi)組分檢測等)。另一方面控制高壓電源(4)，輸出一組電壓，分離通道+150 V~+1500 V，進(jìn)樣通道+70 V~+700 V，推動(dòng)細(xì)胞由B流向BW。至此，實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞自動(dòng)進(jìn)樣，參見圖3。利用計(jì)算機(jī)程序判斷因細(xì)胞成團(tuán)引起的過大信號(hào)并自動(dòng)剔除，從而保證單細(xì)胞進(jìn)樣。
[0016]單細(xì)胞進(jìn)入分離通道到達(dá)末端檢測點(diǎn)，經(jīng)過激光光斑發(fā)出熒光信號(hào)。熒光信號(hào)經(jīng)檢測光路到達(dá)光電倍增管(119)，經(jīng)模數(shù)轉(zhuǎn)換送至數(shù)據(jù)處理單元(2)并輸出結(jié)果。至此，實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞自動(dòng)檢測，參見圖4。圖4為在通道交叉點(diǎn)以及分離通道末端連續(xù)測定的5個(gè)單細(xì)胞(未溶膜)熒光信號(hào)峰，每組峰為同一個(gè)細(xì)胞的進(jìn)樣信號(hào)(左)和未溶膜情況下在分離通道末端的檢測信號(hào)(右)。全部過程由儀器自動(dòng)完成。從圖4可以看出，同一個(gè)細(xì)胞在前后兩個(gè)位置的信號(hào)大小有差異，有兩個(gè)原因:一是激光在兩個(gè)位置的聚焦有偏差；二是細(xì)胞經(jīng)過分離通道的過程有可能發(fā)生緩慢溶膜，造成前后差異。
[0017]本裝置也適用于單細(xì)胞組分自動(dòng)分析。調(diào)節(jié)高壓電源并在B中加入溶膜試劑，可使單細(xì)胞迅速溶膜，從而自動(dòng)完成單細(xì)胞進(jìn)樣、溶膜、分離、檢測全過程。
【權(quán)利要求】
1.一種基于雙光路的微流控芯片自動(dòng)化單細(xì)胞分析方法，包括下列步驟: O細(xì)胞懸液加入到樣品池中； 2)單細(xì)胞進(jìn)樣:利用雙光路中的進(jìn)樣光路將單細(xì)胞從進(jìn)樣通道(S-SW)引入分離通道(B-Bff)； 3)檢測:完成單細(xì)胞進(jìn)樣的同時(shí)，數(shù)據(jù)處理單元(2)控制高壓電源(4)推動(dòng)細(xì)胞由儲(chǔ)液池B流向儲(chǔ)液池BW ;同時(shí)，數(shù)據(jù)處理單元(2)控制伺服電機(jī)(3)轉(zhuǎn)動(dòng)光路轉(zhuǎn)換盤(102)，改變激光傳輸方向，即將激光由進(jìn)樣光路切換至檢測光路；光束經(jīng)平面反射鏡(111，112)反射至顯微鏡物鏡(113)，在分離通道末端聚焦成直徑10-20 μ m的光斑，用作激光誘導(dǎo)熒光檢測；熒光和激光經(jīng)聚光透鏡(114)匯聚到達(dá)半透半反鏡(115)，在此，激光透過半透半反鏡(115)，而熒光被反射至平面反射鏡(116)，之后，熒光被反射至凹面反射鏡(110)，被平行反射至針孔(117)，熒光經(jīng)過針孔(117)過濾并透過長波通濾光片(118)，最終到達(dá)光電倍增管(I 19)； 4)輸出結(jié)果:檢測器將此 單細(xì)胞信號(hào)送至數(shù)據(jù)處理單元(2)，并輸出結(jié)果。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微流控芯片自動(dòng)化單細(xì)胞分析方法，其特征是，步驟I)中，細(xì)胞懸液用微量移液器、注射器或微量注射泵加入到樣品池中。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微流控芯片自動(dòng)化單細(xì)胞分析方法，其特征是，步驟I)中所述的細(xì)胞懸液濃度0.5^2X IO5 cells/ml，加入到微流控芯片上樣品池S中。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微流控芯片自動(dòng)化單細(xì)胞分析方法，其特征是，步驟2)中利用液壓泵、電動(dòng)泵結(jié)合進(jìn)樣光路控制單細(xì)胞傳輸方法，在儲(chǔ)液池B、SW、Bff中加入一定體積的電泳緩沖溶液，保持液面高度S>B=BW>SW ;或在進(jìn)樣通道(S-SW)施加一組較高電壓(+100疒+200 V)，在分離通道(B-BW)施加一組夾流電壓(+50疒+100 V)，使細(xì)胞成單行間隔一定距離(0.5^5 mm)以一定流速(0.05~0.5 mm/s)成單行通過進(jìn)樣通道(S-SW)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微流控芯片自動(dòng)化單細(xì)胞分析方法，其特征是，步驟2)中所述的單細(xì)胞自動(dòng)進(jìn)樣，具體做法是，光源(101)發(fā)出的光束沿OX軸穿過光路轉(zhuǎn)換盤(102)上的圓孔，經(jīng)平面反射鏡(103~105)反射至顯微鏡物鏡(106)，在通道交叉點(diǎn)聚焦成直徑10-20 μ m的光斑，當(dāng)被熒光物質(zhì)標(biāo)記的某個(gè)單個(gè)細(xì)胞經(jīng)過激光斑點(diǎn)，發(fā)出熒光，熒光和激光經(jīng)聚光透鏡(107)匯聚到達(dá)半透半反鏡(108)，在此，激光透過(108)，而熒光被反射至平面反射鏡(109)，然后，熒光被反射至凹面反射鏡(110)，將熒光平行反射至針孔(117)，熒光經(jīng)過針孔(117)過濾并透過長波通濾光片(118)，最終到達(dá)光電倍增管(119)，檢測器將此單細(xì)胞信號(hào)送至數(shù)據(jù)處理單元(2)，由數(shù)據(jù)處理單元(2)控制多通道高壓直流電源(4)，改變通道兩端電壓差，使該單細(xì)胞運(yùn)輸方向改變，即由S-SW變?yōu)锽-BW，完成單細(xì)胞進(jìn)自動(dòng)進(jìn)樣。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微流控芯片自動(dòng)化單細(xì)胞分析方法，其特征是，步驟2)所述的雙光路包括進(jìn)樣光路和檢測光路。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微流控芯片自動(dòng)化單細(xì)胞分析方法，其特征是，步驟2)所述的進(jìn)樣光路將激光光斑聚焦于芯片通道交叉點(diǎn)，在此激發(fā)經(jīng)過的細(xì)胞并產(chǎn)生熒光。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微流控芯片自動(dòng)化單細(xì)胞分析方法，其特征是，步驟2)所述的進(jìn)樣光路產(chǎn)生的熒光信號(hào)由所述的數(shù)據(jù)處理單元(2)處理。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微流控芯片自動(dòng)化單細(xì)胞分析方法，其特征是，步驟3)所述的數(shù)據(jù)處理單元控制伺服電機(jī)(3)轉(zhuǎn)動(dòng)光路轉(zhuǎn)換盤(102)，改變激光傳輸方向，將激光切換至檢測光路。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微流控芯片自動(dòng)化單細(xì)胞分析方法，其特征是，步驟3)所述的數(shù)據(jù)處理單元(2)控制高壓電源(4)輸出一組電壓，分離通道+150 V~+1500 V，進(jìn)樣通道+70 V~+700 V，推動(dòng)細(xì)胞由B流向BW。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微流控芯片自動(dòng)化單細(xì)胞分析方法，其特征是，步驟3)所述的檢測光路將激光光斑聚焦于芯片分離通道末端，在此激發(fā)經(jīng)過的細(xì)胞或細(xì)胞組分并產(chǎn)生熒光。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微流控芯片自動(dòng)化單細(xì)胞分析方法，其特征是，步驟4)所述的檢測光路產(chǎn)生的熒光信號(hào)由所述的數(shù)據(jù)處理單元(2)處理并輸出結(jié)果。
【文檔編號(hào)】G01N15/14GK103926190SQ201410192110
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年5月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月8日
【發(fā)明者】劉彧, 班青, 高健 申請人:齊魯工業(yè)大學(xué)